İzolasyon ve Hematopoetik Kök Hücre Transplantasyonu (HKH'lerin)

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lo Celso, C., Scadden, D. Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs). J. Vis. Exp. (2), e157, doi:10.3791/157 (2007).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

Toplam kemik iliği hazırlık

  1. Dört B6 fareler kurban ve tibiaları, femur, kalça ve omurga elde etmek için disseke.
  2. Diseksiyonlar sırasında, bacaklarda ve kemiklerin PBS% 2 FCS ısı inaktive tutulur (isteğe bağlı 2mm EDA - diseksiyonu orta).
  3. Temiz kemikleri diseksiyonu orta havanda ezilir. Bunu yapmak için etkili bir yolu, bir süre sonra her fare tibiaları, femur ve kalça, 2 dikenler ezmek için.
  4. Her fare elde edilen hücre karışımı ayrı tutulur ve 50ml şahin tüpe 40μm filtre süzülür. Bu şekilde, her tüp, bir fare ve 2 dikenler elde edilen karışımın yarısı tüm bacak kemiklerinin elde edilen hücre karışımı içerir. Bu aşamada, filtre kemik enkaz ayırmak için kullanılır.
  5. Bacak kemiklerinin ezmek için iki kez (kemik iliği olmadan) kemik parçaları beyaz elde etmek için genellikle tavsiye edilir, ve omurga parçaları 2 veya 3 kez.
  6. Onları dengeli olması tüpler doldurun ve 5 dakika 1200rpm dönmeye.
  7. Süpernatantı aspire ve tüpler tüp raf (bu adım tutam oluşumu ve hücre kaybını en aza indirmek için her santrifüj sonra önemli) sürükleyerek pelet gevşetin. Her tüpe 1 ml PBS% 2 FCS (artık NO EDTA), soy tükenmesi yapıyorsun süspanse edin, ya da başka hacmi ne olursa olsun sizin için uygun.

Lineage tükenmesi

  1. Bu prosedür, son derece farklılaşmış hücrelerin ortadan kaldırmak ve bir hücre çok heterojen bir nüfus elde, kök ve progenitör hücreler için zenginleştirilmiş sağlar. HSC sıralama ise, bu adım büyük ölçüde, bu nedenle sıralama süresini azaltmak ve böylece daha yüksek bir sayı elde farelerin daha yüksek bir sayı HSC dışarı sıralamak için izin hücre sıralama üzerinden gitmek zorunda hücrelerinin sayısını azaltır HSC tek bir sıralama.
  2. (Boyasız ve SCA-1, c-Kit, CD48, Flk2 tek renk kontrolleri) sıralama kontrolleri için hücre karışımı (Ben genellikle her tüpten biraz) daha sonra sıralamak için gidiyoruz, 50μl çıkarın.
  3. Lin kokteyl 30ml/tube ekleyin. Lineage kokteyl laboratuvardan laboratuvara ne yazık ki küçük değişiklikler çeşitli antikorlar içerir. Scadden laboratuvarda, B220 biotinilated Gr1 karşı antikorlar Ter119, CD4, CD8, CD3, kullanın. Boyama Onların son seyreltme 1:700.
  4. Vorteks hızlı karıştırın ve 4 az 15 dakika boyunca inkübe ° C
  5. İnkübasyon sırasında, sütunların altında mıknatıslar ve 15ml elüsyon tüpler sütunları hazırlar. Degas bazı PBS steriflip filtre (vakum aspirasyon nedeniyle PBS yüzeyine doğru hareket eden küçük hava kabarcıkları görmelisiniz) kullanarak ve her sütun 3ml gazlar PBS uygulayarak sütunlar dengelenmesi.
  6. Sütun akış 1ml/5min hakkında, bu nedenle kullanıma hazır sütunların yaklaşık 15 dakika sürer.
  7. Inkübasyon sonunda tüplerin doldurulması ve 1200rpm az 5 dakika boyunca aşağı döndürmek için PBS% 2 FCS ekleyin.
  8. Süpernatantı aspire pelet gevşetin ve 1 ml / tüp PBS gazlar tekrar süspansiyon haline getirin.
  9. (15ml, her tüp bir bit), daha sonra sıralama tek renk boyama ctrl Lineage toplam kemik iliği çıkarmak.
  10. Streptavidin boncuk hızlı 30ml/tube, girdap karıştırın ve 15 dakika boyunca inkübe 4 ° C
  11. Inkübasyon sonunda, 2 ml / tüp gazlar PBS ekleyin. Sütunların altında yeni toplama tüpleri koyun ve 40μm bir filtre ile filtreleme, bir sütun her süspansiyon uygulamak.
  12. Yıkamak için her tüp gazlar PBS başka bir 3 ml ekleyin. Sütunlar boş sonra yine aynı 40μm filtre kullanılarak uygulanır.
  13. Eluat soyu tükenmiş hücre karışımı, kök ve progenitörlerin hücrelerin zenginleştirilmiş heterojen bir nüfus içerir. 2 tüp içine 4 tüplerin içerik Havuzu. 1500rpm az 5 dakika boyunca dönerler.
  14. Süpernatant aspire. Pelet beyaz ya da ağırlıklı olarak beyaz olmalıdır. Daha sonra sıralama pelet gevşetin ve onları bir araya tekrar süspansiyon PBS% 2 FCS 1ml toplam hacmi ne olursa olsun sizin için uygun, aksi takdirde tekrar süspansiyon haline getirin.

LKS ya da uzun vadeli HSC sıralama

  1. Tükenmiş tek renk boyama ctrl (15ml) soyundan dışarı atın. Bu soy tükenmesi verimliliğini değerlendirmek için izin verecektir.
  2. 15ml tüp sıralamak için hücre karışımı lekeli.

Antikorlar ekle:

Sca PE-Cy5.5 1: 100 10ml
Kit APC 1:100 10ml
SA PE-Cy7 1:500 2ml

Uzun vadeli HSC sıralamak için, aynı zamanda ekleyin:

CD48 FITC 1:1000 1ml
Flk2 PE 1:200 5ml

Ayrıca, tek boyama, diseksiyonu ve total kemik iliği soy boyandı sonra bir kenara tutulan toplam kemik iliği kullanılarak kontrol hazırlamak. Bu renklendirmeler FACS tüpler doğrudan yapılabilir.

Karanlık olmak için emin olun!

  1. Vorteks 4 ° C 20 ila 30 dakika, yeniden karıştırma yarım yoluyla hızlı bir şekilde karıştırın ve inkübe için.
  2. Antikor aşırı yıkamak için, 1500 rpm'de 5 dakika süreyle PBS% 2 FCS ve spin tüpleri doldurmak.
  3. Süpernatantı pelet tekrar süspansiyon ve filtre kapakları ile yeni FACS tüpler taşıyabilirsiniz. Bu filtreleri geçmek hücreleri elde etmek için bir süre alabilir ve filtre yıkayın ve hücre kaybını en aza indirmek için daha sonra PBS biraz daha uygulamak için önemlidir. Bu adım sıralayıcı tıkanmasını önlemek için gerekli olan her hücre sıralayıcı kullanıcı en kötü kabus.
  4. Hücreleri hücre sıralama tesisine teslim zaman, hücreler alınır PBS% 10 HI FCS ile de bir tüp hazırlamak için emin olun.
  5. LKS hücreleri sıralama iseniz, uzun vadeli ve kısa vadeli HSC ve multipotent atalarıdır repopulating içeren heterojen bir nüfus elde edecektir. 4 farelerden alınan ortalama verim 300.000 LKS.
  6. Ayrıca CD48 ve Flk2 antikorları varsa, her nüfus, uzun vadeli HSC, kısa vadeli HSC ve MPP ayırabilirsiniz. LT-HSC en nadir nüfus. 4 farelerden alınan ortalama verim yaklaşık 50.000 ila 60.000 hücreleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

9 Comments

  1. Hi, Thankyou for the wondeful post. I was working with endothelial progenitor cells and wanted to know how many of the bone marrow cells are Sca-1 positive. Also is it possible that we can extract the BMC and then store them at -²0 and stain them for FACS the next day? Any help will be greatly appreciated. Thanks 

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 31, 2008 - 1:45 PM
  2. You can sort on the following day, but you should keep the cells at 4C, better in an ice bucket in the fridge. Many cells die upon freezing

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:25 AM
  3. Can you please tell me where you purchased your streptavidin beads? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 2, 2008 - 12:33 PM
  4. miltenyi

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:27 AM
  5. How do you isolate muscle tissue from spin bone? And if without specific step to isolate muscle tissue, would the results of FACS be different? BTW. How do you deleption RBC form those bone marrows? Thanks.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 23, 2008 - 4:20 AM
  6. you need to use a scalpel and much patience. LEaving muchmuscle around the spine makes it harder to crush and will reduce your yield.   RBC are depleted while lineage depleting. The post-column pellet is white. I do no recommend a separate RBC lysis because there is the risk it will damage other cells also.Moreover, it is hard to perform it consistently.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 17, 2009 - 10:29 AM
  7. How many HSCs do you inject into the irradiated recipients?

    Reply
    Posted by: Wilma J.
    August 20, 2010 - 11:39 AM
  8. Hi,
    My name is shahid chaudhary and I am working on EAE mice. The only problem i am facing with the experiment is the intravenous injection of genetically modifed HSC into the tail of the mice. I have used lamps but its not helping me out and because of this I am feeling very underestimated while doing the expperiment. Can anyone suggest me some good tips regarding the intravenous tail vein injection. That will be very much grateful.

    Reply
    Posted by: Shahid C.
    December 5, 2012 - 10:30 AM
  9. Hi,
    My name is shahid chaudhary and I am working on EAE mice. The only problem i am facing with the experiment is the intravenous injection of genetically modifed HSC into the tail of the mice. I have used lamps but its not helping me out and because of this I am feeling very underestimated while doing the expperiment. Can anyone suggest me some good tips regarding the intravenous tail vein injection. That will be very much grateful.

    Reply
    Posted by: Shahid C.
    December 5, 2012 - 10:30 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics