إنشاء الابتدائية الثقافات الليفية الكبار من القوارض

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

توضح هذه المقالة بروتوكول للعزلة وصيانة الثقافات الليفية الأولية من الجلد وأنسجة الرئة من القوارض البرية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

أهمية استخدام الخلايا الأولية ، بدلا من خطوط الخلايا السرطانية ، للدراسات البيولوجية أصبح من المسلم به على نطاق واسع. ويفضل الخلايا الأولية في دراسات الخلايا دورة الخلية ، والسيطرة ، وإصلاح الحمض النووي ، كما الخلايا السرطانية تحمل طفرات في الجينات المسؤولة عن هذه العمليات. لا يمكن أن يكون مثقف الخلايا الأولية اجل غير مسمى بسبب ظهور الشيخوخة أو تنسخي aneuploidization. وبالتالي ، ثقافات جديدة تدعو الحاجة إلى وضع بانتظام. راسخة الإجراء لعزل الخلايا الليفية القوارض الجنينية ، ولكن عزل الثقافات الليفية الكبار غالبا ما يقدم تحديا. قد الليفية القوارض الكبار معزولة عن نماذج الماوس من الأمراض التي تصيب الإنسان تكون السيطرة المفضل عند مقارنتها الليفية من المرضى من البشر. علاوة على ذلك ، لا أخلاقي الليفية هي المادة الوحيدة المتاحة عند العمل مع القوارض البرية التي لا يمكن فيها الإناث الحوامل يمكن الحصول عليها بسهولة. هنا نقدم بروتوكول للعزلة وثقافة الليفية الكبار من القوارض الجلد والرئتين. استخدمنا هذا الإجراء بنجاح لعزل الخلايا الليفية من أكثر أنواع القوارض العشرين من الفئران والجرذان المختبرية على القوارض البرية مثل القندس ، النيص ، والسنجاب.

Protocol

1. قبل بدء

  1. مقص وملقط تعقيم مع الايثانول 70 ٪.
  2. مكان مغناطيسي صغير داخل دورق 30 مل ، وتغطي مع اثنين من طبقات من احباط ، وموصدة.
  3. إعداد 28 وحدة ونش / مل محلول المخزون من Blendzyme Liberase 3 في الماء المعقم. جعل aliquots 0.5 مل والتجميد في -20 درجة مئوية. أذاب a قسامة جديدة قبل كل استخدام. قد يبدو الحل غائما بعد الذوبان. دوامة الحل حتى يصبح واضحا.
  4. الاحماء وسائل الإعلام ثقافة الخلية.

2. تحضير العينة الحيوانية

الحذر : قد تحتوي على الحيوانات البرية مسببات الأمراض مثل فيروس داء الكلب. أن يكون دائما على بينة من الأدوات الحادة مفتوحة.

  1. الموت ببطء والحيوانية ووضع الجثة في 4 درجات مئوية. فمن الأفضل لاستخدام الجثة على الفور ، ولكن ، إذا كان هذا ليس عمليا كما لو يتم جمع الحيوانات في الميدان ، قد يتم استخدام جثث خلال 24 ساعة. بعد 24 ساعة على هبوط العائد الخلية.
  2. تشريح الحيوان في الجناح الجراحي أو الكيميائي في غطاء محرك السيارة (وليس في الغطاء زراعة الأنسجة).
  3. منطقة الإبط هو موقع مناسب لجمع عينات من الجلد تحت الإبط والجلد أرق ، ويحتوي على كميات اقل من الدهون ، والفراء هو أقل كثافة. تنظيف الموقع مع شق الايثانول 70 ٪. تأكد من غارقة الفراء مع الايثانول.
  4. حلق الفراء حول موقع شق مع مشرط حاد. حلق مساحة أكبر من موقع شق المطلوب. في محاولة لتقليل التخفيضات على الجلد. رش المنطقة مع 70 ٪ من الإيثانول واتركها لتجف.
  5. لجمع المكوس عينة الجلد جزء من حوالي 1 سم 2. قرصة الجلد مع ملقط الأنسجة ، وقطع مع مقص. ليس محاولة لخفض طبقة الدهون مع الجلد ، والدهون كما يتداخل مع عملية الهضم كولاجيناز. لجمع عينات من الرئة ، وغسل منطقة الصدر مع الايثانول 70 ٪ ، وفتح الجلد على صدره مع مقص عن طريق شق تي الشكل وسحب اللوحات بعيدا من الجلد. غسل المنطقة العضلات مع فتح 70 ٪ من الإيثانول وترك الجافة. قطع القفص الصدري باستخدام ملقط معقم والمقص (استخدام قواطع العظام للحصول على أكبر الحيوانات). استخدام تقنيات معقمة لتجنب تلويث الأعضاء الداخلية. لا تلمس الأعضاء الداخلية مع الصكوك التي مست فراء الحيوانات. قطع شظايا من الرئة حوالي 1 سم 2 باستخدام ملقط معقم والمقص.
  6. شظايا الأنسجة مكان في 50 مل من الأنابيب مع برنامج تلفزيوني العقيمة لتجنب الجفاف.
  7. غسل السطح الخارجي للأنابيب سعة 50 مل مع شظايا الأنسجة مع الإيثانول ، وأخذها إلى الأنسجة هود الثقافة.
  8. التخلص السليم من الذبيحة.

3. استخراج خلايا

  1. نقل الأنسجة شظايا في صحن 10 سم زراعة الأنسجة باستخدام مشرط معقم. لا نقل تلفزيوني مع الكثير من العينة.
  2. قطع الانسجة الى قطع ~ 1 ملم باستخدام اثنين من المشارط. استخدام اثنين من ريش باستخدام مقص العمل بدءا من الوسط وسحب إربا. الحفاظ على النسيج حتى تكور ، لا قطع قطعة قطعة. عندما قطع كافية في الجلد تشبه المعجون ، فإنه لن الى قطع منفصلة ولكنها ستمتد رقيقة. نسيج الرئة هو أسهل لقطع ، وأنه سيفصل الى قطع صغيرة.
  3. باستخدام مشرط ، ونقل الأنسجة يقتطع العقيمة الدورق 30 مل بقضيب العقيمة. غسل لوحة تستخدم لقطع الأنسجة مع 10 مل من وسائل الاعلام مع وحدات DMEM/F12 ونش 0.14 / مل Liberase Blendzyme 3 ، والمضادات الحيوية 1X / مضاد فطري ، وإضافة إلى حل الدورق 30 مل مع شظايا الأنسجة.
  4. تغطية كأس بورق العقيمة ، واحتضان عند 37 درجة مئوية ، واثارة ببطء ، لمدة 30 إلى 90 دقيقة. طول الحضانة يعتمد على نوع ونوع الأنسجة. الحرص على عدم الإفراط في هضم الأنسجة. ويتم الحصول على أفضل غلة عندما الأنسجة شظايا لا تزال موجودة في نهاية عملية الهضم. الجلد يستغرق وقتا أطول للهضم من الرئة. الجلد من الحيوانات الكبيرة وقتا أطول لهضمها. التحقق من عملية الهضم بعد 30 دقيقة ، ومن ثم كل 10 دقيقة. عند اكتمال عملية الهضم الجلد ، وسائل الإعلام يصبح غائما وشظايا الجلد منفصلة عن بعضها البعض ، وحواف القطع تصبح "غامض". يجب أن تتوقف عملية الهضم الرئة عند تغيير لون الرئة شظايا من الأحمر إلى الأبيض والبدء في تشكيل الألياف اللزجة.
  5. الماصة في محلول يحتوي على شظايا النسيج صعودا وهبوطا لكسر كتل. الحل لنقل أنبوب 50 مل العقيمة. إذا كانت شظايا التحرك بسهولة من خلال قطع ماصة 10 مل والهضم وحسنا فعلت. شطف الكأس 3 مرات مع 10 مل من وسائل الاعلام DMEM/F12 FBS دافئة مع 15 ٪ ، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري وإضافة وسائل الإعلام للأنبوب 50 مل مع شظايا الأنسجة. إغلاق أنبوب 50 مل وتخلط بواسطة انقلاب عدة مرات. سوف FBS في وسائل الاعلام وقف Liberase الهضم.
  6. تدور في 524 غرام في جهاز للطرد المركزي دلو يتأرجح زراعة الأنسجة لمدة 5 دقائق. إزالة طاف. Resuspend وبيليه في 10 مل من وسائل الاعلام DMEM/F12 FBS دافئة مع 15 ٪ ، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري. الماصة مع تعليقأقصى قوة لكسر قطعة النسيج.
  7. إضافة آخر 30 مل من وسائل الاعلام مع DMEM/F12 FBS 15 ٪ ، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري ، ومزيج الطرد المركزي في 524 غرام في جهاز للطرد المركزي دلو يتأرجح زراعة الأنسجة لمدة 5 دقائق. أكرر مرة أخرى لإزالة آثار Liberase.
  8. Resuspend وبيليه في 10 مل من وسائل الاعلام مع DMEM/F12 FBS 15 ٪ ، 1X مضاد حيوي / مضاد فطري ونقل إلى صحن 10 سم ومكان زراعة الأنسجة في نسيج الثقافة الحاضنة في 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 ، O 2 3 ٪ .
  9. الاختيار لوحات كل يوم لالليفية واللون وسائل الإعلام. إذا كانت العزلة قد تمت بنجاح ، الليفية الزحف للخروج من شظايا الأنسجة ونعلق على لوحة (الشكل 1). وتبدأ الخلايا الليفية للخروج شظايا الأنسجة في غضون 2-5 أيام.
  10. إذا كان يتغير لونه إلى الأصفر وسائل الإعلام ، وهذا يشير إلى تلوث محتمل أو اكتظاظ الزنازين. فحص لوحات تحت المجهر في التكبير عالية. إذا البكتيريا والفطريات والديدان أو تجاهل الحاضر لوحات (وهذا نادرا ما يكون مسألة مع حيوانات المختبر ، ولكن قد تحدث عندما يتم جمع عينات من البرية). إذا لم يحصل أي تلوث موجود ولكن وسائل الإعلام تغيير اللون ، ويتسبب هذا إما عن طريق العديد من الخلايا أو الأنسجة شظايا كثيرة جدا وضعت في طبق واحد. إذا شملت أكثر من 60 ٪ من لوحة من قبل الليفية المرفقة ، وتغير وسائل الاعلام على لوحة ونقل شظايا الأنسجة لوحة جديدة مع وسائل الإعلام الجديدة. إن لم يكن الكثير من الخلايا الليفية التي تعلق على لوحة ، وتغيير وسائل الإعلام وتقسيم قطعة نسيج لوحات 2-4.
  11. بعد 7 أيام ، إن وسائل الإعلام لم تتغير في وقت سابق ، وتغير وسائل الإعلام ونقل شظايا الأنسجة لوحة جديدة مع وسائل الإعلام الجديدة.
  12. احتضان خلايا الأنسجة وشظايا ل7 أيام إضافية. قبل 14 يوما قد خرجت عن الليفية قابلة للحياة شظايا الأنسجة.
  13. بعد 14 يوما من بداية العزلة الخلية ، تجاهل وسائل الإعلام القديمة وشظايا الأنسجة والخلايا والحصاد لوحة لهم على طبق من جديد في خلايا 5x10 5 / EMEM وحة FBS مع 15 ٪ ، 1X البنسلين / الستربتوميسين وغير الأحماض الأمينية الأساسية والبيروفات الصوديوم. وسائل الإعلام EMEM دعم نمو الخلايا الليفية أنواع الخلايا الأخرى فقط ، وسوف يموت أو وقف الانتشار.
  14. بعد الوصول إلى نقطة التقاء الخلايا 80-90 ٪ ، وتجميد an قسامة من الخلايا لاستخدامها في المستقبل.
  15. مواصلة زراعة الخلايا من خلال تقسيمها إلى خلايا 5x10 5 / لوحة عندما تصل خلايا التقاء 80-90 ٪.

4. ممثل النتائج

الخلايا الليفية هي خلايا طبيعية واسعة مع نتوءات بارزة (lamellipodia) (الشكل 2). الليفية تنمو في أحادي الطبقة. ثقافة صحية متزايدة يحتوي على خلايا 1-10 ٪ في المرحلة M ، كما اعترفت تقريب خلايا مرتفعة على سطح اللوحة ، ولكن ليس بمعزل عن لوحة (الشكل 3). عادة ، طبق 10 سم مع خلايا المصنف 5 5x10 تصبح متكدسة في 3-4 أيام. الوقت مضاعفة يختلف كثيرا بين الأنواع ، وربما تكون أكبر بالنسبة لبعض أنواع القوارض طويلة الأمد 1. عندما الخلايا ملء طبق يعتقلون الانتشار في المرحلة G1. لوحة متموجة نموذجي يحتوي على الخلايا الليفية طبقة من الخلايا معبأة بإحكام (الشكل 4). عندما تصل إلى نقطة التقاء الخلايا 90 ٪ انهم مستعدون لتقسيم. إذا رغبت في ذلك ، يمكن الحفاظ على الخلايا على لوحة an متموجة اعتقلوا لفترات طويلة من الزمن مع التغيرات وسائل الاعلام العادية (مرة أو مرتين في الأسبوع).

الشكل 1
الشكل 1. تم تغيير العزلة الليفية من جلد الفأر (A) والرئة (B) ، وسائل الإعلام لإزالة الخلايا غير مرتبط والحطام قبل اتخاذ الصور على يوم واحد 7.

الشكل 2
الشكل 2. الليفية الماوس الرئة.

الشكل 3
الشكل 3. حقل من الخلايا الليفية تحتوي على خلايا الفأر في مرحلة - M وتصويرها على التكبير 10x.

الشكل 4
الشكل 4. صفيحة متموجة من الخلايا الليفية الماوس وتصويرها على التكبير 10x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الليفية الأولية الطبيعية تقدم بديلا ممتازا لإنشاء خطوط الخلايا السرطانية في مجال البحوث البيولوجية. ميزة هامة من الخلايا الليفية هو أنها لا تحمل طفرات في الجينات المسرطنة والمكثفات ورم سليمة والحفاظ على نقاط التفتيش دورة الخلية. وهذا يجعل الخلايا الليفية العادي يفضل نظاما للدراسات لتنظيم دورة الخلية ، وإصلاح الحمض النووي ، وموت الخلايا المبرمج. بروتوكول الموصوفة هنا يقدم وصفة بسيطة للعزلة وصيانة الليفية الأولية. وقد استخدم هذا البروتوكول لعزل الخلايا الليفية بنجاح لأكثر من 20 نوعا من القوارض.

فمن المهم للحفاظ على عقم في جميع الأوقات عند التعامل مع الثقافات الخلية لتجنب التلوث. إذا كان مختبر الثقافات أيضا خطوط الخلايا السرطانية عدوانية مثل خلايا هيلا ، ينبغي التعامل معها بشكل منفصل الليفية من خلايا السرطان. ويفضل أن يكون لها غطاء محرك السيارة المعينة وحاضنة للثقافات الابتدائي.

فمن الأفضل للحفاظ على ثقافات الخلية الأساسية في تركيز الأوكسجين الفسيولوجية من 3 ٪. الغلاف الجوي (20 ٪) الأكسجين يقصر عمر الثقافات ويزيد الاكسدة. الليفية الماوس حساسة لالاكسدة وسوف senesce أو أدخل الأزمة في غضون 14 ~ الأضعاف السكان عندما حافظت على 20 ٪ (الغلاف الجوي) الأوكسجين. يمكن الحفاظ على الخلايا الليفية الماوس إلى أجل غير مسمى في 2 الأكسجين 3 ٪.

دائما سجل عدد السكان تضاعف من الثقافات. الأنواع الكبيرة (كتلة الجسم فوق 8000 ز) من المرجح أن يحمل تنسخي الشيخوخة ، وسوف يكون له عمر محدود في الثقافة ، وحتى في الأكسجين 3 ٪ 1. والخلايا من أصغر الأنواع ، مثل الفئران والجرذان ، وتنتشر إلى أجل غير مسمى في الأكسجين 3 ٪ ، ولكنها قد تصبح في نهاية المطاف مختل الصيغة الصبغية. إذا كان ذلك ممكنا ، بدء التجارب باستخدام الخلايا إلى مضاعفة السكانية المنخفضة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

نشكر الدكتور ستيفن Austad لتزويدنا النسخة الأولى من هذا البروتوكول. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة الطبية لVG إليسون وAS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 media Invitrogen 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified Invitrogen 01437-036 The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic Invitrogen 15420-096
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Liberase TM Research Grade Roche 05401127001 Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media ATCC 30-203 The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel Multiple suppliers
Three Gas Control incubator Forma or Heraeus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
  2. Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).

Comments

29 Comments

  1. Very helpful protocol. Got it working at the very first try, Would highly recommend the protocol.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 14, 2012 - 5:10 PM
  2. I have recently isolated fibroblasts from fresh fibrotic human lung. I used collagenase and plated the cells via your protocol. the cells seem to be of ² populations: one is long (²0% of plate) typical of fibroblast but the other cells are round. They look like they just started to adhere to the plate. What cells could these be? Is this happen often? COuld they be a subset of fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 4, 2012 - 9:33 AM
  3. Hi
    The round cells are epithelial cells that always accompany lung fibroblast isolation. These cells will just float. After you switch the media to EMEM (mentioned in Step 13) and start splitting the fibroblasts, these cells will go away.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:11 PM
  4. I have used your protocol successfully before on human lung tissue. However this time, the majority of our cells were epithelial- look very much like keritanocytes. Is there something we could do to only keep the fibroblasts growing- change to MEM media?
    Also, the next time we try this protocol, is there anything we can do to not get so many epithelial cells?WIll be happy for any suggestions. Thanks.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 5, 2012 - 8:14 AM
  5. Hi Barbara,
    We always get the round epithelial cells during our lung fibroblast isolation too. When you switch to EMEM media and start splitting the fibroblasts, they will be selected for and the epithelial cells will be lost.
    Next time you try the protocol, you can use EMEM media for the whole isolation procedure instead of DMEM/F1² to minimize the epithelial cells you get. But the trade-off is that the efficiency of isolation might decrease. Good luck.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:15 PM
  6. A note from the authors:
    Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3, they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 054011²7001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:31 PM
  7. Thank you so much for your reply. I split them yesterday and changed the media to MEM.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 6, 2012 - 7:35 AM
  8. What is the best way to remove tissue peices on day 7? Especially with the larger tissue peices, ones that you can clearly see, produce more epithelial cells, where as the small peices (as in your pictures) produce mostly pure fibroblasts. Also, do you transplant the tissues on day 7 regardless of the confluency of your plate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:59 AM
  9. On day 7, we gently aspirate the supernatant (with the tissue pieces) with a pipette, transfer it to a new plate and provide the original plate with fresh media. In this way, the small pieces attached to the plate are not disturbed and the other tissue debris with the potential to give out more fibroblasts can do so on a new plate.
    Also, yes, it is a good idea to transfer the tissues on a new plate on day 7.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 3:43 PM
  10. When you trypsinize initially, do you do this aggressively and try to remove all the cells from the plate (fibroblast and epithelial)? I have found that the fibroblasts seem to trypsinize first and can thus help to purify the culture, but my cell yield is significantly smaller (too small). Thank you for you help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:05 PM
  11. The first trypsinization dŒs not have to be aggressive. As long as all the fibroblasts are off the plate and floating, we dont worry about the epithelial cells. They usually disappear after the first couple of passages with EMEM media. The fibroblasts are fast growing and will be selected for with passaging.
    To improve the yield, I would suggest ² things in the isolation procedure : Mincing the tissue very well and incubating the tissue pieces for a longer time in the Collagenase enzyme (while taking care to avoid over-digestion).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:18 PM
  12. You recommend storing 0.5 mL aliquots of Blendzyme at ²8 units/ml (i.e. 14 wunsch units per aliquot) but you recommend using 0.14 units/ml in 10 mls of media, or 1.4 wunsch units per digestion) This implies each aliquot is for 10 digestions. Is this correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 10:59 AM
  13. Yes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 11:04 AM
  14. After 14 days I achieve confluence and then split into fibroblast specific growth media and these cells have no trouble reaching 80-90%. When I subsequently split this population the cells senesce. Is there any obvious reason for this? It would think that 14 days of growth would cause a primary cell to senesce but your protocol suggests that I should be able to continue splitting my cells and further purfy in the process. I appreciate your help!

    Reply
    Posted by: Justin K.
    May 4, 2012 - 10:49 AM
  15. Hi Justin
    Are these mouse fibroblasts? Are you growing them in ²0% oxygen? If you are, then they will senesce. We grow all our cells in 3% oxygen and 5% CO² conditions.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 9, 2012 - 3:06 PM
  16. Hi, one of the first steps recommends to euthanize the animal and store it at 4oC. Do we complete this step even if we plan on using the animal right away? If so, for how long do we store the animal at 4oC? Is putting it on ice also acceptable?

    Reply
    Posted by: J A.
    May 13, 2012 - 7:49 PM
  17. No..It is best to use the animal right away. The 4C step is only if circumstances make it impossible to process it right away. In this case, we store the corpse at 4C(better) or on ice(in case of wild caught animals) for not more than ²4 hours.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 13, 2012 - 7:57 PM
  18. Also, another question I have is about the tissue fragments in the media. When would be the best time to remove them from the cells and replace them with media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 14, 2012 - 12:42 AM
  19. It depends. Usually, if the media turns yellow a few days after isolation and if there aren't enough fibroblasts on the plate, we collect the fragments, suspend them in fresh media and plate them back. As the protocol says, day 14 is when we usually get rid of the tissue fragments.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 14, 2012 - 2:51 PM
  20. Hi,

    I a couple of questions about the reagents used. My first question is about the liberase enzyme used. I noticed that the liberase enzyme 3 from Roche has been discontinued. Would you recommend replacing it with the Liberase TM Research Grade medium enzyme with Thermolysin? If so, would you recommend keeping the concentration the same (.14 U/mL)? My second question is about the Fetal Bovine Serum used in this experiment. I understand that you recommend using the Qualified Fetal Bovine Serum because it has been shown to support the growth of primary fibroblast cultures. In my lab we use heat-inactivated FBS. Would you recommend me switching from heat-inactivated to qualified FBS?

    Thank you in advance for your help :)

    Reply
    Posted by: J A.
    May 21, 2012 - 11:25 AM
  21. Yes. We now use TM instead of Liberase 3 with the same concentration.
    I understand that heat-inactivation of FBS is usually done to get rid of complement factors. I don't know how critical it is for your experiments to do this but we never use heat-inactivated serum.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 3:06 PM
  22. I also have a question about plating the tissue into the media. ²4- hours after I plated my tissue pieces into the media, I looked at my cultures under the microscope and saw little round cells that adhered to the plate. I understand that the protocol mentions that fibroblasts do not typically exit the tissue for at least 48 hours, and the round epithelial cells that assist the growth of fibroblasts usually float through the media. I was just wondering if seeing these cells after ²4 hours is normal.

    Reply
    Posted by: J A.
    May 24, 2012 - 12:59 PM
  23. Yes it is normal, more for lung fibroblast isolation. Once the fibroblasts start growing, the round cells will be selected against.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 2:57 PM
  24. Hi,

    I was wondering what concentration of trypsin EDTA you used? I use trypsin 0.²5% trypsin EDTA to remove my cells during splitting (after an incubation time of 4 minutes). After trypsinizing the cells for 4 minutes, I have noticed that less than half of them are detached from the plate. I am afraid to leave the cells in trypsin for longer than 4 minutes because I do not want to damage them. Any suggestions?

    Reply
    Posted by: J A.
    July 18, 2012 - 1:05 AM
  25. We use Red trypsin with 0.²5% EDTA..Its very strong and we only treat cells with it for 1-² minutes. So you wash/rinse the plate with PBS after aspirating media, before adding trypsin? Because the FBS in the media inhibits trypsin activity and if the plates are not washed with PBS first, trypsin cannot act properly.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    July 18, 2012 - 11:28 AM
  26. Thank you for such detailed procedure. I am curious is it possible that the keratinocytes also exist in the fibroblast culture? Thank you.

    Reply
    Posted by: Hua-Ling C.
    September 19, 2012 - 3:16 AM
  27. Dear all, my adult fibroblasts (GFP positive C67Bl/6 mice) are not growing very well (DMEM, high glucose, Na-pyrovate, Pen/Strp, 15%FBS). Do you have any suggestions about what I could add to the media to increase proliferation? Thanks a lot. Gunnar

    Reply
    Posted by: Gunnar P.
    March 1, 2013 - 2:03 PM
  28. Can this protocol be adapted to isolate cancer-associated fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Wei L.
    July 9, 2013 - 2:59 PM
  29. Do you know what is the best marker to check the purity of mouse lung fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Jenny t.
    July 15, 2014 - 5:02 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics