Fenster an einem Microworld: Einfache mikrofluidische Systeme für Studium Mikrobielle Transport in porösen Medien

Biology

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Summary

Mikrofluidik-Geräte lassen sich komplexe natürliche Prozesse in Echtzeit und auf der entsprechenden physikalischen Maßstäben zu visualisieren. Wir haben ein einfaches Mikrofluidiksystem, dass wichtige Funktionen des natürlichen porösen Medien nachahmt für das Studium Wachstum und Transport von Bakterien im Untergrund entwickelt.

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Markov, D. A., Samson, P. C., Schaffer, D. K., Dhummakupt, A., Wikswo, J. P., Shor, L. M. Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media. J. Vis. Exp. (39), e1741, doi:10.3791/1741 (2010).

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Abstract

Das mikrobielle Wachstum und Transport in porösen Medien haben wichtige Implikationen für die Qualität des Grundwassers und des Oberflächenwassers, das Recycling von Nährstoffen in die Umwelt, als auch direkt für die Übertragung von Krankheitserregern auf die Trinkwasserversorgung. Natürliche porösen Medien ist von einem komplizierten physikalischen Topologie, abwechslungsreiche Oberflächenchemie, dynamische Verläufe von Nährstoffen und Elektronenakzeptoren und eine lückenhafte Verteilung der Mikroben zusammen. Diese Merkmale unterscheiden sich im wesentlichen über eine Längenskala von Mikrometern, so dass die Ergebnisse der Makro-Ebene Untersuchungen der mikrobiellen Transport schwierig zu interpretieren, und die Validierung von mechanistischen Modellen Herausforderung. Hier zeigen wir, wie einfach mikrofluidischen Bauteilen verwendet werden, um mikrobielle Interaktionen mit mikrostrukturierten Lebensräume zu visualisieren, um wichtige Prozesse beeinflussen die beobachteten Phänomene zu erkennen und systematisch zu überprüfen Vorhersagemodelle werden. Einfache, leicht zu bedienende flow-Zellen wurden aus dem transparenten, biokompatiblen und Sauerstoff-durchlässigen Material Poly (dimethylsiloxan) konstruiert. Standard-Methoden der Photolithographie wurden eingesetzt, um mikrostrukturierte Meister zu machen, und Replikat wurde benutzt, um mikro-flow-Zellen von den Meistern gegossen. Die physikalischen Design der Messzelle Kammer ist anpassungsfähig an die experimentellen Voraussetzungen: Mikrokanäle kann von einfachen linearen Verbindungen zu komplexen variieren Topologien mit Strukturgrößen von nur 2 um. Unsere modularen EcoChip flow cell array verfügt über Dutzende von identischen Kammern und Flow Control durch eine Schwerkraft-Flow-Modul. Wir zeigen, dass durch den Einsatz von EcoChip Geräte, physikalische Strukturen und Förderhöhen konstant gehalten werden kann oder variiert systematisch während der Einfluss der Oberflächenchemie, Fluid-Eigenschaften oder den Eigenschaften der mikrobiellen Population untersucht. Durch Transport Experimente mit einem nicht-pathogenen, grün fluoreszierendes Protein-exprimierenden

Protocol

I. Mikrofluidikvorrichtung Fabrication

  1. Der erste Schritt beim Erstellen eines mikrofluidischen Gerät ist mit einer zweidimensionalen Anordnung der Geräte in ein computergestütztes Zeichnen (CAD)-Programm zu ziehen. Wir haben AutoCAD verwendet, aber auch andere Zeichenprogramme sind ebenfalls erhältlich, wie CleWin oder CorelDraw.
  2. Der nächste Schritt ist es, eine photolithographische Maske herzustellen. Je nach Gerät Abmessungen, benötigte Auflösung und Budget, können diese Masken in Chrom (höchste Auflösung, hohe Kosten), auf fotografischem Film geschaffen, hergestellt werden oder sogar direkt auf eine Folie mit hoher Auflösung gedruckt. Hier haben wir Cr Masken von Advance Reproduktionen Corp, North Andover, MA hergestellt werden.
  3. Der nächste Schritt ist, um das Muster von der Maske auf ein lichtempfindliches Epoxidharz zu einem erhöhten Relief Form erstellen zu übertragen.
    1. Zunächst wird eine Schicht aus negativen SU8 Fotolack auf einem Silikon-Wafer auf die gewünschte Dicke gesponnen, und gebacken, um überschüssiges Lösungsmittel verdampft. Photoresist Formulierung und Schleuderdrehzahlen Kontrolle der Dicke der aufgetragenen Schicht.
    2. Dann wird das Muster auf einer vorher festgelegten Dosis von UV-Licht durch die Maske belichtet. Eine post exposure bake vernetzt die belichteten Regionen der Photoresistschicht, wodurch sie unlöslich.
    3. Next ist die Entwicklung Schritt, bei dem nicht belichteten Resist mit einer chemischen Entwickler entfernt, wobei eine positive raised-Reliefstruktur als Master.
    4. Eine dritte Backschritt genannte harte backen Schritt ist optional eine weitere Fixierung der Strukturen.
  4. PDMS Guß
    1. Wir nutzen die Silikon-Elastomer Poly (dimethylsiloxan) für Replikat von mikrofluidischen Bauteilen 1. Zunächst ist das Basismaterial in eine 10:1-Gewichts-Verhältnis mit dem Härter, über die Form in einen flachen Behälter wie eine Petrischale gegossen vermischt und unter Vakuum entgast, bis alle sichtbaren Luftblasen verschwunden sind.
    2. Der Meister mit den ungehärteten PDMS wird dann in einem sorgfältig nivelliert Ofen für mindestens 4h platziert bei 65 ° C für die Vernetzung des Polymers auftreten.
    3. Nach PDMS ist erstarrt ist, wird das geformte Teil aus der Petrischale geschnitten. Die Löcher werden durch die Oberseite des Gerätes auf der mikrofluidischen Räume im fertigen Gerät zugreifen gestanzt.
  5. Befestigung auf Glas
    1. Saubere PDMS ist irreversibel gebundene Glas durch die Einwirkung von Sauerstoff-Plasma zu reinigen. Zunächst werden die geformt und gestanzt PDMS und einen sauberen Glasobjektträger Klebefläche platziert bis zu einem Plasma-Reiniger. Wir verwendeten eine PDC-32G Harrick Plasma-Reiniger.
    2. Nachdem die Kammer geschlossen ist, schaltet sich die Betreiber auf eine Vakuumpumpe und dann die Radiofrequenz-oder HF-Quelle. Plasma wird selbst in die Kammer sich entzünden, was durch eine leicht violette Glühen in der Kammer.
    3. Nach Exposition gegenüber Plasma für 30 Sekunden sind die HF-Quelle und dann die Vakuumpumpe ausgeschaltet.
    4. Schnell werden die Objektträger aus Glas und PDMS-Gerät aus der Kammer entfernt und brachte in direkten Kontakt (molded PDMS-Oberfläche nach unten). Diese bilden eine irreversible Bindung und wird auch die Oberflächeneigenschaften hydrophil.
    5. Falls gewünscht, können verschiedene Oberflächenchemie mit PDMS durch Immobilisierung von Proteinen auf der Oberfläche durch Adsorption oder kovalente Bindung erreicht.
    6. Das Gerät kann dann mit Flüssigkeit, wie zB VE-Wasser, Nährmedien, oder künstlichen Grundwasser durch Kapillarkräfte oder Verwendung sanften Druck mit einer Spritze gefüllt werden.

II. Flow-Quantifizierung von Mikrofluidikvorrichtung durch gravimetrische Analyse

  1. Zur Kalibrierung Druck-driven flow in das Gerät wurden mikrostrukturierte Flow-Zellen zunächst mit DI-Wasser vorinstalliert.
  2. Eine Flüssigkeit mit Reservoir, wie eine Kunststoff-Spritze oder das Flow Modul (siehe Abbildung 1) ist auf den vorgelagerten Einlass gut verbunden und die Höhe der Flüssigkeit im Behälter ist über die Höhe der nachgelagerten gut gepflegt.
  3. Die Proben werden bei der Abfall auch in regelmäßigen Abständen gesammelt und gewogen auf einer analytischen Waage.
  4. Die Steigung der Kurve Plotten Gesamtvolumen vs Gesamtzeit gibt die durchschnittliche Volumenstrom (Abbildung 2). Wir haben reproduzierbare, lineare Durchschnittsgeschwindigkeiten für eine breite Palette an Druck-Köpfe und für verschiedene Druckhaltesysteme gefunden.

III. Flow Visualization, Velocity Mapping und hydrophile / hydrophobe Wechselwirkungen

  1. Für Modell-Kalibrierung wurden 3 um fluoreszierende Latexkügelchen in beiden Carboxy YG und Plain YG Oberflächen aus Polysciences, Inc. erworben und wurden in DI-Wasser, um die Konzentration von 0,01% Feststoffe verdünnt.
  2. Perlen Durchströmen der Lebensräume wurden visualisiert auf einem Zeiss Axiovert 25 Fluoreszenzmikroskop mit einer Mightex BCE-B013-U Monochrom-Kamera ausgestattet.
  3. Einzelbilder wurden in schneller Folge aufgenommen und montiert in Filme mit der ImageJ Software-Paket (Abbildung 3).

IV. Mikrofluidik-Device (EcoChip) zur Modellierung von Bakterienwachstum und Transport

  1. Vibrio sp. GFP Kan, einem nicht-pathogenen grün fluoreszierende Protein-exprimierenden Organismus wurde für 14 Stunden in Luria-Bertani-Medium bis zu einer Konzentration von ca. 10 9 Zellen / ml gestiegen.
  2. Bakterien in das Wachstumsmedium wurden in EcoChip Geräten eingeführt und erlaubt, das Gerät zu besiedeln und zu etablieren Flocken und Filme über Nacht für 19 Stunden.
  3. Dann wird das Wachstum Medien wurde aus den Vertiefungen entfernt und alle Lebensräume wurden mit künstlichem Meerwasser gespült (siehe Wang et al. 2 für ASW Rezept), so dass unterschiedliche Dichten von Bakterien wurden in verschiedenen Lebensräumen übrig.
  4. Ein Lebensraum gehalten wurde versiegelt mit keinen Durchfluss, während langsam die Strömungsverhältnisse in den 3 anderen Lebensräumen gehalten wurden.
  5. Leuchtstoff-und Weißlicht-Bilder des Bakterienwachstums wurden alle 15-20 Stunden für einen Zeitraum von mehreren Tagen (Abbildung 4).

V. repräsentative Ergebnisse

Der Durchfluss-Modul bietet einfache Mittel zur Regelung und Verteilung fließt durch mehrere Lebensräume. Gravimetrische Analyse erwies sich als einfach und unkompliziert auf die Flussraten durch den Lebensraum Strukturen, die sich auf den hydraulischen Widerstand der Lebensräume und die Druckunterschiede zwischen Eingang und Ausgang Brunnen maßgebend sind. Für den Wulst flow Experimenten haben wir viel größere Perle Anhäufung am Gerät Flächen für die uncarboxylated Perlen (Abb. 2) beobachtet. Außerdem wurden größere Kugeln mit einem Durchmesser, 6 und 10 mm, viel eher mitgerissen werden in den kleineren Porenöffnungen und beginnen, in das Gerät ansammeln. Schnellere Flussraten reduziert Partikelrückhaltung und Verschleppung.

Während der das Wachstum von Bakterien Experimenten wird der Einfluss der Strömungsverhältnisse deutlich zu erkennen. Kontinuierliche Scherkräfte verursachen Bakterien zu aggregieren und bilden Flocken, und nicht als einzelne Zellen gefunden werden. Transport von großen Bakterienflocken ist eine wichtige ökologische Verfahren, das äußerst schwierig, in einem makroskopischen System zu studieren.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung Funktionen und der Bedienung des Flow-Modul.

Abbildung 2
Abbildung 2. Durchfluss durch den strukturierten Lebensraum durch gravimetrische Analyse für verschiedene Säulenhöhen bestimmt. Säulenhöhe Verhältnis: 60/40 = 1,5, bestimmt Flussratenverhältnis: 1.04 / 0.71 = 1.46. Führten Flussraten für H = 40 mm ist V = 0,71 ul / min und für H = 60 mm ist V = 1,04 μ L / min. Geschätzte durchschnittliche lineare Geschwindigkeiten sind 3,1 mm / s und 4,6 mm / s bzw..

Abbildung 3
Abbildung 3. Transport von 3um Latexkügelchen mit und ohne Carboxylierung fließt durch die strukturierte Lebensräume.

Abbildung 4
Abbildung 4. Ändern Sie in das bakterielle Wachstum und Biofilmbildung in Abhängigkeit von Saatgut-Dichte in Anwesenheit einer langsamen Strömung.

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Discussion

Die EcoChip System ist anpassbar an die Bedürfnisse eines einzelnen Experiments. New Master können relativ einfach erstellt werden, und einmal ein Meister gefertigt ist, zusätzliche exakt repliziert Geräte können cast as benötigt werden. Der Durchfluss-Modul ist einfach zu bedienen, erfordert keine besondere Ausrüstung oder komplexe Zusammenhänge und kann als einfacher fallen Kopfdruck-driven flow-System modelliert werden. Zusätzliche Erweiterungen für diese Arbeit sind im Gange, und zählen die Schaffung von Huminsäure beschichteten Kanälen und systematische Variation der wässrigen Chemie des strömenden Fluids. Mit diesem Ansatz kann die Mikro-Maßstab Wechselwirkungen von Bakterien mit Oberflächen und Wachstum und Transport in porösen Medien direkt beobachtet werden und systematisch untersucht.

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Acknowledgments

Diese Studie wurde von Grant # 0649883 aus der National Science Foundation, die von der Vanderbilt-Institut für Integrative Biosystems Bildung und Forschung (VIIBRE) und von der Searle Systems Biology and Bioengineering Undergraduate Research Experience (Searle SyBBURE) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Dow Corning
SU8-2025 MicroChem Corp.
Fluorescent Beads Polysciences, Inc.

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References

  1. Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  2. Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. Mobility of protozoa through narrow channels. Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).

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