Finestra su un micromondo: Sistemi Microfluidic semplice per studiare il trasporto microbica in mezzi porosi

Biology

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Summary

Dispositivi microfluidici può essere utilizzato per visualizzare complessi processi naturali in tempo reale e alle scale fisico appropriato. Abbiamo sviluppato un semplice dispositivo a microfluidi che simula le caratteristiche principali di mezzi porosi naturali per studiare la crescita e il trasporto di batteri nel sottosuolo.

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Markov, D. A., Samson, P. C., Schaffer, D. K., Dhummakupt, A., Wikswo, J. P., Shor, L. M. Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media. J. Vis. Exp. (39), e1741, doi:10.3791/1741 (2010).

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Abstract

La crescita microbica e trasporto in mezzi porosi avere importanti implicazioni per la qualità delle acque sotterranee e di superficie, il riciclaggio dei nutrienti nell'ambiente, oltre che direttamente per la trasmissione di agenti patogeni di approvvigionamento di acqua potabile. Mezzi porosi naturali si compone di una topologia complessa fisico, chimiche superficie varia, dinamica gradienti di nutrienti e accettori di elettroni, e una distribuzione irregolare di microbi. Queste caratteristiche variano sostanzialmente su una scala di micron di lunghezza, rendendo i risultati della macro-scala indagini di trasporto microbica difficile da interpretare, e la validazione dei modelli meccanicistici impegnativo. Qui mostriamo come semplici dispositivi microfluidica può essere utilizzato per visualizzare le interazioni microbiche con micro-habitat strutturato, per identificare i processi chiave che influenzano i fenomeni osservati, e di validare sistematicamente modelli predittivi. Semplice, facile da usare celle di flusso sono stati estrapolati dai trasparente, materiale biocompatibile e poli permeabile all'ossigeno (dimetil silossano). Metodi standard di fotolitografia state utilizzate per effettuare micro-strutturati maestri, e stampaggio replica è stata utilizzata per lanciare micro-celle di flusso strutturato dai maestri. La progettazione fisica della camera di cella di flusso è adattabile alle esigenze sperimentali: microcanali possono variare da semplici collegamenti lineari di topologie complesse con dimensioni caratteristiche piccole come 2 micron. La nostra gamma modulare il flusso EcoChip cellule caratteristiche decine di camere identiche e controllo di flusso da una forza di gravità-driven modulo flusso. Abbiamo dimostrato che attraverso l'uso di dispositivi EcoChip, strutture fisiche e le teste di pressione può essere mantenuta costante o varia sistematicamente mentre l'influenza della chimica di superficie, le proprietà dei fluidi, o le caratteristiche della popolazione microbica è indagato. Attraverso esperimenti di trasporto con un non patogeno, la proteina verde fluorescente che esprimono

Protocol

I. Microfluidic dispositivo di fabbricazione

  1. Il primo passo nella creazione di un dispositivo a microfluidi è quello di disegnare un layout a due dimensioni del dispositivo in un computer di disegno assistito (CAD) del programma. Abbiamo usato AutoCAD, ma altri programmi di disegno sono inoltre disponibili, come CleWin, o CorelDraw.
  2. Il passo successivo è quello di fabbricare una maschera fotolitografica. A seconda delle dimensioni dei dispositivi, richieste risoluzione e di bilancio, queste maschere possono essere fabbricate in cromo (la più alta risoluzione, alto costo), creato su pellicola fotografica, o addirittura stampati direttamente su un lucido con una stampante ad alta risoluzione. Qui, abbiamo usato maschere Cr prodotto da Advance Riproduzioni Corp., North Andover, MA.
  3. Il passo successivo è quello di trasferire il modello dalla maschera su una resina fotosensibile per creare un elevato rilievo stampo.
    1. In primo luogo, uno strato di photoresist negativo SU8 è filata su un wafer di silicone allo spessore desiderato, e cotto per volatilizzare solvente in eccesso. Photoresist velocità di formulazione e girare il controllo dello spessore dello strato depositato.
    2. Poi, il modello è esposto ad un pre-determinato dose di luce UV attraverso la maschera. Un post esposizione cuocere legami incrociati di luce esposte le regioni del rivestimento photoresist, rendendoli insolubili.
    3. È il passo successivo di sviluppo, dove non esposti resistere viene rimosso con uno sviluppatore chimica, lasciando un positivo sollevato rilievo struttura chiamata un maestro.
    4. Un passo cottura terzo chiamato un passo difficile cuocere è opzionale per fissare ulteriormente le strutture.
  4. PDMS stampaggio
    1. Noi utilizziamo il silicone elastomero poli (dimetil silossano) per lo stampaggio replica di dispositivi microfluidici 1. In primo luogo, il materiale di base è mescolato in un rapporto di 10:1 peso con il catalizzatore, versato sopra lo stampo in un contenitore poco profondo come una capsula di Petri, e degasato sotto vuoto fino a che tutte le bolle visibili sono andati.
    2. Il master con il PDMS non polimerizzato viene posto in un forno attentamente livellato per almeno 4 ore a 65 ° C per il cross-linking del polimero che si verifichi.
    3. Dopo PDMS è solidificato, la sezione stampato è tagliato fuori dalla capsula di Petri. I fori sono perforati attraverso la parte superiore del dispositivo per l'accesso agli spazi microfluidico nel dispositivo finito.
  5. Allegato al vetro
    1. Pulire PDMS è irreversibilmente legato a pulire vetro da esposizione a plasma di ossigeno. In primo luogo, il modellato e pugni PDMS e un vetrino pulito sono posti superficie di incollaggio fino a un pulitore plasma. Abbiamo usato una PDC-32G Harrick pulizia al plasma.
    2. Dopo che la camera è chiuso, l'operatore si accende una pompa a vuoto e poi la frequenza radio o la sorgente rf. Plasma si auto accendere nella camera, evidenziato da una luce viola leggermente nella camera.
    3. Dopo l'esposizione al plasma per 30 secondi, la fonte rf e poi la pompa a vuoto sono spenti.
    4. Rapidamente, il vetrino e il dispositivo di PDMS vengono rimossi dalla camera e portato a contatto diretto (stampato lato della superficie PDMS verso il basso). Questo formerà un legame irreversibile, e farà anche le proprietà di superficie idrofila.
    5. Se lo si desidera, chimiche superficiali diversi può essere realizzato con PDMS attraverso l'immobilizzazione di proteine ​​sulla superficie di assorbimento o legame covalente.
    6. Il dispositivo può quindi essere riempito di liquido come l'acqua deionizzata, terreni di coltura, o sotterranee artificiali da forze capillari o l'utilizzo di una leggera pressione con una siringa.

II. La quantificazione del flusso di dispositivo a microfluidi da analisi gravimetriche

  1. Per calibrare la pressione-driven flusso nel dispositivo, micro-strutturato celle di flusso sono stati precaricati con acqua deionizzata.
  2. Un serbatoio liquido contenente, come una siringa di plastica o il modulo di flusso (Figura 1) è collegato alla presa a monte bene, e l'altezza del liquido nel serbatoio è mantenuto al di sopra dell'altezza a valle bene.
  3. I campioni vengono raccolti i rifiuti e ad intervalli regolari e pesa su una bilancia analitica.
  4. La pendenza della curva di complotto volume totale rispetto al tempo totale dà la media portata volumetrica (Figura 2). Abbiamo trovato riproducibile, velocità lineare media per una vasta gamma di teste di pressione e per diversi sistemi di mantenimento della pressione.

III. Visualizzazione del flusso, Mappatura Velocity, e idrofilo / idrofobo Interazione

  1. Per la calibrazione del modello, 3 micron sfere di lattice fluorescente in entrambe le superfici Carboxy YG e Pianura YG sono state acquisite da Polysciences, Inc. e sono stati diluiti in acqua deionizzata alla concentrazione di 0,01% solidi.
  2. Perline che fluisce attraverso gli habitat sono stati visualizzati su un Zeiss Axiovert 25 microscopio a fluorescenza dotato di una aC-B013-U fotocamera Mightex bianco e nero.
  3. I singoli fotogrammi sono stati catturati in rapida successione e montato in filmati con il pacchetto software ImageJ (Figura 3).

IV. Dispositivo Microfluidic (EcoChip) per la modellazione della crescita batterica e dei Trasporti

  1. Vibrio sp. GFP Kan, un non-patogeni la proteina verde fluorescente che esprimono organismo è stato coltivato per 14 ore in Luria-Bertani medio ad una concentrazione di circa 10 9 cellule / ml.
  2. Batteri nel terreno di crescita sono stati introdotti in dispositivi EcoChip e ha permesso di colonizzare il dispositivo e stabilire fiocchi e film durante la notte per 19 ore.
  3. Poi i mezzi di crescita è stato rimosso dai pozzetti e di tutti gli habitat sono stati lavati con acqua di mare artificiale (si veda Wang et al. 2 per ricetta ASW) in modo che diverse densità di batteri erano rimasti in diversi habitat.
  4. Un habitat è stato tenuto sigillato con assenza di flusso, mentre le condizioni di flusso lento sono stati mantenuti nei 3 altri habitat.
  5. Quadri di luce fluorescente e nero della crescita batterica sono state scattate ogni 15-20 ore per un periodo di alcuni giorni (Figura 4).

V. Rappresentante Risultati

Il modulo fornisce flusso mezzo semplice per la regolazione e la distribuzione dei flussi attraverso gli habitat più. Gravimetrica analisi si è rivelato un modo semplice e diretto per determinare le portate attraverso le strutture dell'habitat, che dipendono dalla resistenza idraulica degli habitat e le differenze di pressione tra ingresso e uscita dei pozzi. Per gli esperimenti di flusso tallone abbiamo osservato molto più grande accumulo tallone alla superficie del dispositivo per le perline uncarboxylated (Figura 2). Inoltre, perline diametro maggiore, 6 e 10 mm, erano molto più probabilità di diventare trascinato nelle aperture dei pori più piccoli e cominciano ad accumularsi nel dispositivo. Portate più veloce di ritenzione delle particelle e trascinamento.

Durante gli esperimenti di crescita batterica, l'influenza delle condizioni di flusso è chiaramente evidente. Forze di taglio continuo causa dei batteri di aggregare insieme e formano fiocchi, e non si trova, come le singole cellule. Trasporto di grandi fiocchi batterica è un processo importante ambientale che è estremamente difficile da studiare in un sistema macroscopico.

Figura 1
Figura 1. Schematica che mostra le caratteristiche e il funzionamento del modulo di flusso.

Figura 2
Figura 2. Portata attraverso l'habitat strutturato come determinato mediante l'analisi gravimetrica per diverse altezze della colonna. Rapporto altezza della colonna: 60 / 40 = 1,5, determinato rapporto del tasso di flusso: 1,04 / 0,71 = 1,46. Portate portato per H = 40 mm è V = 0,71 microlitri / min e per H = 60 mm è V = 1.04 L μ / min. Stima velocità media lineare sono 3,1 mm / s e 4,6 mm / s rispettivamente.

Figura 3
Figura 3. Trasporto di 3um sfere di lattice con e senza carbossilazione che fluisce attraverso gli habitat strutturato.

Figura 4
Figura 4. Cambiamenti nella crescita batterica e la formazione di biofilm in funzione della densità di seme in presenza di un flusso lento.

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Discussion

Il sistema EcoChip è adattabile alle esigenze di un esperimento individuale. Nuovi padroni possono essere creati in modo relativamente semplice, e una volta un maestro è fabbricato, ulteriori dispositivi esattamente replicato possono essere lanciate come necessario. Il modulo del flusso è semplice da usare, non richiede attrezzature particolari o connessioni complesse, e può essere modellato come una testa semplice caduta di pressione basato su sistema a flusso. Ulteriori estensioni a questo lavoro sono in corso, e comprendono la creazione di canali di acidi umici rivestito, e sistematicamente variando la chimica acquosa del fluido che scorre. Usando questo approccio, il micro-scala interazioni dei batteri con le superfici e dei fenomeni di crescita e di trasporto in mezzi porosi possono essere osservati direttamente e sistematicamente studiati.

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Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto dalla concessione # 0649883 dal National Science Foundation, l'Istituto per la Vanderbilt Integrativa Biosystems la ricerca e l'istruzione (VIIBRE), e dalla biologia Searle Sistemi ed esperienza di ricerca di Bioingegneria di laurea (Searle SyBBURE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Dow Corning
SU8-2025 MicroChem Corp.
Fluorescent Beads Polysciences, Inc.

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References

  1. Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  2. Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. Mobility of protozoa through narrow channels. Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).

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