Isolamento e trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE)

Biology

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Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs). J. Vis. Exp. (2), e157, doi:10.3791/157 (2007).

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Abstract

Protocol

Totale preparazione del midollo osseo

  1. Quattro B6 topi sono sacrificati e sezionato per ottenere tibie, femori, dell'anca e della colonna vertebrale.
  2. Durante la dissezione, le membra e le ossa sono conservate in PBS 2% di FCS inattivato (opzionale 2mM EDA - medio dissezione).
  3. Le ossa pulite sono schiacciato con mortaio e pestello in media dissezione. Un modo efficace per farlo è quello di schiacciare tibie, femori e fianchi di ogni mouse, quindi 2 spine alla volta.
  4. La miscela di cellule ottenute da ogni mouse viene tenuto separato e filtrata attraverso un filtro 40μm in un tubo da 50 ml falco. In questo modo, ogni tubo contiene la miscela di cellule ottenute da tutte le ossa delle gambe di un topo, e la metà della miscela ottenuta da 2 spine. In questa fase, il filtro viene utilizzato per separare i residui delle ossa.
  5. Di solito è consigliabile schiacciare le ossa delle gambe due volte per ottenere bianco (senza midollo osseo) frammenti ossei, ed i frammenti della colonna 2 o 3 volte.
  6. Riempire i tubi per farli equilibrata, e spin 1200rpm 5 min.
  7. Aspirare il supernatante e sciogliere il pellet trascinando i tubi sul rack tubo (questo passaggio è importante dopo ogni centrifugazione per ridurre al minimo la formazione di gruppo e la perdita di cellule). Risospendere ogni tubo in 1 ml di PBS 2% FCS (NO EDTA d'ora in poi), se si sta facendo esaurimento lignaggio, o in qualunque altro volume è conveniente per voi.

Lineage esaurimento

  1. Questa procedura consente di eliminare le cellule altamente differenziate e di ottenere una popolazione molto eterogenea di cellule, arricchito di cellule staminali e progenitrici. Se siete ordinamento HSC, questo passaggio di ridurre drasticamente il numero di cellule che devono passare attraverso la separazione delle cellule, riducendo così il tempo di ordinamento e che consente di tipo HSC da un maggior numero di topi, in modo che si può ottenere un maggior numero di HSC in un singolo ordinamento.
  2. Se avete intenzione di ordinare poi, togliere 50μl di miscela cella (di solito prendere un po 'da ogni tubo) per l'ordinamento controlli (senza macchia e SCA1, c-kit, CD48, Flk2 controlli singolo colore).
  3. Aggiungi 30ml/tube cocktail Lin. Cocktail di lignaggio contiene una varietà di anticorpi, che cambia, purtroppo, un po 'da un laboratorio all'altro. Nel laboratorio Scadden, usiamo gli anticorpi contro biotinilated Gr1, Ter119, CD4, CD8, CD3, B220. Loro diluizione finale la colorazione è 1:700.
  4. Vortex rapidamente per mescolare, e incubare per 15 minuti a 4 ° C.
  5. Durante l'incubazione, preparare le colonne i magneti e tubi 15ml eluizione sotto le colonne. Degas alcuni PBS utilizzando un filtro steriflip (dovreste vedere bollicine d'aria in movimento verso la superficie della causa di aspirazione a vuoto PBS), ed equilibrare le colonne mediante l'applicazione di 3 ml degasato PBS a ciascuna colonna.
  6. Il flusso della colonna è di circa 1ml/5min, così ci vogliono circa 15 minuti per avere le colonne pronto all'uso.
  7. Al termine della incubazione, aggiungere PBS 2% FCS per riempire i tubi e spin down per 5 min a 1200rpm.
  8. Aspirare il surnatante, allentare il pellet e risospendere in 1 ml / tubo degassificato PBS.
  9. Se siete ordinamento successivamente, estrarre il midollo osseo totale Lineage ctrl singolo colore colorazione (15 ml, un po 'da ogni tubo).
  10. Aggiungi streptavidina 30ml/tube perline, vortice di mescolare velocemente, e incubare per 15 minuti a 4 ° C.
  11. Al termine della incubazione, aggiungere 2 ml / tubo di degassificato PBS. Mettere provette di nuovo sotto le colonne, e applicare ogni sospensione a una colonna, filtrando attraverso un filtro 40μm.
  12. Aggiungere altri 3 ml di PBS degasato a ciascuna provetta per lavarla. Una volta che le colonne sono vuote, si applica di nuovo con lo stesso filtro 40μm.
  13. L'eluato contiene la miscela di cellule impoverito lignaggio, una popolazione eterogenea arricchito di staminali e cellule progenitrici. Piscina il contenuto dei 4 tubi in 2 tubi. Spin per 5 minuti a 1500rpm.
  14. Aspirare il surnatante. Il pellet deve essere bianco o prevalentemente bianco. Allentare il pellet e risospendere insieme in 1ml PBS totale del 2% FCS se siete ordinamento più tardi, altrimenti risospendere in qualsiasi volume è conveniente per voi.

LKS o lungo termine ordinamento HSC

  1. Estrarre lignaggio impoverito colorazione ctrl singolo colore (15 ml). Questo vi permetterà di valutare l'efficienza del vostro esaurimento lignaggio.
  2. La miscela di cellule per ordinare è macchiato nel tubo 15ml.

Aggiungi anticorpi:

Sca PE-Cy5.5 1: 100 10ml
Kit APC 1:100 10ml
SA PE-Cy7 1:500 2ml

Per ordinare HSC lungo termine, anche aggiungere:

CD48 FITC 1:1000 1 ml
Flk2 PE 1:200 5ml

Inoltre, preparare colorazione singolo controlli utilizzando il midollo osseo totale tenuto da parte dopo la dissezione e il totale del midollo osseo colorate lignaggio. Queste colorazioni può essere fatto direttamente in tubi di FACS.

Assicurarsi di essere al buio!

  1. Vortex rapidamente per mescolare e incubare a 4 ° C per 20 a 30 minuti, rimescolamento a metà.
  2. Per lavare via l'eccesso di anticorpi, riempire i tubi con PBS 2% FCS e spin per 5 min a 1500 giri al minuto.
  3. Rimuovere il surnatante, risospendere tutti i pellet e spostarli in nuovi tubi FACS con tappi filtro. Si potrebbe prendere un po 'per le cellule di passare attraverso questi filtri, ed è importante applicare un po' più PBS dopo per lavare il filtro e ridurre al minimo la perdita di cellule. Questo passaggio è necessario per evitare l'intasamento del selezionatore, che è il peggior incubo di ogni utente cell sorter.
  4. Al momento della consegna il tuo celle per l'impianto di separazione delle cellule, assicuratevi di preparare anche una provetta con PBS 10% HI FCS dove le cellule verranno raccolti.
  5. Se siete l'ordinamento delle cellule LKS, si ottiene una popolazione eterogenea che contiene a lungo termine e di breve termine ripopolamento progenitori HSC e multipotenti. Una resa media è di 300.000 LKS da 4 topi.
  6. Se avete usato anche CD48 e Flk2 anticorpi, è possibile separare ciascuna popolazione di HSC lungo termine, HSC a breve termine e MPP. LT-HSC sono la popolazione più rare. Una resa media è di circa 50.000 a 60.000 celle da 4 topi.

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Comments

9 Comments

  1. Hi, Thankyou for the wondeful post. I was working with endothelial progenitor cells and wanted to know how many of the bone marrow cells are Sca-1 positive. Also is it possible that we can extract the BMC and then store them at -²0 and stain them for FACS the next day? Any help will be greatly appreciated. Thanks 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 31, 2008 - 1:45 PM
  2. You can sort on the following day, but you should keep the cells at 4C, better in an ice bucket in the fridge. Many cells die upon freezing

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:25 AM
  3. Can you please tell me where you purchased your streptavidin beads? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 2, 2008 - 12:33 PM
  4. miltenyi

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 AM
  5. How do you isolate muscle tissue from spin bone? And if without specific step to isolate muscle tissue, would the results of FACS be different? BTW. How do you deleption RBC form those bone marrows? Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 23, 2008 - 4:20 AM
  6. you need to use a scalpel and much patience. LEaving muchmuscle around the spine makes it harder to crush and will reduce your yield.   RBC are depleted while lineage depleting. The post-column pellet is white. I do no recommend a separate RBC lysis because there is the risk it will damage other cells also.Moreover, it is hard to perform it consistently.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:29 AM
  7. How many HSCs do you inject into the irradiated recipients?

    Reply
    Posted by: Wilma J.
    August 20, 2010 - 11:39 AM
  8. Hi,
    My name is shahid chaudhary and I am working on EAE mice. The only problem i am facing with the experiment is the intravenous injection of genetically modifed HSC into the tail of the mice. I have used lamps but its not helping me out and because of this I am feeling very underestimated while doing the expperiment. Can anyone suggest me some good tips regarding the intravenous tail vein injection. That will be very much grateful.

    Reply
    Posted by: Shahid C.
    December 5, 2012 - 10:30 AM
  9. Hi,
    My name is shahid chaudhary and I am working on EAE mice. The only problem i am facing with the experiment is the intravenous injection of genetically modifed HSC into the tail of the mice. I have used lamps but its not helping me out and because of this I am feeling very underestimated while doing the expperiment. Can anyone suggest me some good tips regarding the intravenous tail vein injection. That will be very much grateful.

    Reply
    Posted by: Shahid C.
    December 5, 2012 - 10:30 AM

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