הקמת ראשיים פיברובלסטים תרבויות למבוגרים מאת מכרסמים

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד ותחזוקה של תרבויות פיברובלסטים העיקרי של העור, רקמת הריאות של מכרסמים בר.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

החשיבות של שימוש תאים ראשוניים, במקום שורות תאים סרטניים, ללימודים ביולוגיים הופך להכרה רחבה. תאים ראשוניים הם העדיפו במחקרים אפופטוזיס של מחזור התא, שליטה, תיקון דנ"א, כמו תאים סרטניים לשאת מוטציות בגנים המעורבים בתהליכים אלה. תאים ראשוניים לא יכול להיות מתורבת ללא הגבלת זמן, בשל תחילת ההזדקנות replicative או aneuploidization. לפיכך, תרבויות חדשות צריכים להיות הוקמה על בסיס קבוע. ההליך עבור בידוד של fibroblasts מכרסם עובריים היא מבוססת היטב, אבל בידוד תרבויות פיברובלסטים מבוגרים לעתים קרובות אתגר. Fibroblasts מכרסם למבוגרים מבודדים מודלים העכבר של מחלות אנושיות יכולה להיות מלאה המועדפת כאשר משווים אותם fibroblasts מחולים האדם. יתר על כן, fibroblasts מבוגר הם חומר זמין רק כאשר עובדים עם מכרסמים בר שבו נשים בהריון לא ניתן להשיג בקלות. כאן אנו מספקים פרוטוקול לבידוד והתרבות של fibroblasts מבוגר מהעור מכרסם והריאות. השתמשנו בהצלחה הליך זה לבודד fibroblasts מתוך למעלה מעשרים מינים מכרסם מעכברים וחולדות מעבדה כדי מכרסמים בר כגון בונה, קיפוד, והסנאי.

Protocol

1. לפני שמתחילים

  1. לעקר מספריים מלקחיים עם אתנול 70%.
  2. המקום stirrer מגנטי קטן בתוך כוס 30 מ"ל, מכסים עם שתי שכבות של נייר, ועל החיטוי.
  3. הכן 28 יחידות וונש / mL מניות פתרון של Liberase Blendzyme 3 במים סטריליים. בצע 0.5 aliquots מ"ל ולהקפיא ב -20 ° C. הפשרה aliquot חדש לפני כל שימוש. הפתרון עשוי להופיע מעונן לאחר ההפשרה. וורטקס הפתרון עד שיתברר.
  4. לחמם את תרבות התקשורת הסלולרי.

2. דוגמה חיה הכנה

זהירות: חיות בר עלולים להכיל פתוגנים כגון וירוס הכלבת. תמיד להיות מודעים לפתוח החדים.

  1. להרדימו והמקום פגר ב 4 ° C. עדיף להשתמש פגר מיד, אולם אם הדבר אינו מעשי כגון אם בעלי החיים שנאספו בשטח, פגרי ניתן להשתמש תוך 24 שעות. לאחר 24 שעות התשואה יורדת התא.
  2. מנתחים את החיה בסוויטה כירורגית או במנדף כימי (לא מכסה המנוע בתרבית רקמה).
  3. אזור בית השחי הוא אתר נוח לאסוף דגימות עור כמו עור בבית השחי הוא רזה, מכיל פחות שומן, פרווה הוא פחות צפוף. נקו את האתר החתך עם אתנול 70%. ודא פרווה ספוגה אתנול.
  4. לגלח את הפרווה סביב האתר חתך באזמל חד. לגלח שטח גדול יותר מאשר באתר החתך הרצוי. נסו לצמצם חתכים בעור. ריסוס באזור עם אתנול 70% ולתת לו להתייבש.
  5. כדי לאסוף דגימת עור בלו שבר כ 1 2 ס"מ. לצבוט את העור עם מלקחיים רקמות, לגזור במספריים. נסו לא לחתוך את שכבת השומן בעור, כמו שומן מפריעה לעיכול collagenase. כדי לאסוף את דגימות ריאה, לשטוף את אזור החזה עם 70% אתנול, ולפתוח את העור על החזה במספריים על ידי ביצוע חתך T-צורתו ומשך לגזרים את דשי של העור. לשטוף את האזור שריר פתחה עם אתנול 70% ולתת להתייבש. חותכים את החזה באמצעות מלקחיים סטריליות ומספריים (חותכי להשתמש עצם לבעלי חיים גדולים יותר). השתמש בטכניקות סטרילי כדי למנוע זיהום האיברים הפנימיים. אל תיגע באיברים פנימיים עם מכשירים נגע פרווה של בעלי חיים. גזור שברי הריאות של כ 1 ס"מ 2 באמצעות מלקחיים סטריליות ומספריים.
  6. רקמה שברי מקום 50 צינורות מ"ל עם PBS סטרילי כדי למנוע התייבשות.
  7. לשטוף החיצוני של 50 מ"ל עם שברי צינורות רקמה עם אתנול, ולקחת אותם אל מכסה המנוע בתרבית רקמה.
  8. כראוי תשליך הפגר החי.

3. מחלץ תאים

  1. מעבירים את שברי רקמה לתוך צלחת 10 ס"מ תרבות רקמות באמצעות אזמל סטרילי. אין להעביר PBS יותר מדי עם המדגם.
  2. חותכים את הרקמה אל ~ 1 מ"מ חלקים באמצעות שני ניתוחים. שימוש שני להבים באמצעות פעולה מספריים החל ממרכז ומושך מזה. שמור את הרקמה כידר, לא לחתוך חתיכה אחר חתיכה. כאשר חותכים את העור די דומה מרק, זה לא יהיה להפריד לחתיכות אבל יהיה למתוח דק. רקמת הריאה קל לחתוך, וזה יהיה להפריד לחתיכות קטנות.
  3. באמצעות אזמל, העברת רקמות וחותכים כוס 30 מ"ל סטרילי עם בר ומערבבים סטרילית. לשטוף את הצלחת המשמש לחיתוך רקמות עם 10 מ"ל של DMEM/F12 התקשורת עם 0.14 יחידות וונש / mL Liberase Blendzyme 3, 1X אנטיביוטי / antimycotic, ולהוסיף הפתרון כוס 30 מ"ל עם שברי הרקמה.
  4. מכסים את הכוס בנייר כסף סטרילי, דגירה על 37 מעלות צלזיוס, תוך בחישה לאט לאט, במשך 30 עד 90 דקות. משך הדגירה תלוי בסוג מינים הרקמה. הקפד לא מעל לעכל את הרקמה. Best התשואות מתקבלים כאשר שברי הרקמה עדיין קיימות בסוף העיכול. העור לוקח זמן רב יותר לעיכול מאשר הריאה. העור מפני בעלי חיים גדולים לוקח יותר זמן לעכל. בדוק את מערכת העיכול לאחר 30 דקות, ולאחר מכן כל 10 דקות. כאשר העור והעיכול יושלם, התקשורת הופכת להיות מעונן ושברי העור נפרדים זה מזה, ואת הקצוות של החלקים להיות "מעורפל". עיכול ריאות יש להפסיק כאשר שברי ריאות לשנות צבע אדום לבן ולהתחיל להרכיב סיבים דביק.
  5. הפתרון Pipet המכיל שברי הרקמה הלוך ושוב כדי לשבור את הגושים. העברת הפתרון שפופרת 50 מ"ל סטרילי. אם השברים לעבור בקלות דרך קיצוץ 10 מ"ל פיפטה והעיכול נעשה היטב. שוטפים את כוס 3 פעמים עם 10 מ"ל של DMEM/F12 מדיה חם עם 15% FBS, 1X אנטיביוטי / antimycotic ולהוסיף את התקשורת הצינור 50 מ"ל עם שברי הרקמה. סגור את שפופרת 50 מ"ל ומערבבים על ידי היפוך כמה פעמים. FBS בתקשורת יפסיק Liberase העיכול.
  6. ספין ב 524 גרם של צנטריפוגה מתנדנד רקמה תרבות דלי דקות 5. הסר את supernatant. Resuspend את הכדור ב 10 מ"ל של DMEM/F12 מדיה חם עם 15% FBS, 1X אנטיביוטי / antimycotic. Pipet ההשעיה עםכוח מרבי לשבור את פיסות רקמה.
  7. הוסף עוד 30 מ"ל של DMEM/F12 התקשורת עם 15% FBS, 1X אנטיביוטי / antimycotic, מערבבים צנטריפוגות ב 524 גרם של צנטריפוגה מתנדנד רקמה תרבות דלי דקות 5. חזור פעם נוספת כדי להסיר את עקבות Liberase.
  8. Resuspend את הכדור ב 10 מ"ל של DMEM/F12 התקשורת עם FBS 15%, 1X אנטיביוטי / antimycotic והעברה צלחת 10 ס"מ רקמה תרבות ומניחים תרבות רקמות החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 3% O 2 .
  9. בדוק את צלחות כל יום במשך fibroblasts וצבע התקשורת. אם הבידוד היה מוצלח, fibroblasts לזחול מתוך שברי רקמות לצרף צלחת (איור 1). פיברובלסטים מתחילים לצאת שברי הרקמה תוך 2-5 ימים.
  10. אם צבע השינויים התקשורת צהובה, זה מצביע על אפשרות של זיהום או הצפיפות של תאים. בדוק את הצלחות מתחת למיקרוסקופ בהגדלה גבוהה. אם חיידקים, פטריות, או תולעים נמצאים להשליך את הלוחות (זה רק לעתים נדירות בעיה עם חיות מעבדה, אך עלולה להתרחש כאשר הדגימות שנאספו בטבע). אם הזיהום לא קיים, אבל התקשורת שינה את צבעו, זו נגרמת על ידי או יותר מדי תאים או רקמות שברים רבים מדי להציב צלחת זהה. אם יותר מ 60% של צלחת מכוסה על ידי fibroblasts המצורף, לשנות את התקשורת על הצלחת ולהעביר את שברי רקמות צלחת חדשה עם המדיה החדשה. אם לא fibroblasts רבים מחוברים לצלחת, לשנות את התקשורת לפצל את פיסות הרקמה ל 2-4 צלחות.
  11. לאחר 7 ימים, אם התקשורת לא שונו קודם לכן, לשנות את התקשורת ולהעביר את שברי רקמות צלחת חדשה עם המדיה החדשה.
  12. דגירה ושברי תאים ורקמות עבור 7 ימים נוספים. ביום 14 כל fibroblasts קיימא יש יצאו שברי הרקמה.
  13. לאחר 14 ימים מתחילת בידוד התא, להשליך את התקשורת הישנה ושברי רקמות, לקצור את התאים צלחת אותם על צלחת חדשה 5x10 5 תאים / EMEM צלחת עם FBS 15%, 1X פניצילין / סטרפטומיצין, ללא חומצות האמינו החיוניות , נתרן pyruvate. התקשורת EMEM יתמכו בצמיחה של fibroblasts סוגי תאים בלבד ושאר ימות או להפסיק מתרבים.
  14. לאחר שהתאים מגיעים מפגש 80-90%, להקפיא aliquot של תאים לשימוש עתידי.
  15. המשך culturing התאים על ידי פיצול אותם 5x10 5 תאים / צלחת כאשר התאים מגיעים מפגש 80-90%.

4. נציג תוצאות

Fibroblasts רגיל הם תאים גדולים עם בליטות בולט (lamellipodia) (איור 2). Fibroblasts לגדול בשכבה. תרבות גדל בריא מכיל תאים 1-10% בשלב M, מוכר מעוגל למעלה כמו תאים מוגבה מעל פני השטח של הצלחת, אך לא מנותקת מן הצלחת (איור 3). בדרך כלל, צלחת 10 ס"מ seeded עם 5 תאים 5x10 הופך ומחוברות בימים 3-4. זמן ההכפלה משתנה מאוד בין המינים, והיא עלולה להיות גדולה יותר עבור כמה מינים חיים ארוכים מכרסם 1. כאשר תאים למלא צלחת עוצרים התפשטות בשלב G1. צלחת ומחוברות אופיינית של fibroblasts מכיל שכבה של תאים צפופים (איור 4). כאשר התאים מגיעים מפגש 90% הם מוכנים פיצול. אם תרצה, התאים יכול להישמר על צלחת ומחוברות נעצר לפרקי זמן קבוע עם שינויים המדיה (פעם או פעמיים בשבוע).

איור 1
באיור 1. בידוד פיברובלסטים מהעור העכבר (א) ו - ריאה (B). התקשורת שונתה כדי להסיר תאים פנויים ופסולת לפני לקיחת תמונות ביום 7.

איור 2
איור 2. ריאה עכבר fibroblasts.

איור 3
איור 3. שדה של fibroblasts העכבר המכיל תאים בשלב-M, צילם בהגדלה של 10X.

איור 4
איור 4. צלחת ומחוברות של fibroblasts העכבר, צילם בהגדלה של 10X.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fibroblasts העיקרי רגיל לספק חלופה מצוינת הוקמה שורות תאים סרטניים מחקר ביולוגי. יתרון חשוב של fibroblasts היא שהם אינם נושאים מוטציות אונקוגנים ו מדכאי הגידול במחזור לשמור על שלמות התא מחסומים. זה עושה fibroblasts נורמלי מערכת המועדפת עבור המחקרים של ויסות מחזור התא, תיקון DNA, אפופטוזיס. פרוטוקול המתואר כאן מציע מתכון פשוט עבור בידוד ותחזוקה של fibroblasts העיקרי. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לבודד fibroblasts מעל 20 מינים של מכרסמים.

חשוב לשמור על סטריליות בכל עת כאשר עובדים עם תרביות תאים, כדי למנוע זיהום. אם המעבדה גם תרביות תאים סרטניים קווים אגרסיביים כגון תאים הלה, fibroblasts יש לטפל בנפרד תאים סרטניים. הוא העדיף להיות מכסה המנוע המיועד מדגרה תרבויות העיקרי.

עדיף לשמור על תרביות תאים העיקרי בריכוז החמצן הפיזיולוגי של 3%. האטמוספירה (20%) החמצן מקצרת את תוחלת החיים של תרבויות ומגבירה סטרס חמצוני. Fibroblasts עכבר רגישים סטרס חמצוני ויהיה להזדקן או להיכנס למשבר בתוך ~ 14 הכפלות האוכלוסייה כאשר שמר על% 20 (אטמוספרי) חמצן. Fibroblasts עכבר יכול להישמר לנצח ב 2 חמצן 3%.

תמיד לשמור תיעוד של מספר הכפלת אוכלוסיית התרבויות. מינים גדולים (מסת גוף מעל 8,000 גרם) צפויים להציג הזדקנות replicative, ויהיה יש תוחלת חיים מוגבלת בתרבית, אפילו חמצן 3% 1. תאים ממינים קטנים יותר, כגון עכברים וחולדות, יתרבו ללא הגבלת זמן בכל חמצן 3%, אך הוא עשוי בסופו של דבר להפוך aneuploid. במידת האפשר, להתחיל את הניסויים באמצעות תאים על הכפלת האוכלוסייה נמוכה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

אנו מודים ד"ר סטיבן Austad למתן אותנו עם הגרסה הראשונה של פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH ו הרפואי אליסון קרן אל VG ו AS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 media Invitrogen 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified Invitrogen 01437-036 The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic Invitrogen 15420-096
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Liberase TM Research Grade Roche 05401127001 Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media ATCC 30-203 The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel Multiple suppliers
Three Gas Control incubator Forma or Heraeus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
  2. Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).

Comments

29 Comments

  1. Very helpful protocol. Got it working at the very first try, Would highly recommend the protocol.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 14, 2012 - 5:10 PM
  2. I have recently isolated fibroblasts from fresh fibrotic human lung. I used collagenase and plated the cells via your protocol. the cells seem to be of ² populations: one is long (²0% of plate) typical of fibroblast but the other cells are round. They look like they just started to adhere to the plate. What cells could these be? Is this happen often? COuld they be a subset of fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 4, 2012 - 9:33 AM
  3. Hi
    The round cells are epithelial cells that always accompany lung fibroblast isolation. These cells will just float. After you switch the media to EMEM (mentioned in Step 13) and start splitting the fibroblasts, these cells will go away.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:11 PM
  4. I have used your protocol successfully before on human lung tissue. However this time, the majority of our cells were epithelial- look very much like keritanocytes. Is there something we could do to only keep the fibroblasts growing- change to MEM media?
    Also, the next time we try this protocol, is there anything we can do to not get so many epithelial cells?WIll be happy for any suggestions. Thanks.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 5, 2012 - 8:14 AM
  5. Hi Barbara,
    We always get the round epithelial cells during our lung fibroblast isolation too. When you switch to EMEM media and start splitting the fibroblasts, they will be selected for and the epithelial cells will be lost.
    Next time you try the protocol, you can use EMEM media for the whole isolation procedure instead of DMEM/F1² to minimize the epithelial cells you get. But the trade-off is that the efficiency of isolation might decrease. Good luck.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:15 PM
  6. A note from the authors:
    Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3, they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 054011²7001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:31 PM
  7. Thank you so much for your reply. I split them yesterday and changed the media to MEM.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 6, 2012 - 7:35 AM
  8. What is the best way to remove tissue peices on day 7? Especially with the larger tissue peices, ones that you can clearly see, produce more epithelial cells, where as the small peices (as in your pictures) produce mostly pure fibroblasts. Also, do you transplant the tissues on day 7 regardless of the confluency of your plate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:59 AM
  9. On day 7, we gently aspirate the supernatant (with the tissue pieces) with a pipette, transfer it to a new plate and provide the original plate with fresh media. In this way, the small pieces attached to the plate are not disturbed and the other tissue debris with the potential to give out more fibroblasts can do so on a new plate.
    Also, yes, it is a good idea to transfer the tissues on a new plate on day 7.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 3:43 PM
  10. When you trypsinize initially, do you do this aggressively and try to remove all the cells from the plate (fibroblast and epithelial)? I have found that the fibroblasts seem to trypsinize first and can thus help to purify the culture, but my cell yield is significantly smaller (too small). Thank you for you help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:05 PM
  11. The first trypsinization dŒs not have to be aggressive. As long as all the fibroblasts are off the plate and floating, we dont worry about the epithelial cells. They usually disappear after the first couple of passages with EMEM media. The fibroblasts are fast growing and will be selected for with passaging.
    To improve the yield, I would suggest ² things in the isolation procedure : Mincing the tissue very well and incubating the tissue pieces for a longer time in the Collagenase enzyme (while taking care to avoid over-digestion).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:18 PM
  12. You recommend storing 0.5 mL aliquots of Blendzyme at ²8 units/ml (i.e. 14 wunsch units per aliquot) but you recommend using 0.14 units/ml in 10 mls of media, or 1.4 wunsch units per digestion) This implies each aliquot is for 10 digestions. Is this correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 10:59 AM
  13. Yes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 11:04 AM
  14. After 14 days I achieve confluence and then split into fibroblast specific growth media and these cells have no trouble reaching 80-90%. When I subsequently split this population the cells senesce. Is there any obvious reason for this? It would think that 14 days of growth would cause a primary cell to senesce but your protocol suggests that I should be able to continue splitting my cells and further purfy in the process. I appreciate your help!

    Reply
    Posted by: Justin K.
    May 4, 2012 - 10:49 AM
  15. Hi Justin
    Are these mouse fibroblasts? Are you growing them in ²0% oxygen? If you are, then they will senesce. We grow all our cells in 3% oxygen and 5% CO² conditions.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 9, 2012 - 3:06 PM
  16. Hi, one of the first steps recommends to euthanize the animal and store it at 4oC. Do we complete this step even if we plan on using the animal right away? If so, for how long do we store the animal at 4oC? Is putting it on ice also acceptable?

    Reply
    Posted by: J A.
    May 13, 2012 - 7:49 PM
  17. No..It is best to use the animal right away. The 4C step is only if circumstances make it impossible to process it right away. In this case, we store the corpse at 4C(better) or on ice(in case of wild caught animals) for not more than ²4 hours.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 13, 2012 - 7:57 PM
  18. Also, another question I have is about the tissue fragments in the media. When would be the best time to remove them from the cells and replace them with media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 14, 2012 - 12:42 AM
  19. It depends. Usually, if the media turns yellow a few days after isolation and if there aren't enough fibroblasts on the plate, we collect the fragments, suspend them in fresh media and plate them back. As the protocol says, day 14 is when we usually get rid of the tissue fragments.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 14, 2012 - 2:51 PM
  20. Hi,

    I a couple of questions about the reagents used. My first question is about the liberase enzyme used. I noticed that the liberase enzyme 3 from Roche has been discontinued. Would you recommend replacing it with the Liberase TM Research Grade medium enzyme with Thermolysin? If so, would you recommend keeping the concentration the same (.14 U/mL)? My second question is about the Fetal Bovine Serum used in this experiment. I understand that you recommend using the Qualified Fetal Bovine Serum because it has been shown to support the growth of primary fibroblast cultures. In my lab we use heat-inactivated FBS. Would you recommend me switching from heat-inactivated to qualified FBS?

    Thank you in advance for your help :)

    Reply
    Posted by: J A.
    May 21, 2012 - 11:25 AM
  21. Yes. We now use TM instead of Liberase 3 with the same concentration.
    I understand that heat-inactivation of FBS is usually done to get rid of complement factors. I don't know how critical it is for your experiments to do this but we never use heat-inactivated serum.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 3:06 PM
  22. I also have a question about plating the tissue into the media. ²4- hours after I plated my tissue pieces into the media, I looked at my cultures under the microscope and saw little round cells that adhered to the plate. I understand that the protocol mentions that fibroblasts do not typically exit the tissue for at least 48 hours, and the round epithelial cells that assist the growth of fibroblasts usually float through the media. I was just wondering if seeing these cells after ²4 hours is normal.

    Reply
    Posted by: J A.
    May 24, 2012 - 12:59 PM
  23. Yes it is normal, more for lung fibroblast isolation. Once the fibroblasts start growing, the round cells will be selected against.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 2:57 PM
  24. Hi,

    I was wondering what concentration of trypsin EDTA you used? I use trypsin 0.²5% trypsin EDTA to remove my cells during splitting (after an incubation time of 4 minutes). After trypsinizing the cells for 4 minutes, I have noticed that less than half of them are detached from the plate. I am afraid to leave the cells in trypsin for longer than 4 minutes because I do not want to damage them. Any suggestions?

    Reply
    Posted by: J A.
    July 18, 2012 - 1:05 AM
  25. We use Red trypsin with 0.²5% EDTA..Its very strong and we only treat cells with it for 1-² minutes. So you wash/rinse the plate with PBS after aspirating media, before adding trypsin? Because the FBS in the media inhibits trypsin activity and if the plates are not washed with PBS first, trypsin cannot act properly.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    July 18, 2012 - 11:28 AM
  26. Thank you for such detailed procedure. I am curious is it possible that the keratinocytes also exist in the fibroblast culture? Thank you.

    Reply
    Posted by: Hua-Ling C.
    September 19, 2012 - 3:16 AM
  27. Dear all, my adult fibroblasts (GFP positive C67Bl/6 mice) are not growing very well (DMEM, high glucose, Na-pyrovate, Pen/Strp, 15%FBS). Do you have any suggestions about what I could add to the media to increase proliferation? Thanks a lot. Gunnar

    Reply
    Posted by: Gunnar P.
    March 1, 2013 - 2:03 PM
  28. Can this protocol be adapted to isolate cancer-associated fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Wei L.
    July 9, 2013 - 2:59 PM
  29. Do you know what is the best marker to check the purity of mouse lung fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Jenny t.
    July 15, 2014 - 5:02 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics