Janela em um Microworld: Simple sistemas microfluídicos para estudar o transporte microbiana em Meios Porosos

Biology

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Summary

Dispositivos microfluídicos pode ser usado para visualizar os complexos processos naturais em tempo real e nas escalas físico apropriado. Temos desenvolvido um dispositivo simples microfluídicos que imita características-chave de meios porosos naturais para o estudo de crescimento e de transporte de bactérias no subsolo.

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Markov, D. A., Samson, P. C., Schaffer, D. K., Dhummakupt, A., Wikswo, J. P., Shor, L. M. Window on a Microworld: Simple Microfluidic Systems for Studying Microbial Transport in Porous Media. J. Vis. Exp. (39), e1741, doi:10.3791/1741 (2010).

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Abstract

Crescimento microbiano e transporte em meios porosos têm implicações importantes para a qualidade das águas subterrâneas e de superfície de água, a reciclagem de nutrientes no meio ambiente, bem como diretamente para a transmissão de patógenos para abastecimento de água potável. Natural meios porosos é composto de uma topologia complexa física, química de superfície variada, dinâmica gradientes de nutrientes e receptores de elétrons, e uma distribuição irregular de micróbios. Estas características variam substancialmente ao longo de um escala de comprimento de mícrons, tornando os resultados de macro-escala investigações de transporte microbiana difícil de interpretar, e à validação de modelos mecanicistas desafiador. Aqui demonstramos como simples dispositivos microfluídicos pode ser usado para visualizar interações microbianas com micro-estruturadas habitats, para identificar os processos-chave que influenciam os fenômenos observados, e de forma sistemática validar modelos preditivos. Simples, as células easy-to-use fluxo foram construídos a partir dos transparente, biocompatível e oxigênio-permeável de material de poli (dimetil siloxano). Métodos de fotolitografia padrão foram usados ​​para fazer micro-estruturadas mestres, e moldagem réplica foi usada para lançar células micro-estruturado de fluxo com os mestres. O projeto físico da câmara de célula de fluxo é adaptável às exigências experimental: microcanais podem variar de simples conexões lineares para topologias complexas com tamanhos recurso tão pequenas quanto 2 micra. Nosso modular EcoChip matriz de célula de fluxo possui dezenas de câmaras idênticas e controle de fluxo por um módulo de fluxo de gravidade-driven. Nós demonstramos que através do uso de dispositivos EcoChip, estruturas físicas e as cabeças de pressão pode ser mantida constante ou variada sistematicamente, enquanto a influência da química de superfície, propriedades dos fluidos, ou as características da população microbiana é investigado. Através de experimentos de transporte utilizando um não-patogênico, proteína fluorescente verde-expressando

Protocol

I. fabricação de dispositivos microfluídicos

  1. O primeiro passo para criar um dispositivo micro é para desenhar um layout de duas dimensões do dispositivo em um programa de desenho assistido computador (CAD). Temos usado o AutoCAD, mas outros programas de desenho também estão disponíveis, tais como CleWin, ou CorelDRAW.
  2. O próximo passo é fabricar uma máscara de fotolitografia. Dependendo das dimensões do dispositivo, necessário resolução e orçamento, essas máscaras podem ser fabricadas em cromo (a mais alta resolução, alto custo), criado em filme fotográfico, ou mesmo impresso diretamente sobre uma transparência usando uma impressora de alta resolução. Aqui, nós usamos máscaras Cr fabricados pela Advance reproduções Corp, North Andover, MA.
  3. O próximo passo é transferir o padrão da máscara para um epóxi fotossensíveis para criar um molde levantou-relevo.
    1. Primeiro, uma camada de fotorresiste SU8 negativo é girada sobre uma bolacha de silicone com a espessura desejada, e cozido para volatilizar o excesso de solvente. Velocidades fotorresiste formulação e spin controlar a espessura da camada depositada.
    2. Então, o padrão é exposto a uma dose pré-determinada de luz UV através da máscara. A exposição pós bake ligações cruzadas nas regiões expostas à luz do revestimento fotorresiste, tornando-os insolúveis.
    3. Em seguida é a etapa de desenvolvimento, onde não exposto resistir é removido com um desenvolvedor de produtos químicos, deixando uma estrutura levantou-relevo positivo chamado de mestre.
    4. A etapa de cozimento terceira chamada um passo bake rígido é opcional para acertar as estruturas.
  4. Moldagem PDMS
    1. Nós usamos o silicone elastômero poli (dimetil siloxano) para moldagem réplica de dispositivos microfluídicos 1. Primeiro, o material base é misturado em uma proporção de peso 10:01 com o agente de cura, derramado sobre o molde em um recipiente raso como uma placa de Petri, e desgaseificado sob vácuo até que todas as bolhas visíveis são ido.
    2. O mestre não curado com o PDMS é então colocada em um forno cuidadosamente nivelado por pelo menos 4h a 65 ° C para cross-linking do polímero para ocorrer.
    3. Depois de PDMS é solidificado, a seção moldado é cortado da placa de Petri. Buracos são perfurados através do topo do dispositivo de acesso a espaços microfluídicos no dispositivo final.
  5. Fixação ao vidro
    1. Limpa PDMS é irreversivelmente ligado a limpar o vidro pela exposição ao plasma de oxigênio. Primeiro, o PDMS moldado e um soco e uma lâmina de vidro limpa são colocados superfície de ligação acima em um aspirador de plasma. Usamos um PDC-32G Harrick limpo plasma.
    2. Após a câmara é fechada, o operador liga uma bomba de vácuo e então a frequência de rádio ou fonte rf. Plasma auto-ignição na câmara, evidenciada por um brilho ligeiramente roxo na câmara.
    3. Após a exposição ao plasma por 30 segundos, a fonte de rf e depois a bomba de vácuo estão desligados.
    4. Rapidamente, a lâmina de vidro e um dispositivo de PDMS são removidos da câmara e entra em contacto directo (lado da superfície moldado PDMS para baixo). Isto irá formar uma ligação irreversível, e também fará as propriedades da superfície hidrofílica.
    5. Se desejar, química de superfície diferentes podem ser alcançados com PDMS através da imobilização de proteínas na superfície por adsorção ou ligação covalente.
    6. O dispositivo pode ser preenchido com líquido, como água deionizada, meio de crescimento, ou artificial de águas subterrâneas por forças capilares ou uso de uma leve pressão com uma seringa.

II. Quantificação do fluxo de dispositivo micro por Análise Gravimétrica

  1. Para calibrar a pressão-driven fluxo no dispositivo, as células micro-estruturadas fluxo foram os primeiros pré-carregado com água DI.
  2. Um reservatório de líquido que contém, como uma seringa de plástico ou o módulo de fluxo (mostrado na Figura 1) é conectado à entrada de upstream bem, ea altura de fluido no reservatório é mantido acima da altura na jusante bem.
  3. As amostras são recolhidas no lixo bem em intervalos regulares e pesados ​​em balança analítica.
  4. A inclinação da curva de plotagem volume total em função do tempo total dá a vazão média volumétrica (Figura 2). Foram encontradas reprodutível, linear velocidades médias para uma ampla gama de cabeças de pressão e de pressão diferentes manutenção de sistemas.

III. Visualização de fluxo, mapeamento de velocidade, e hidrofílico / hidrofóbico de Interação

  1. Para calibração do modelo, 3 mm esferas de látex em ambas as fluorescentes Carboxy YG YG e Plain superfícies foram adquiridos a partir Polysciences, Inc. e foram diluídas em água DI para a concentração de sólidos de 0,01%.
  2. Contas que flui através do habitats foram visualizadas em um Axiovert Zeiss 25 microscópio de fluorescência equipado com uma câmera Mightex BCE-B013-U monocromática.
  3. Quadros individuais foram capturados em rápida sucessão e montados em filmes com o pacote de software ImageJ (Figura 3).

IV. Dispositivo microfluídicos (EcoChip) para modelagem do crescimento de bactérias e Transportes

  1. Vibrio sp. GFP Kan, um não-patogênico verde organismo proteína fluorescente expressando foi cultivado por 14 horas em Luria-Bertani meio a uma concentração de aproximadamente 10 9 células / ml.
  2. Bactérias no meio de crescimento foram introduzidos dispositivos EcoChip e permitiu a colonizar o dispositivo e estabelecer flocos e filmes durante a noite por 19 horas.
  3. Em seguida, o meio de crescimento foi retirado dos poços e todos os habitats foram lavados com água do mar artificial (veja Wang et al. 2 para receita ASW), de modo que diferentes densidades de bactérias foram restantes em diferentes habitats.
  4. Um habitat foi mantido selado com ausência de fluxo, enquanto as condições de fluxo lento foram mantidos nos 3 outros habitats.
  5. Imagens de luz fluorescente e branco do crescimento bacteriano foram realizadas a cada 15-20 horas por um período de vários dias (Figura 4).

Representante Resultados V.

O módulo de fluxo fornece meios simples para regular e distribuir flui através de habitats múltiplos. Análise gravimétrica provou ser uma maneira fácil e simples para determinar as taxas de fluxo através das estruturas de habitat, que dependem da resistência hidráulica dos habitats e as diferenças de pressão entre a entrada ea saída dos poços. Para os experimentos de fluxo de talão temos observado muito maior acúmulo de talão nas superfícies do dispositivo para as contas uncarboxylated (Figura 2). Além disso, os grânulos de maior diâmetro, 6 e 10 mm, eram muito mais provável que se torne arrastado nas aberturas menores poros e começar a acumular-se no dispositivo. Taxas de fluxo mais rápido reduzida retenção de partículas e arrastamento.

Durante os experimentos de crescimento de bactérias, a influência das condições de fluxo é claramente evidente. Forças de cisalhamento contínua às bactérias agregados juntos e flocos forma, e para não ser encontrado como células individuais. Transporte de grandes flocos bacteriana é um importante processo ambiental, que é extremamente difícil de estudar em um sistema macroscópico.

Figura 1
Figura 1. Esquemático mostrando características e funcionamento do módulo de fluxo.

Figura 2
Figura 2. Taxa de fluxo através do habitat estruturado conforme determinado pela análise gravimétrica para alturas de coluna diferente. Relação de altura de coluna: 60/40 = 1,5, relação de fluxo de taxa determinada: 1,04 / 0,71 = 1,46. Taxas de fluxo resultou para H = 40 mm é V = 0,71 mL / min e para H = 60 mm é V = 1,04 L μ / min. Média estimada velocidades lineares são 3.1 mm / s e 4,6 mm / s, respectivamente.

Figura 3
Figura 3. Transporte de contas 3um de látex com e sem carboxilação flui através do habitats estruturado.

Figura 4
Figura 4. Variação do crescimento de bactérias e formação de biofilme em função da densidade de sementes na presença de fluxo lento.

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Discussion

O sistema EcoChip é adaptável às necessidades de uma experiência individual. Novos mestres podem ser criados de forma relativamente fácil, e uma vez um mestre é fabricado, dispositivos adicionais exatamente replicado pode ser escalado como necessário. O módulo de fluxo é simples de usar, não requer nenhum equipamento especial ou conexões complexas, e pode ser modelado como uma cabeça simples queda de pressão-driven sistema de fluxo. Extensões adicionais para este trabalho estão em andamento, e incluem a criação de canais de ácidos húmicos revestido, e sistematicamente variando a química aquosa do fluido. Usando essa abordagem, as interações micro-escala de bactérias com superfícies e fenômenos de crescimento e de transporte em meios porosos podem ser observados diretamente e sistematicamente investigados.

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Acknowledgments

Este estudo foi apoiado pela concessão # 0649883 da National Science Foundation, pelo Instituto Vanderbilt para Integrativa Biosystems Pesquisa e Educação (VIIBRE), e pela Biologia de Sistemas de Bioengenharia Searle e Experiência de Pesquisa de Graduação (Searle SyBBURE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS Dow Corning
SU8-2025 MicroChem Corp.
Fluorescent Beads Polysciences, Inc.

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References

  1. Whitesides, G., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  2. Wang, W., Shor, L. M., LeBoeuf, E. J., Wikswo, J. P., Kosson, D. S. Mobility of protozoa through narrow channels. Applied and Environmental Microbiology. 71, 4628-4637 (2005).

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