Niet-invasieve In Vivo Small Animal MRI en MRS: Basic experimentele procedures

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Dit werk beschrijft elementaire procedures van niet-invasieve kleine dieren MRI en MRS

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, D., Marcinek, D. Noninvasive In Vivo Small Animal MRI and MRS: Basic Experimental Procedures. J. Vis. Exp. (32), e1592, doi:10.3791/1592 (2009).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kleine dieren Magnetische Resonantie (MR) onderzoek is naar voren gekomen als een belangrijk onderdeel van de moderne biomedische onderzoek als gevolg van de niet-invasieve karakter en de rijkdom van biologische informatie die zij biedt. MR vereist geen ioniserende straling en kan niet-invasief bieden een hogere resolutie en een betere signaal-ruis verhouding in vergelijking met andere tomografische of spectroscopische modaliteiten. In dit protocol zullen we ons richten op kleine dieren MRI en MR spectroscopie (MRI / MRS) naar niet-invasief te verwerven ontspanning gewogen

Protocol

Deel 1: Magnet Safety

Zowel de MRI en MRS gebruik van een sterk magnetisch veld dat uiterste voorzichtigheid vereist. Bijvoorbeeld, de 4.7 T-instrument dat we gebruikt voor het huidige werk heeft een magnetisch veld ongeveer 90.000 keer de aarde magnetisch veld. De hoge magnetische veld is altijd op, zelfs wanneer de MR scanner niet wordt gebruikt. Een metalen voorwerp dat in contact komt met een dergelijk hoog magnetisch veld zal zich krachtig en snel worden aangetrokken door de magneet. Het is extreem gevaarlijk als een proefpersoon of operator is gelegen in het projectiel weg van een metalen voorwerp vliegen in de magneet. Daarom moet het personeel die de leiding hebben MR experimenten voorzichtig met metalen voorwerpen te verwijderen uit hun kleding voordat de nabijheid van het instrument en ook de omgeving vrij is van dergelijke objecten te handhaven. Meer gedetailleerde informatie over magneet veiligheid verschijnt in de literatuur 1 en de volgende webpagina: http://www.imrser.org/ . De aanwezigheid van metaalachtig materiaal kan niet alleen leiden tot de eerder genoemde veiligheid in het geding, maar interfereren met experimentele resultaten door het induceren van imaging / spectroscopische artefacten. Het metaalachtig materiaal aanwezig in de buurt of in de imaging-object kan veranderen het magnetisch veld in de buurt en zo het genereren van artefacten op verworven beelden of te verbreden line-breedte van de spectra.

Daarom, laat portemonnee, sleutels, pennen, etc. buiten de magneet als je dieren handvat voor MR procedures.

Deel 2: In vivo MRI van de muis in een horizontale boring Magneet

Dier Voorbereiding voor MRI

  1. Al het dier procedures moeten worden goedgekeurd door de institutionele zorg en het gebruik dier commissie (IACUC) voorafgaand aan het uitvoeren van een soort dieren omgaan.
  2. We maken gebruik van verdampt isofluraan om dieren te verdoven voor de MRI-experimenten. Verdoving van de dieren kan worden bereikt door andere anesthetica, zoals Avertin (2,2,2-tribroomethanol of TBE) en een cocktail van ketamine en xylazine. Dosering informatie van elke narcose is te vinden in tabel 1.
  3. Lijn een inductie kamer met geplastificeerd absorberend wondkussen (blauw pad of chuck). Plaats een muis (of meerdere muizen voor multi-muis imaging) in de inductie kamer.
  4. Stel de flowmeter van de isofluraan vaporizer 1,5 tot 0,8 L / min. Dan is de isofluraan vaporizer aan te passen aan 4% voor ongeveer 2 3 minuten.
  5. Na het bereiken van de chirurgische vlak van anesthesie (dwz geen teen knijpen respons), plaats de muis op een dier houder met zijn neus ingebracht in een neus (of masker). Een hoofd weerhouder kan gebruikt worden voor het hoofd beeldvorming en een lichaam houder kan worden gebruikt voor het lichaam beeldvorming.
  6. Animal houders worden gebruikt om mogelijke beweging te voorkomen: er zijn verschillende soorten commerciële houders. Ook kan een speciaal ontworpen houder worden vervaardigd op een speciale eisen van een experimentele opstelling tegemoet te komen. Voor een speciaal ontworpen houder, zorg ervoor dat alleen niet-magnetisch materiaal te gebruiken.
  7. Tijdens de beeldvorming periode, stelt u de flowmeter tot 0,4 0,8 ml / min en vermindering van de isofluraan vaporizer tot 1,2 1,5%. De vervallen gas afkomstig uit de muis neus kegel wordt verzameld door een pomp en afgevoerd naar een in-house vacuüm.
  8. De ogen van het dier zal worden vochtig gehouden met een steriele oog smeren zalf. Het dier zal worden gehouden op 35-37 ° C gedurende het experiment in een warm water circulatie systeem. Andere soorten van de warmte bron kan worden gebruikt, zoals verwarmde pads en warme lucht geblazen in de radiofrequente (RF) spoel.
  9. Een dier monitoringsysteem is ingevoerd om de lichaamstemperatuur, ademhaling / hartcyclus monitor, en de ademhaling / hart gating synchroniseren met beeld acquisities.
  10. Een standaard voorbeeld gemaakt van agarose is naast het dier geplaatst om het signaal abrupte veranderingen op te volgen. Deze standaard agar monster is met name handig voor multi-slice en multi-tijdstip beeldvorming. Wanneer er een onverwachte verandering signaal wordt gedetecteerd in een plakje van de verkregen beelden, kan het segment met de onverwachte signaal verandering worden weggenomen. Ook kan het signaal intensiteiten te worden aangepast op basis van het signaal veranderen van de standaard monster tijdens post-beeldanalyse.
  11. Na het goed plaatsen van het dier en de controle componenten op de houder van dieren, plaatst u de houder van dieren in het midden van een RF-spoel.
  12. Verplaats de RF-spoel om de magneet kamer en steek de RF-spoel in het warme water circulatie systeem geplaatst in de magneet. Figuur 2 toont verschillende componenten van een MRI-scanner Gezien vanaf de voorzijde van de magneet boring.

MRI Experiment

  1. Stem de RF-spoel om de 1 H resonantie frequentie en overeenkomen met de karakteristieke impedantie van de spoel van 50 Ohm met behulp van de tuning paneel in de MR-scanner. Dit is het bereiken van optimale omstandigheden van de signaalontvangst. De meeste menselijke MRI-scanners vereisen geen afzonderlijk proces van afstemmen / wedstrijd, behalvein MRS procedures.
  2. Voer een shimming proces met behulp van een enkele puls sequentie. Een MR-signaal is afhankelijk van het milieu magnetisch veld homogeniteit. De shimming proces maakt het magnetisch veld in de regio van belang zijn voor een zo homogeen mogelijk te maken. Elk MR-scanner heeft zijn eigen manier om het shimming proces, inclusief automatische snelle shimming processen zoals snelle kaart en gradient shimming uit te voeren.
  3. Optimaliseren van de RF-puls door het maximaliseren van een dimensionaal beeld profiel. RF puls bevoegdheden kunnen worden geschaard terwijl de constante puls lengte en een lang genoeg TR (recyclen vertraging), dat is ongeveer 3 - 5x de T 1 van weefsel.
  4. Acquire scout beelden langs de drie orthogonale richtingen te axiale, coronale en sagittale beelden te creëren. Een snelle beeldacquisitie sequentie (dwz gradiënt echo of een snelle spin echo imaging volgorde) kan worden gebruikt om de scout beelden te verwerven. De verworven afbeeldingen worden gebruikt om plannen voor de daadwerkelijke beeldvorming met de bepaling van beeldvorming vliegtuigen.
  5. Ga naar echo volgorde draaien. Selecteer de juiste volgorde parameters: TR (recycle delay) moet worden drie tot vijf keer het weefsel T een volledig ontspannen beelden zoals proton density of T 2 gewogen beelden te verwerven. TE (echo tijd) is de tijdsduur tussen de eerste RF-puls en het centrum van echo signaal. Een TE waarde kan worden geselecteerd afhankelijk van het beeldcontrast, zoals samengevat in tabel 2. Figuur 2 toont in vivo beelden die met verschillende relaxatie effecten van T 1, T 2 en T 2 * voor een naakt muis met een xenograft tumor op zijn rug.
  6. T 2 metingen kunnen worden gedaan, hetzij met behulp van multiecho imaging of enkele echo imaging met meerdere TE waarden.
  7. Na de MRI / MRS in vivo experiment, moeten de dieren worden gecontroleerd gedurende het herstelproces. Na de MRI, zullen de dieren worden genomen van de RF-spoel en gecontroleerd om een ​​volledig herstel te verzekeren toen terug naar de kooi. Warmteverlies is snel in verdoofde muizen. Houd de dieren warm door ze te bedekken met een gaasje pads of handdoeken en / of het verstrekken van een warmtebron tot de dieren hersteld van anesthesie.

Image Processing

  1. Onderzoek verkregen beelden op de MR-console en overdracht geselecteerde gegevens naar een post-processing computer.
  2. Wij gebruiken meestal de ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) voor het analyseren van beelden. Het beeld analyse omvat image scaling / filtering, berekeningen van T 1, T 2 en diffusie, tumorvolume metingen en segmentatie van tumoren.

Deel 3. In vivo MRS voor Mouse achterbeen skeletspieren bij een verticale Boring Magneet

Bouw van Manchet voor het opwekken van reversibele ischemie

  1. Begin met een stuk pvc-pijp die ongeveer 5-7 mm breed met een id van 12-15 mm. Boor een klein gat door de wand van dit stuk en draad.
  2. Knip een stuk ballon dus het is open op beide uiteinden (helium ballonnen kwaliteit werken het best). Plaats dit stuk door de PVC-stuk en wikkel terug rond en tape eindigt samen op de buitenmuur van de PVC-stuk.
  3. Gebruik krimpfolie om de ballon te verzegelen eindigt rond de buis. Moet u een manchet met een stevige buitenwand en een opblaasbare binnenwand.
  4. Knip een oppervlakte van krimpfolie en ballon rond de schroefdraad gat, en zorg ervoor dat genoeg materiaal laten tussen het gat en de rand van de PVC-stuk. Schroefdraad een 1,5 cm stukje van non-ferro metalen (dat wil zeggen messing) in het gat in de PVC. Hiermee kun je opblazen van de manchet. Afdichting het gebied met 5 minuten epoxy.
  5. Dit oplossen manchet op zijn plaats naast de RF-spoel in het MRS sonde en aansluiten op een extern sfygmomanometer.

Op maat Ademhaling Monitor

  1. We maken gebruik van een op maat gemaakte ademhaling monitor die is gemaakt om compatibel te zijn met de beperkte ruimte en de toegang tot de boring van de magneet. Verschillende commerciële modellen zijn ook beschikbaar.
  2. Das een klein ballonnetje aan het einde van stretch bestendige slangen ingevoerd in de sonde.
  3. Bevestig het andere uiteinde van de slang aan op een drukopnemer.
  4. Zorg ervoor dat de lijn en de ballon zijn vrij van luchtbellen. De belletjes zal verzwakken het signaal van compressie van de ballon wordt veroorzaakt door beweging van de muis lichaam als gevolg van de ademhaling.

Muis Positionering in MRS Probe

  1. Verdoven van de muis met 5% Avertin (0,010 ml / g lichaamsgewicht).
  2. Na het bereiken van de chirurgische vlak van anesthesie, plaatst u de muis in de MRS sonde door het plaatsen van de muis op zijn rug op de muis ondersteuning. Plaats de met vloeistof gevulde ballon aan de ventrale zijde van de muis en veilig in plaats met muis ondersteuning bandjes.
  3. Plaats de muis en het lichaam te ondersteunen in het MRS-sonde.
  4. Trek een achterbeen door de ischemische manchet en MRS spoel. Het been moet in het midden van de spoel als much mogelijk te maken. Deze regeling kan de muis lichaam horizontaal worden geplaatst in een verticale boring magneet (figuur 3).
  5. Fix been in plaats van tape te voet naar stijve steun.
  6. Subcutaan plaats thermokoppel in achterbeen buiten de regio bemonsterd door de spoel.
  7. Bevochtig de ogen met het oog smerende zalf voor de ogen te voorkomen drogen. Cover muis ogen en het gezicht te wrijven of irritatie te voorkomen dat de wand van de sonde.
  8. Andere meet-sondes kunnen worden toegevoegd, afhankelijk van de specifieke behoeften van het experiment.

Het opzetten van MRS Experiment

  1. Sluit de luchtstroom naar verwarmingselement op de MRS sonde.
  2. Stel de instelbare temperatuur-eenheid op VNMR software om been temperatuur op 35-37 ° C.
  3. Tune spoel frequentie en impedantie overeenkomen met het gebruik van de tuning paneel in de MRS software voor zowel een H-en P-31 resonanties.
  4. Stel shimming circuits naar de homogeniteit van de B1 magnetisch veld te optimaliseren in de regio van belang met behulp van een H-spectroscopie.
  5. Schakel over naar 31 P de frequentie van de RF-puls breedte te bepalen maximum signaal van een gratis inductie verval (FID) (90 ° tijd) opleveren.
  6. Verzamel een hoge signaal-ruis volledig te ontspannen spectra (FRS) om de ratio's van anorganisch fosfaat (P i) en creatinefosfaat (PCR) te bepalen om ATP onder volledig ontspannen omstandigheden. Deze spectra worden verzameld met behulp van de 90 ° tijd met de tijd tussen de FID acquisities (TR) van ongeveer 5x de T 1 van de PCR (20 sec. Op 7 T). Deze zullen worden gebruikt voor de kwantificering van PCR en P i niveaus van MR spectra.

Ischemische Experiment

  1. Een eenvoudige ischemische verstoring kan voor de bepaling van de rust en de maximale mitochondriale ATP productie door het meten van veranderingen in de creatinefosfaat tijdens en onmiddellijk na ischemie.
  2. Set-up matrix om meerdere spectra te verzamelen met behulp van een 45 ° puls breedte (dat wil zeggen 0,5 x de 90 ° tijd) en een TR van 0,5 x de T 1 (~ 1.5 sec.). We meestal verzamelen 4 FID voor elke spectra (aantal gemiddeld (na) = 4 in VNMR software) voor een tijd resolutie van ongeveer 6 seconden. Deze keer resolutie is voldoende nauwkeurig te bepalen rust en maximale mitochondriale ATP productie.
  3. Verzamel rusten spectra voor ongeveer 5 minuten.
  4. Veroorzaken ischemie door het opblazen van de manchet 270-300 mmHg voor 10-12 minuten.
  5. Laat de manchet en het verzamelen van herstel spectra gedurende 5 minuten.
  6. Verwijder de voeler magneet en de muis van de sonde. Laat de muis om van anesthesie terug onder de juiste omstandigheden. Experimenten kunnen worden herhaald op de volgende dagen. Na de laatste spectroscopie experiment muis beenspieren zijn verwijderd en onmiddellijk te bevriezen-geklemd in vloeibare N 2 voor de analyse van ATP concentraties door HPLC.

Data Analysis

  1. Gegevens worden geanalyseerd met behulp van offline een van de verschillende spectrale analyse programma's voor NMR-spectra. Ons laboratorium gebruikt doorgaans past de standaard 2 en jMRUI (http://www.mrui.uab.es/mrui/mrui_Overview.shtml) voor het kwantificeren van de piekoppervlakken.
  2. Eerste PCr afbraak prijzen tijdens ischemie is een maat voor de mitochondriale ATP-productie onder normoxische voorwaarden als beschreven in verschillende kranten 3-5. PCr recovery rates kan worden gebruikt om de maximale capaciteit voor de mitochondriale ATP productie op basis van de aanpak te bepalen eerder beschreven 4,6.

Figuur 1
Figuur 1. In vivo MRI setup gezien vanaf de voorkant van de magneet boring. De setup bestaat uit een RF-spoel, dier warming-systeem (of warm water circulatie systeem) en gradiënt te voegen. Al deze componenten zijn ingevoegd in een horizontale magneet. Warm water wordt verwarmd in een water reservoir buiten de magneet kamer en geïntroduceerd in het dier warming-systeem via een Tygon slang (groene band). Na circuleren in de cilinder, is het water getrokken uit de warming-systeem terug naar het water reservoir te verwarmen. Een isofluraan buis en vacuümbuis worden gebruikt om muizen verdoven tijdens MRI experimenten.

Figuur 2
Figuur 2 In vivo afbeeldingen voor een naakt muis met xenograft tumor (D282 tumor) op zijn rug (pijl) met verschillende ontspanning effecten:. A. T een afgewogen beeld (TR / TE = 500/14.2ms). B. T 2 afgewogen beeld (TR / TE = 2s/40ms). Zowel de T 1 en T 2 gewogen beelden werden overgenomen door spin-echo sequentie. C. T 2 kaart verwerkt met 4 sets van beelden verkregen door DIFschillende TE-waarden variërend van 20 tot 80 ms. D. T 2 * gewogen beeld (TR / TE = 180/7.39ms, flip hoek = 20 graden) overgenomen door gradiënt echo sequentie. Gezichtsveld van 35 x 35 mm 2 is voor alle MR-beelden.

Figuur 3
Figuur 3. Illustratie van de muis geplaatst in horizontale lichaam houder met been vastgezet in RF spoel.

Figuur 4
Figuur 4. In vivo 31 P spectra via een ischemie-reperfusie cyclus. De gegevens werden verzameld op een 7 T verticale boring magneet en lijn uitgebreid met een 20 Hz exponentiële filter. TR = 1, na = 4, iedere 20 spectra worden uitgezet.

Tabel 1. De dosering van verdoving voor muizen MRI / MRS.

Dier
Soorten
Verdovingsmiddel
Agent
Dosis
(Mg / kg voor injectables)
Route
Muis Isofluraan gas 4,0% voor 2-3 min (inductie), dan 1,2 tot 1,5% continu (onderhoud) Ingeademd via de neus kegel
Muis Avertin 5%, 10ml/kg lichaamsgewicht intraperitoneale (IP)
Muis Ketamine / Xylazine 100 mg / kg en 10 mg / kg IP


Tabel 2. Afbeelding met ontspanning wegingen

Afbeelding Weging TR (recyclen vertraging) TE (echo tijd)
T1 Kort (korter dan T1) Kort (korter dan T2)
T2 Lange (3 ~ 5 keer T1) Lange (rond T2)
PD (proton density) Lange (3 ~ 5 keer T1) Kort (korter dan T2)

T1: spin-rooster relaxatietijd (of longitudinale relaxatietijd) tijd
T2: spin-spin relaxatietijd (of dwarse ontspanning) tijd

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De pre-overname stappen van stemmen / wedstrijd en shimming zijn cruciaal voor een hoge ruimtelijke resolutie en een hoge signaal-ruisverhouding (SNR) te verwerven. Het is ook belangrijk om conditie van het dier monitor met een dier monitoringsysteem om een ​​stabiele fysiologische status te behouden voor de dieren tijdens het signaal overnames te voldoen aan de dieren op humane wijze hanteren en om mogelijke artefactuele metingen te voorkomen. De procedures beschreven in het protocol kan worden aangepast om aanvullende informatie met inbegrip van verspreiding, perfusie en flow beeldvorming en spectroscopie gelokaliseerd in vivo te verwerven. Al het dier voorbereidingen dienen te worden, tenzij er een gelijkaardige procedure vereist een aanvullende setup. De protocollen van de MRI en MRS beschreven in deze studie zijn gebruikt voor diverse toepassingen, waaronder longitudinaal MRI-studies voor de ontwikkeling van nanosondes om tumoren 7 en MRS studies doelwit voor mitochondriële ATP productie 5,8. MRI en MRS zijn nuttige technieken om niet-invasief te visualiseren dier anatomische, ontspanning te veranderen of om niet-destructief te controleren metabolisme. Beide technieken kunnen gebruikt worden als longitudinale procedures voor toezicht op bovengenoemde wijzigingen te onderzoeken in de tijd. Voor MRS bouwden we een aangepaste RF sonde die het mogelijk maakt het dier te worden gehandhaafd in de horizontale positie in een verticale boring magneet. Zo kunnen deze experimenten worden uitgevoerd op elke verticale brede boring magneet, zoals is te vinden in de meeste chemie-afdelingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Dit onderzoek werd mede ondersteund door NIH / NIBIB R21EB008166 te DL en NIA AG028455 en NIA AG022385 voor DJM. Wij danken dr. James Olson op het Fred Hutchinson Cancer Research Center voor het leveren van hun D282 tumor muizen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inova 200 MR scanner/4.7 T Varian Inc., Agilent Used for mouse MRI
Inova 300 NMR spectrometer/7 T Varian Inc., Agilent Used for MRS of mouse skeletal muscle

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stecco, A., Saponaro, A., Carriero, A. Patient safety issues in magnetic resonance imaging: state of the art. Radiol Med. 112, 491-491 (2007).
  2. Heineman, F. W., Eng, J., Berkowitz, B. A., Balaban, R. S. NMR spectral analysis of kinetic data using natural lineshapes. Magn Reson Med. 13, 490-490 (1990).
  3. Amara, C. E. Mitochondrial function in vivo: spectroscopy provides window on cellular energetics. Methods. 46, 312-312 (2008).
  4. Blei, M. L., Conley, K. E., Kushmerick, M. J. Separate measures of ATP utilization and recovery in human skeletal muscle. J Physiol. 465, 203-203 (1993).
  5. Marcinek, D. J., Schenkman, K. A., Ciesielski, W. A., Conley, K. E. Mitochondrial coupling in vivo in mouse skeletal muscle. Am J Physiol Cell Physiol. 286, C457-C457 (2004).
  6. Paganini, A. T., Foley, J. M., Meyer, R. A. Linear dependence of muscle phosphocreatine kinetics on oxidative capacity. Am J Physiol. 272, 501-501 (1997).
  7. Sun, C. In vivo MRI detection of gliomas by chlorotoxin-conjugated superparamagnetic nanoprobes. Small. 4, 495-495 (2008).
  8. Marcinek, D. J. Reduced mitochondrial coupling in vivo alters cellular energetics in aged mouse skeletal muscle. J Physiol. 569, 467-467 (2005).

Comments

2 Comments

  1. can i take the image from mice with conventional head or knee coil?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 18, 2010 - 3:09 PM
  2. You could acquire images from a small animal with a human head or knee coil. But the signal-to-noise ratios of the acquired images will be substantially lower than those in the images shown in the video. You will need a smaller RF coil that is in the similar dimensions of the animal body to increase the filling factor which is linearly proportional to the signal-to-noise ratio. Hope this will help. Please let me know if you have a further question.
    Best,
    Donghoon Lee

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 18, 2010 - 4:10 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics