Fenêtre sur un micromonde: Simple systèmes microfluidiques pour l'étude de Transports microbienne dans les milieux poreux

Biology

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Summary

Dispositifs microfluidiques peuvent être utilisées pour visualiser processus naturels complexes en temps réel et à l'échelle physique approprié. Nous avons développé un dispositif simple microfluidique qui imite les principales caractéristiques des milieux poreux naturels pour étudier la croissance et le transport des bactéries dans le sous-sol.

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Markov, D. A., Samson, P. C., Schaffer, D. K., Dhummakupt, A., Wikswo, J. P., Shor, L. M. Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media. J. Vis. Exp. (39), e1741, doi:10.3791/1741 (2010).

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Abstract

La croissance microbienne et de transport en milieux poreux ont des implications importantes pour la qualité de l'eau souterraine et de surface, le recyclage des nutriments dans l'environnement, ainsi que directement à la transmission des pathogènes à l'approvisionnement en eau potable. Naturelles des milieux poreux est composé d'une topologie complexe physique, chimie de surface variées, les gradients de dynamique des nutriments et accepteurs d'électrons, et une répartition inégale des microbes. Ces caractéristiques varient sensiblement sur une échelle de longueur de quelques microns, ce qui rend les résultats de la macro-échelle des enquêtes de transport microbien difficiles à interpréter, et la validation des modèles mécanistes difficiles. Ici nous démontrons comment de simples dispositifs microfluidiques peuvent être utilisées pour visualiser les interactions microbiennes avec des micro-structurée des habitats, d'identifier les processus clés qui influent sur les phénomènes observés, et de valider systématiquement les modèles prédictifs. Simple, des cellules d'écoulement facile à utiliser, ont été construits hors de la transparence, matériau biocompatible et perméable à l'oxygène poly (diméthyl siloxane). Les méthodes standard de la photolithographie ont été utilisés pour fabriquer des micro-structurée maîtres, et le moulage réplique a été utilisé pour lancer des cellules d'écoulement des micro-structurée par les maîtres. La conception physique de la chambre de la cellule de débit est adaptable aux besoins expérimentaux: microcanaux peut varier de simples connexions linéaires aux topologies complexes avec des tailles de fonction aussi petites que 2 um. Notre gamme modulaire de cellules d'écoulement EcoChip caractéristiques des dizaines de chambres identiques et de contrôle de flux par un module de flux par gravité. Nous démontrons que, grâce à l'utilisation de dispositifs EcoChip, les structures physiques et les têtes de pression peut être variable ou constante, systématique alors que l'influence de la chimie de surface, les propriétés des fluides, ou les caractéristiques de la population microbienne est étudiée. Grâce à des expériences de transport utilisant un non-pathogènes, la protéine fluorescente verte exprimant

Protocol

Fabrication I. dispositif microfluidique

  1. La première étape dans la création d'un dispositif microfluidique est de dessiner une configuration à deux dimensions de l'appareil dans un ordinateur de dessin (CAO) assistés. Nous avons utilisé AutoCAD, mais d'autres programmes de dessin sont également disponibles, tels que CleWin, ou CorelDraw.
  2. L'étape suivante consiste à fabriquer un masque de photolithographie. Selon les dimensions du dispositif, la résolution et le budget nécessaire, ces masques pourrait être fabriqué en chrome (plus haute résolution, le coût élevé), créé sur un film photographique, ou même imprimer directement sur un transparent en utilisant une imprimante à haute résolution. Ici, nous avons utilisé des masques fabriqués par Cr Advance Reproductions Corp, North Andover, MA.
  3. L'étape suivante consiste à transférer le motif du masque sur un époxy photosensible pour créer un moule soulevé-relief.
    1. Tout d'abord, une couche de résine photosensible négative SU8 est filée sur une plaquette de silicone à l'épaisseur souhaitée, et cuit à se volatiliser l'excès de solvant. Photoresist vitesses de formulation et de spin de contrôle de l'épaisseur de la couche déposée.
    2. Ensuite, le modèle est exposé à une dose pré-déterminée de la lumière UV à travers le masque. Un post-exposition de pâtisseries liaisons croisées dans les régions exposées à la lumière de la couche photosensible, les rendant insolubles.
    3. Ensuite vient l'étape de développement, où non exposés résister est enlevé avec un révélateur chimique, laissant un effet positif soulevé-relief structure appelée un maître.
    4. Une étape de cuisson troisième appelé une étape dure de pâtisseries est facultative pour fixer les autres structures.
  4. Le moulage de PDMS
    1. Nous utilisons l'élastomère de silicone poly (diméthyl siloxane) pour le moulage de répliques de dispositifs microfluidiques 1. Tout d'abord, le matériau de base est mélangé dans un rapport de 10:1 de poids avec l'agent de durcissement, versé sur le moule dans un récipient peu profond, comme une boîte de Pétri, et dégazé sous vide jusqu'à ce que toutes les bulles visibles ont disparu.
    2. Le maître avec le PDMS non durci est ensuite placé dans un four soigneusement nivelé pendant au moins 4h à 65 ° C pour la réticulation du polymère de se produire.
    3. Après PDMS est solidifié, la section moulée est découpée dans la boîte de Pétri. Des trous sont perforés par le haut de l'appareil pour accéder aux espaces microfluidique dans le produit fini.
  5. Pièce jointe au verre
    1. Nettoyer PDMS est irréversiblement lié à nettoyer les vitres par l'exposition à un plasma d'oxygène. Premièrement, la moulée et de poing PDMS et d'une lame de verre propre surface de collage sont placés en un nettoyant plasma. Nous avons utilisé un PDC-32G Harrick plasmatique plus propre.
    2. Après la chambre est fermée, l'opérateur tourne sur une pompe à vide et ensuite la fréquence radio ou une source RF. Plasma auto s'enflammer dans la chambre, comme en témoigne une lueur légèrement pourpre dans la chambre.
    3. Après exposition à un plasma pendant 30 secondes, la source RF et la pompe à vide sont désactivés.
    4. Rapidement, la lame de verre et le dispositif de PDMS sont retirés de la chambre et mis en contact direct (moulé côté de la surface de PDMS en bas). Cela formera un lien irréversible, et fera aussi les propriétés de surface hydrophile.
    5. Si désiré, chimies de surface différents peuvent être réalisés avec PDMS par immobilisation des protéines à la surface par adsorption ou liaison covalente.
    6. L'appareil peut alors être rempli de liquide comme l'eau déminéralisée, les milieux de croissance, ou artificielle des eaux souterraines par les forces capillaires ou l'utilisation de la pression douce avec une seringue.

II. La quantification des flux dispositif microfluidique par analyse gravimétrique

  1. Pour calibrer la pression axée sur l'écoulement dans le dispositif, des cellules d'écoulement micro-structurées ont d'abord été préchargé avec de l'eau DI.
  2. Un réservoir de liquide contenant, comme une seringue en plastique ou le module de flux (voir figure 1) est connecté à l'entrée amont bien, et la hauteur de liquide dans le réservoir est maintenue au-dessus de la hauteur à l'aval ainsi.
  3. Les échantillons sont prélevés à la gestion des déchets bien à intervalles réguliers et pesés sur une balance analytique.
  4. La pente de la courbe représentant le volume total par rapport au temps total donne le débit volumétrique débit moyen (figure 2). Nous avons trouvé reproductibles, linéaire vitesses moyennes pour une large gamme de têtes de pression et pour différents systèmes de maintien de pression.

III. Visualisation de l'écoulement, la cartographie de vélocité, et hydrophile / hydrophobe interaction

  1. Pour l'étalonnage du modèle, 3 um billes de latex fluorescentes dans les deux Carboxy YG et Plain surfaces YG ont été acquis auprès de Polysciences, Inc et sont dilués dans de l'eau DI à la concentration de solides de 0,01%.
  2. Perles qui coule à travers les habitats ont été visualisées sur un Zeiss Axiovert 25 microscope à fluorescence équipé d'une Mightex BCE-B013-U caméra monochrome.
  3. Images individuelles ont été capturés dans une succession rapide et assemblés dans des films avec le logiciel ImageJ (figure 3).

IV. Dispositif microfluidique (EcoChip) pour la modélisation de croissance bactérienne et des Transports

  1. Vibrio sp. GFP Kan, un non-pathogènes protéine fluorescente verte exprimant l'organisme a été cultivé pendant 14 heures dans du milieu Luria-Bertani à une concentration d'environ 10 9 cellules / ml.
  2. Les bactéries présentes dans le milieu de croissance ont été introduites dans les dispositifs EcoChip et a permis de coloniser l'appareil et établir des flocs et de films durant la nuit pendant 19 heures.
  3. Puis le milieu de croissance a été retiré du puits et de tous les habitats ont été rincés avec l'eau de mer artificielle (s'il vous plaît voir Wang et coll. 2 pour la recette ASW) afin que les différentes densités de bactéries ont été restants dans des habitats différents.
  4. Un habitat a été gardé scellé sans écoulement, tandis que les conditions d'écoulement lent ont été maintenus dans les trois autres habitats.
  5. Images lumière fluorescente et blanc de la croissance bactérienne ont été prises toutes 15-20 heures pour une période de plusieurs jours (figure 4).

Résultats Représentant V.

Le module de flux fournit un moyen simple de réglementer et de distribuer les flux à travers de multiples habitats. L'analyse gravimétrique s'est avéré être un moyen facile et simple de déterminer le débit à travers les structures de l'habitat, qui dépendent de la résistance hydraulique de l'habitat et les différences de pression entre l'entrée et les puits de sortie. Pour les expériences de flux de perles que nous avons observé beaucoup plus grande accumulation de billes à la surface périphérique pour les perles uncarboxylated (figure 2). En outre, les billes de grand diamètre, 6 et 10 mm, étaient beaucoup plus susceptibles d'être entraînées dans l'ouverture des pores plus petits et commencent à s'accumuler dans l'appareil. Débits plus rapides rétention réduite des particules et l'entraînement.

Au cours des expériences de croissance des bactéries, l'influence des conditions d'écoulement est clairement évident. Forces de cisaillement continu provoquer des bactéries à s'agréger et forment des flocs et de ne pas être trouvée tant que les cellules individuelles. Transport de grands flocs bactériens est un processus important de l'environnement qui est extrêmement difficile d'étudier dans un système macroscopique.

Figure 1
Figure 1. Schéma montrant les caractéristiques et le fonctionnement du module de flux.

Figure 2
Figure 2. Débit dans l'habitat structuré tel que déterminé par analyse gravimétrique pour des hauteurs de colonne différente. Rapport hauteur colonne: 60/40 = 1,5, le ratio déterminé débit: 1,04 / 0,71 = 1,46. Débits entraîné pour H = 40 mm est V = 0,71 ul / min et pour H = 60 mm est V = 1,04 L μ / min. Estimation moyenne vitesses linéaires sont de 3,1 mm / s et 4,6 mm / s respectivement.

Figure 3
Figure 3. Transport de billes de latex 3um avec et sans carboxylation qui coule à travers les habitats structurés.

Figure 4
Figure 4. Variation de la croissance bactérienne et la formation de biofilm en fonction de la densité de semis en présence d'un débit lent.

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Discussion

Le système est adaptable EcoChip aux besoins d'une expérience individuelle. Les nouveaux maîtres peuvent être créés relativement facilement, et une fois un maître est fabriqué, des dispositifs supplémentaires exactement dupliquée peut être moulé comme nécessaire. Le module de flux est simple à utiliser, ne requiert aucun équipement spécial ou des connexions complexes, et peut être modélisée comme une tête simples tomber mus par pression du système de flux. Des prolongations supplémentaires de ce travail sont en cours, et notamment la création de canaux de l'acide humique couché, et systématiquement varier la chimie aqueuse du liquide qui coule. En utilisant cette approche, les interactions micro-échelle des bactéries avec les surfaces et les phénomènes de croissance et de transport en milieu poreux peut être observé directement et systématiquement étudiés.

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Acknowledgments

Cette étude a été soutenue par des subventions # 0649883 de la National Science Foundation, l'Institut Vanderbilt for Integrative Biosystems recherche et d'enseignement (VIIBRE), et par la biologie Searle systèmes et l'expérience de la recherche bio-ingénierie de premier cycle (Searle SyBBURE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Dow Corning
SU8-2025 MicroChem Corp.
Fluorescent Beads Polysciences, Inc.

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References

  1. Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  2. Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. Mobility of protozoa through narrow channels. Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).

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