다공성 매체에서 미생물 교통 유학에 대한 간단한 Microfluidic 시스템 : 미생물의 창

Biology

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Summary

Microfluidic 장치는 실시간으로 적절한 물리적인 비늘에서 복잡한 자연의 프로세스를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 표면 하의에 박테리아의 성장과 교통 수단을 공부하고 자연 다공성 매체의 주요 기능을 모방한 것이었 간단한 microfluidic 장치를 개발했습니다.

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Markov, D. A., Samson, P. C., Schaffer, D. K., Dhummakupt, A., Wikswo, J. P., Shor, L. M. Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media. J. Vis. Exp. (39), e1741, doi:10.3791/1741 (2010).

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Abstract

다공성 매체에서 미생물의 성장과 교통 지하수 및 표면 물, 환경에서 영양분의 재활용뿐만 아니라, 직접에 대한 식수 공급에 병원균의 전송 품질에 대한 중요한 의미를했습니다. 자연 다공성 매체는 복잡한 물리적 토폴로지, 다양한 표면 화학, 영양분과 전자 acceptors 동적 그라디언트, 그리고 미생물의 곳곳에 분포로 구성되어 있습니다. 이러한 기능은 해석하기 어려운 미생물 교통 매크로 규모의 조사의 결과를 만들어 마이크론의 길이 규모 이상의 대폭 다양하고, 기계론의 모델의 검증 도전. 여기 간단한 microfluidic 장치, 마이크로 구조 서식지와 미생물 상호 작용을 시각화하기 위해 관찰된 현상에 영향을 미치는 핵심 프로세스를 파악하고, 체계적으로 예측 모델의 유효성을 검사하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다. 간단하고 사용하기 쉬운 흐름 세포는 투명, biocompatible와 산소 투과 재료 - 폴리 (디메틸 실록산) 밖으로 건설되었다. 석판술의 표준 방식은 마이크로 구조 마스터하기 위해 사용되었으며, 복제 성형은 주인의 마이크로 구조 흐름 세포를 캐스팅하는 데 사용되었다. 흐름 세포 챔버의 물리적 디자인은 실험 요구에 적용할 수 있습니다 microchannels은 단순 선형 연결에서 복잡한에 따라 다를 수있는 것은 2 μm의 한 작은 기능 크기 토폴로지. 우리 모듈형 EcoChip 흐름 전지 어레이는 중력 중심의 흐름 모듈에 의해 동일 챔버 및 흐름 제어 수십 있습니다. 우리는 표면 화학, 유체 성질 또는 미생물 인구의 특성의 영향을 조사하는 동안 EcoChip 장치의 사용을 통해, 신체 구조 및 압력 머리가 지속적으로 개최하거나 체계적으로 다양한 수있다는 것을 보여준다. 비 병원성를 사용하여 전송 실험을 통해 녹색 형광 단백질 표현

Protocol

I. Microfluidic 장치 제작

  1. microfluidic 장치를 만드는 첫 번째 단계는 컴퓨터를 통한 도면 (CAD) 프로그램에서 장치의 2 차원 레이아웃을 그릴 것입니다. 우리는 AutoCAD를 사용했지만 다른 드로잉 프로그램은 CleWin 등도 사용할 수 있습니다, 또는 CorelDraw.
  2. 다음 단계는 photolithographic 마스크를 조작하는 것입니다. 장치 크기에 따라 해상도와 예산을 요구,이 마스크는 사진 필름에서 만든 크롬 (최고 해상도, 높은 비용)에서 가공 또는 고해상도 프린터를 사용하여 오버헤드 투명에 직접 인쇄 수 있습니다. 여기서 우리는 사전 Reproductions 주식 회사, 노스 앤도버, MA에 의해 제조 피크 마스크를 사용했습니다.
  3. 다음 단계는 제기된 - 구제 금형을 만들 수 감광성의 에폭시로 마스크의 패턴을 전송하는 것입니다.
    1. 첫째, 부정적인 SU8 포토 레지스트의 레이어는 원하는 두께로 실리콘 웨이퍼에 냈지, 그리고 초과 용매를 휘발로 구운 것입니다. 포토 레지스트 제제 및 회전 속도가 침전 층의 두께를 제어합니다.
    2. 그런 다음 패턴은 마스크를 통해 자외선의 미리 정해진 복용량에 노출됩니다. 게시 노출 베이킹 크로스 링크들을 불용성 렌더링 포토 레지스트 코팅의 가벼운 노출 영역을.
    3. 다음은 unexposed 저항 개발 단계, 긍정적인 인상 - 구호 구조 마스터라는 떠나, 화학 개발자와 제거입니다.
    4. 세 번째 빵을 단계는 경 베이킹 단계 더 구조를 수정하는 옵션입니다했다.
  4. PDMS 성형
    1. 우리는 microfluidic 장치 1 복제 성형을위한 실리콘 탄성체 폴리 (디메틸 실록산)를 사용합니다. 첫째, 기본 재료는 같은 배양 접시 같은 얕은 용기에 금형 위에 부어 경화 에이전트와 10시 1분 무게 비율의 혼합, 그리고 보이는 거품이 사라지기 전에 진공 하에서 degassed입니다.
    2. uncured PDMS와 함께 마스터는 다음 65 적어도 4h에 대해 신중하게 파괴 오븐에 배치됩니다 ° C를위한 가교 발생하는 폴리머의.
    3. PDMS가 확정되면 성형 부분 페트리 접시 밖으로 절단합니다. 구멍이 완성 장치에 microfluidic 공간에 액세스하는 장치의 최고를 부수고있다.
  5. 유리 첨부 파일
    1. 클린 PDMS는 irreversibly 산소 플라즈마에 노출하여 유리를 청소 보세 있습니다. 첫째, 성형 및 천공 PDMS와 깨끗한 유리 슬라이드는 플라즈마 클리너로 결합 표면을 배치하고 있습니다. 우리는 PDC - 32G Harrick 플라즈마 클리너를 사용했습니다.
    2. 챔버가 폐쇄되면 연산자는 무선 주파수 또는 RF 소스 다음 진공 펌프 켜집합니다. 플라즈마 자기 챔버에서 약간 보라색 발광에 의해 입증, 약실에 점화됩니다.
    3. 30 초 동안 플라즈마에 노출된 후, RF 소스 다음 진공 펌프가 해제됩니다.
    4. 신속, 유리 슬라이드와 PDMS 장치는 챔버에서 제거와 직접 접촉 (다운 성형 PDMS 표면 쪽)으로 이동됩니다. 이것은 돌이킬 수 본드를 형성하며, 또한 표면 특성은 친수성하겠습니다.
    5. 원하는 경우, 다른 표면 화학은 흡착 또는 결합 공유 결합에 의해 표면에 단백질의 고정을 통해 PDMS로 형성될 수 있습니다.
    6. 장치는 다음 탈이온수, 성장 미디어, 또는 모세관 세력이나 주사기로 부드러운 압력을 사용하여 인공 지하수와 같은 액체로 가득 수 있습니다.

II. 중량 분석에 의해 Microfluidic 장치의 흐름 부량

  1. 장치의 압력 중심의 흐름을 보정하기 위해, 마이크로 구조 흐름 세포가 처음 DI 워터와 함께 미리되었습니다.
  2. 이러한 플라스틱 주사기 또는 흐름 모듈로 액체가 들어있는 저수지는 (그림 1 참조) 잘 상류 유입구에 연결하고, 저수지에서 유체의 높이가 잘 하류에있는 높이 이상 유지됩니다.
  3. 샘플은 일정한 간격으로 잘 폐기물의 수집 분석 균형에 무게입니다.
  4. 총 시간 대 총 볼륨을 세우고있는 곡선의 기울기는 평균 판매량 유량 (그림 2)를 제공합니다. 우리는 압력 헤드의 광범위한 및 다른 압력 유지 시스템에 대한 재현성, 선형 평균 판매율을 발견했습니다.

III. 흐름 시각화, 속도 매핑하고, 소수성 / 친수성 ​​상호 작용

  1. 모델 보정을위한, 모두 카르복시 YG 및 일반 YG 표면에서 3 μm의 형광 라텍스 비즈는 Polysciences 주식 회사에서 인수되었으며 0.01 % 고체의 농도에 DI의 물에 희석되었다.
  2. 서식지를 통해 흐르는 구슬은 Mightex BCE - B013 - U 흑백 카메라가 장착되어 자이스 혈구 Axiovert 25 형광 현미경에 시각되었습니다.
  3. 개별 프레임은 연거푸 캡처 ImageJ 소프트웨어 패키지 (그림 3)와 영화로 조립되었다.

IV. 박테리아 성장과 수송 모델링을위한 Microfluidic 장치 (EcoChip)

  1. 비브리오 SP. GFP 칸, 비 병원성 녹색 형광 단백질 표현의 생물은 약 10 9 셀 / ML의 농도 Luria - Bertani 매체에서 14 시간 동안 성장했다.
  2. 성장 매체의 박테리아는 EcoChip 장치에 도입 장치를 이식하고 19 시간 하루 flocs과 영화를 설립 허용되었습니다.
  3. 다음 성장 미디어는 우물에서 제거되었으며 서식지의 모든 박테리아의 다른 밀도가 서로 다른 서식지에 남아 있다고 있도록 (ASW의 제조법을 왕 외 2.을 참조하시기 바랍니다) 인공 해수로 플러시했습니다.
  4. 느린 흐름 조건 3 다른 서식지에서 유지하는 동안 하나의 서식지가, 아니 흐름과 함께 봉인 보관했다.
  5. 세균성 성장의 형광등과 흰색 광선이 사진은 몇 일 (그림 4)의 기간 동안 매 15-20시간을 촬영했다.

V. 대표 결과

흐름 모듈은 여러 개의 서식지를 통해 흐름을 규제하고 배포에 대한 간단한 방법을 제공합니다. 중량 분석은 서식지와 입력 및 출력 우물 사이의 압력 차이의 유압 저항에 따라 서식지 구조를 통해 흐름 속도를 결정하기 위해 쉽고 간단 방법이었다. 비드 흐름 실험을 위해 우리는 uncarboxylated 비즈 (그림 2)에 대한 장치의 표면에 훨씬 더 큰 비드 축적을 관찰했습니다. 또한, 큰 직경 비즈, 6, 10 음, 훨씬 더 작은 구멍 구멍에 개입되고 장치에 축적하기 시작 가능성이 있었다. 빠른 흐름 속도는 입자의 유지 및 유입을 감소.

박테리아 성장 실험 동안, 유동 조건의 영향을 분명 분명하다. 연속 전단 병력 함께 집계에 세균 및 양식 flocs를 발생하고, 개별 세포로 찾을 수 없습니다. 대형 세균성 flocs의 교통은 매크로 시스템에서 공부하는 것은 매우 어려운 중요한 환경 과정입니다.

그림 1
그림 1. 도식 보여주는 기능과 흐름 모듈의 작동.

그림 2
그림 2. 다른 열 높이에 대한 중량 분석에 의해 결정 등 구조적인 서식지를 통해 유량. 열 높이 비율 : 40분의 60 = 1.5, 결정 유량 비율 : 1.04 / 0.71 = 1.46. H = 40mm에 대한 결과 유량이 V입니다 = 0.71 μL / 분 및 H에 대한 = 60mm가 V입니다 = 1.04 μ의 L / 분. 예상 평균 선형 판매율은 각각 3.1 mm / s와 4.6 mm / s의 수 있습니다.

그림 3
그림 3.와 카르복 실화는 구조 서식지를 통해 흐르는 않고 3um 라텍스 구슬의 교통.

그림 4
그림 4. 박테리아 성장 속도가 느린 흐름의 존재에 종자 밀도의 함수로 biofilm 형성에 변경합니다.

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Discussion

EcoChip 시스템은 개별 실험의 요구에 적응합니다. 새 주인은 비교적 쉽게 만들 수 있으며, 마스터가 조작된되면 필요에 따라 추가로 정확하게 복제 장치 캐스트하실 수 있습니다. 흐름 모듈은 사용이 간단 특별한 장비 또는 복잡한 연결을 필요로하지 않으며, 간단한 변수위 압력 기반의 플로우 시스템으로 모델링 될 수 있습니다. 이 작품은 추가 확장 지속하고 있으며, humic 산성 코팅 채널을 생성하고, 체계적으로 흐르는 유체의 수성 화학 변화가 있습니다. 이 방법을 사용하여 다공성 매체의 표면 및 성장 및 수송 현상과 박테리아의 마이크로 규모의 상호 작용을 직접 관찰하고 체계적으로 조사 수 있습니다.

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Acknowledgments

이 연구는 통합 Biosystems 연구 및 교육 (VIIBRE)에 대한 밴더빌트 연구소 국립 과학 재단 (National Science Foundation),에서와 써얼 시스템 생물학 및 생물 학부 연구 체험 (써얼 SyBBURE)에 의해 부여 # 0,649,883에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Dow Corning
SU8-2025 MicroChem Corp.
Fluorescent Beads Polysciences, Inc.

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References

  1. Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  2. Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. Mobility of protozoa through narrow channels. Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).

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