Gründung Primary Adult Fibroblastenkulturen von Nagetieren

Biology

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Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für die Isolierung und Instandhaltung von Fibroblastenkulturen von Haut-und Lungengewebe von wilden Nagetieren.

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Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).

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Abstract

Die Bedeutung der Verwendung von primären Zellen, anstatt Krebszelllinien, für biologische Studien wird immer weithin anerkannt. Primäre Zellen sind in Studien der Kontrolle des Zellzyklus, Apoptose bevorzugt, und die DNA-Reparatur, wie Krebszellen Mutationen in Genen, die an diesen Prozessen beteiligt sind. Primäre Zellen kann nicht unbegrenzt durch das Einsetzen der replikativen Seneszenz oder aneuploidization kultiviert werden. Daher müssen neue Kulturen regelmäßig ermittelt werden. Das Verfahren zur Isolierung von Nagetier embryonalen Fibroblasten ist gut etabliert, aber isoliert Erwachsenen Fibroblastenkulturen oft eine Herausforderung. Adult Nagetier Fibroblasten aus Mausmodellen menschlicher Erkrankungen isoliert kann eine bevorzugte gesteuert werden, wenn man sie zu Fibroblasten aus menschlichen Patienten. Darüber hinaus sind erwachsene Fibroblasten die einzige verfügbare Material bei der Arbeit mit wilden Nagetieren, wo schwangere Frauen nicht leicht erhalten werden kann. Hier bieten wir ein Protokoll für die Isolierung und Kultivierung von adulten Fibroblasten von Nagern Haut und Lunge. Wir haben dieses Verfahren erfolgreich an Fibroblasten aus über zwanzig Nagetieren isoliert vom Labor Mäusen und Ratten zu wilden Nagetieren wie Biber, Stachelschwein und Eichhörnchen.

Protocol

1. Vor dem Start

  1. Sterilisieren Schere und Pinzette mit 70% Ethanol.
  2. Legen Sie kleine Magnetrührer in einem 30 mL Becherglas mit zwei Lagen Folie, und Autoklaven zu decken.
  3. Bereiten Sie eine 28 Wunsch-Einheiten / ml Stammlösung von Liberase Blendzyme 3 in sterilem Wasser. Machen Sie 0,5 ml und bei -20 ° C. Tauwetter ein neues Aliquot vor jedem Einsatz. Die Lösung kann trübe aussehen nach dem Auftauen. Vortex die Lösung, bis es klar wird.
  4. Warm up den Zellkulturmedien.

2. Tierische Probenvorbereitung

Achtung: wilde Tiere können Krankheitserreger enthalten wie eine Tollwut-Virus. Achten Sie immer auf offene spitze oder scharfe Gegenstände.

  1. Euthanize das Tier und Ort der Karkasse bei 4 ° C. Es ist am besten auf die Karkasse sofort zu verwenden, aber wenn dies nicht praktikabel ist, wie wenn die Tiere in dem Gebiet sind, können die die Kadaver innerhalb von 24 Stunden verwendet werden. Nach 24 Stunden Zellausbeute abnimmt.
  2. Präparieren Sie die Tiere in den OP oder in der chemischen Kapuze (nicht in der Gewebekultur Kapuze).
  3. Unterarm-Bereich ist eine praktische Website, um Hautproben sammeln, wie Achsel-Haut ist dünner, enthält weniger Fett und das Fell ist weniger dicht. Reinigen Sie die Inzisionsstelle mit 70% Ethanol. Stellen Sie sicher, das Fell mit Ethanol getränkt wird.
  4. Shave das Fell rund um die Inzisionsstelle mit einem scharfen Skalpell. Shave eine größere Fläche als die gewünschte Inzisionsstelle. Versuchen Sie, Schnitte an der Haut zu minimieren. Spray Bereich mit 70% Ethanol und trocknen lassen.
  5. Zum Sammeln einer Hautprobe Verbrauchsteuern ein Fragment von ca. 1 cm 2. Drücken Sie die Haut mit dem Gewebe einer Pinzette und schneiden mit der Schere. Versuchen Sie nicht, die Fettschicht der Haut abgeschnitten, als Fett stört Kollagenaseverdau. Zum Sammeln der Lunge Proben, waschen Sie die Brust mit 70% Ethanol, und öffnen Sie die Haut auf der Brust mit einer Schere, indem sie eine T-Form Schnitt-und Auseinanderziehen der Klappen der Haut. Waschen Sie die geöffneten Muskel-Bereich mit 70% Ethanol und trocknen lassen. Schneiden Sie den Brustkorb mit einer sterilen Pinzette und Schere (Verwendung Knochenfräser für größere Tiere). Verwenden Sie sterile Techniken zur Vermeidung einer Kontamination der inneren Organe. Berühren Sie nicht die inneren Organe mit Instrumenten, die das Tier Fell berührt. Cut Lunge Fragmente von etwa 1 cm 2 mit einer sterilen Pinzette und Schere.
  6. Legen Sie Gewebestücke in 50 ml-Röhrchen mit sterilem PBS Austrocknen zu verhindern.
  7. Waschen Sie die außerhalb der 50-ml-Tuben mit Gewebestücke mit Ethanol, und nehmen sie auf die Gewebekultur Kapuze.
  8. Richtig tierischen Kadaver zu entsorgen.

3. Extrahieren Cells

  1. Übertragen Sie die Gewebestücke in einen 10 cm Gewebe Kulturschale mit sterilen Skalpell. Übertragen Sie keine zu viel PBS mit der Probe.
  2. Schneiden Sie das Gewebe in ~ 1 mm Stücke mit zwei Skalpelle. Verwenden Sie zwei Blätter mit einer Schere Aktion ab der Mitte und Auseinanderziehen. Halten Sie das Gewebe ballte, schneiden nicht Stück für Stück. Wenn das Schneiden genügt die Haut ähnelt Kitt, wird es nicht in Stücke getrennt, aber dehnt dünn. Das Lungengewebe ist leichter zu schneiden, und es wird in kleine Stücke zu trennen.
  3. Mit einem Skalpell, Übertragung der Schnitt Gewebe in sterilen 30 ml-Becher mit sterilen Rührstab. Waschen Sie die Platte zum Schneiden von Gewebe mit 10 ml DMEM/F12 Medien mit 0,14 Wunsch Einheiten / ml Liberase Blendzyme 3 und 1X Antibiotikum / Antimykotikum verwendet, und fügen Sie die Lösung für die 30 ml-Becher mit Gewebeteilen.
  4. Becher mit sterilen Folie, und bei 37 ° C unter ständigem Rühren langsam, für 30 bis 90 Minuten. Die Länge der Inkubationszeit hängt von der Art und Gewebe. Achten Sie darauf, nicht zu stark zu verdauen das Gewebe. Besten Ausbeuten werden erzielt, wenn Gewebestücke noch am Ende der Verdauung zu präsentieren. Haut braucht mehr Zeit als die Lunge zu verdauen. Haut vor großen Tieren dauert länger zu verdauen. Überprüfen Sie die Verdauung nach 30 min und dann alle 10 min. Wenn die Haut Verdauung abgeschlossen ist, wird das Medium trüb und Haut-Fragmente voneinander getrennt, und die Ränder der Stücke werden "fuzzy". Lung Verdauung sollte gestoppt, wenn Lungen-Fragmente verändern ihre Farbe von rot nach weiß und starten Sie bilden klebrige Fasern.
  5. Pipettieren der Lösung, die Gewebestücke nach oben und unten, um die Klumpen zu brechen. Die Lösung wird in sterile 50-ml-Tube. Wenn die Fragmente leicht durch die 10 mL Pipette Schneiden und Verdauung war gut gemacht. Spülen Sie das Becherglas 3 mal mit 10 ml warmes DMEM/F12 Medien mit 15% FBS, 1X Antibiotikum / Antimykotikum und fügen Sie die Medien an die 50 ml Tube mit Gewebeteilen. Schließen Sie die 50 ml Tube und mischen durch Umdrehen ein paar mal. Die FBS in den Medien hört Liberase Verdauung.
  6. Spin bei 524 g in einem Ausschwingrotor Gewebekultur Zentrifuge für 5 min. Entfernen Sie den Überstand. Das Pellet in 10 ml warmes DMEM/F12 Medien mit 15% FBS, 1X Antibiotikum / Antimykotikum. Pipettieren der Suspension mitmaximale Kraft auf das Gewebe Stücke brechen.
  7. Fügen Sie ein weiteres 30 mL DMEM/F12 Medien mit 15% FBS, 1X Antibiotikum / Antimykotikum, mischen und zentrifugieren bei 524 g in einem Ausschwingrotor Gewebekultur Zentrifuge für 5 min. Wiederholen Sie noch einmal auf die Spuren von Liberase entfernen.
  8. Das Pellet in 10 ml DMEM/F12 Medien mit 15% FBS, 1X Antibiotikum / Antimykotikum und in ein 10 cm Gewebe Kulturschale und in einer Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2, 3% O 2 .
  9. Prüfen Sie die Platten jeden Tag für Fibroblasten und Medien Farbe. Wenn die Isolierung erfolgreich war, kriechen Fibroblasten aus dem Gewebe Fragmente und heften sich an die Platte (Abbildung 1). Die Fibroblasten beginnen Gewebestücke innerhalb von 2-5 Tagen zu verlassen.
  10. Wenn die Medien ändert sich die Farbe zu gelb, deutet dies auf eine mögliche Kontamination oder Überbelegung der Zellen. Untersuchen Sie die Platten unter dem Mikroskop bei starker Vergrößerung. Wenn Bakterien, Pilze oder Würmer vorhanden sind entsorgen Sie die Platten (das ist selten ein Problem mit Labortieren, aber kann auftreten, wenn die Proben aus der Natur gesammelt werden). Wenn keine Kontamination vorhanden ist, aber die Medien die Farbe gewechselt, ist dies entweder zu viele Zellen oder zu viele Gewebestücke in der gleichen Schale gelegt verursacht. Wenn mehr als 60% der Platte durch befestigt Fibroblasten bedeckt ist, ändern Sie die Medien auf der Platte und übertragen Sie die Gewebestücke auf eine neue Platte mit den neuen Medien. Wenn nicht viele Fibroblasten an der Platte befestigt, ändern Sie die Medien und spaltete die Gewebestücke zu einem 2-4 Platten.
  11. Nach 7 Tagen, wenn Medien nicht schon früher geändert wurde, ändern Sie die Medien und den Transfer der Gewebestücke auf eine neue Platte mit neuen Medien.
  12. Inkubieren Sie die Zellen und Gewebe-Fragmente für weitere 7 Tage. Bis zum Tag 14 alle lebensfähigen Fibroblasten haben die Gewebestücke verlassen.
  13. Nach 14 Tagen ab dem Beginn der Zell-Isolierung, entsorgen Sie die alten Medien und Gewebeteile, die Ernte der Zellen und die Platte sie auf eine neue Platte auf 5x10 5 Zellen / Platte EMEM mit 15% FBS, 1X Penicillin / Streptomycin, nicht-essentiellen Aminosäuren und Natriumpyruvat. EMEM Medien unterstützen das Wachstum von Fibroblasten nur und anderen Zelltypen sterben oder aufhören proliferierenden.
  14. Nachdem die Zellen 80-90% Konfluenz erreicht, frieren ein Aliquot von Zellen für die zukünftige Verwendung.
  15. Weiter Kultivierung der Zellen durch Teilung ihnen bei 5x10 5 Zellen / Platte, wenn die Zellen 80-90% Konfluenz erreichen.

4. Repräsentative Ergebnisse

Normalen Fibroblasten sind große Zellen mit prominenten Vorsprünge (Lamellipodien) (Abbildung 2). Fibroblasten wachsen in einer Monoschicht. Eine gesunde wachsenden Kultur bei 1-10% der Zellen in M-Stadium erkannt, da sich Zellen auf der Oberfläche der Platte erhöhten abgerundet, aber nicht von der Platte (Abbildung 3) abgelöst. Typischerweise wird eine 10 cm Schüssel mit 5x10 5 Zellen ausgesät konfluent in 3-4 Tagen. Die Verdoppelung der Zeit variiert stark zwischen den Arten und größer sein kann für einige der langlebigen Nagetierarten 1. Wenn die Zellen einen Teller sie verhaften Verbreitung in G1-Phase zu füllen. Typische konfluenten Platte von Fibroblasten enthält einen dicht gepackten Schicht von Zellen (Abbildung 4). Wenn die Zellen 90% Konfluenz erreichen sie bereit sind, für die Spaltung. Falls gewünscht, können die Zellen auf einem verhaftet konfluenten Platte für längere Zeit mit regelmäßigem Medienwechsel (ein-oder zweimal pro Woche) gehalten werden.

Abbildung 1
Abbildung 1. Fibroblast isoliert von der Haut von Mäusen (A) und der Lunge (B). Die Medien wurde geändert, um ungebundene Zellen und Trümmer zu entfernen, bevor unter den Bildern am Tag 7.

Abbildung 2
Abbildung 2. Maus Lungenfibroblasten.

Abbildung 3
Abbildung 3. Ein Feld von Maus-Fibroblasten mit Zellen in M-Phase, bei 10-facher Vergrößerung fotografiert.

Abbildung 4
Abbildung 4. Eine konfluente Platte von Maus-Fibroblasten, bei 10-facher Vergrößerung fotografiert.

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Discussion

Normale primären Fibroblasten bieten eine hervorragende Alternative zu den etablierten Zelllinien in der biologischen Forschung. Ein wichtiger Vorteil von Fibroblasten ist, dass sie nicht tragen Mutationen in Onkogenen und Tumor-Unterdrücker und pflegen intakten Zellzyklus-Kontrollpunkte. Dies macht normalen Fibroblasten eine bevorzugte System für das Studium der Regulation des Zellzyklus, DNA-Reparatur und Apoptose. Die hier beschriebene Protokoll bietet ein einfaches Rezept für die Isolierung und Wartung von primären Fibroblasten. Dieses Protokoll wurde verwendet, um erfolgreich zu isolieren Fibroblasten aus über 20 Arten von Nagetieren.

Es ist wichtig, um die Sterilität zu allen Zeiten zu halten, wenn die Arbeit mit Zellkulturen, um eine Kontamination zu vermeiden. Wenn das Labor auch Kulturen aggressive Krebszelllinien wie HeLa-Zellen, Fibroblasten sollten getrennt von Krebszellen behandelt werden. Es wird bevorzugt an eine bestimmte Kapuze und Inkubator für primäre Kulturen haben.

Es ist besser, primären Zellkulturen bei physiologischen Sauerstoff-Konzentration von 3% zu halten. Atmosphärische (20%) Sauerstoff verkürzt Lebensdauer der Kulturen und den oxidativen Stress. Maus-Fibroblasten sind empfindlich gegenüber oxidativem Stress und senesce oder geben Krise innerhalb ~ 14 Populationsverdopplungen bei 20% (Luft-) Sauerstoff erhalten. Maus-Fibroblasten auf unbestimmte Zeit auf 3% Sauerstoff 2 beibehalten werden.

Bewahren Sie Aufzeichnungen über die Anzahl der Verdopplung der Population der Kulturen. Große Arten (body mass über 8.000 g) werden wahrscheinlich replikativen Seneszenz zeigen, und wird eine begrenzte Lebensdauer in Kultur haben, selbst bei 3% Sauerstoff 1. Zellen aus kleineren Arten, wie Mäuse und Ratten, wird auf unbestimmte Zeit vermehren sich bei 3% Sauerstoff, sondern kann schließlich so aneuploid. Wenn möglich, beginnen die Experimente mit Zellen bei geringer Verdopplung der Population.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Steven Austad, die uns mit der ersten Version dieses Protokolls. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH und der Ellison Medical Foundation zu VG und AS unterstützt

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 media Invitrogen 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified Invitrogen 01437-036 The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic Invitrogen 15420-096
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Liberase TM Research Grade Roche 05401127001 Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media ATCC 30-203 The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel Multiple suppliers
Three Gas Control incubator Forma or Heraeus

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References

  1. Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
  2. Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).

Comments

29 Comments

  1. Very helpful protocol. Got it working at the very first try, Would highly recommend the protocol.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 14, 2012 - 5:10 PM
  2. I have recently isolated fibroblasts from fresh fibrotic human lung. I used collagenase and plated the cells via your protocol. the cells seem to be of ² populations: one is long (²0% of plate) typical of fibroblast but the other cells are round. They look like they just started to adhere to the plate. What cells could these be? Is this happen often? COuld they be a subset of fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 4, 2012 - 9:33 AM
  3. Hi
    The round cells are epithelial cells that always accompany lung fibroblast isolation. These cells will just float. After you switch the media to EMEM (mentioned in Step 13) and start splitting the fibroblasts, these cells will go away.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:11 PM
  4. I have used your protocol successfully before on human lung tissue. However this time, the majority of our cells were epithelial- look very much like keritanocytes. Is there something we could do to only keep the fibroblasts growing- change to MEM media?
    Also, the next time we try this protocol, is there anything we can do to not get so many epithelial cells?WIll be happy for any suggestions. Thanks.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 5, 2012 - 8:14 AM
  5. Hi Barbara,
    We always get the round epithelial cells during our lung fibroblast isolation too. When you switch to EMEM media and start splitting the fibroblasts, they will be selected for and the epithelial cells will be lost.
    Next time you try the protocol, you can use EMEM media for the whole isolation procedure instead of DMEM/F1² to minimize the epithelial cells you get. But the trade-off is that the efficiency of isolation might decrease. Good luck.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:15 PM
  6. A note from the authors:
    Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3, they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 054011²7001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:31 PM
  7. Thank you so much for your reply. I split them yesterday and changed the media to MEM.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 6, 2012 - 7:35 AM
  8. What is the best way to remove tissue peices on day 7? Especially with the larger tissue peices, ones that you can clearly see, produce more epithelial cells, where as the small peices (as in your pictures) produce mostly pure fibroblasts. Also, do you transplant the tissues on day 7 regardless of the confluency of your plate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:59 AM
  9. On day 7, we gently aspirate the supernatant (with the tissue pieces) with a pipette, transfer it to a new plate and provide the original plate with fresh media. In this way, the small pieces attached to the plate are not disturbed and the other tissue debris with the potential to give out more fibroblasts can do so on a new plate.
    Also, yes, it is a good idea to transfer the tissues on a new plate on day 7.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 3:43 PM
  10. When you trypsinize initially, do you do this aggressively and try to remove all the cells from the plate (fibroblast and epithelial)? I have found that the fibroblasts seem to trypsinize first and can thus help to purify the culture, but my cell yield is significantly smaller (too small). Thank you for you help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:05 PM
  11. The first trypsinization dŒs not have to be aggressive. As long as all the fibroblasts are off the plate and floating, we dont worry about the epithelial cells. They usually disappear after the first couple of passages with EMEM media. The fibroblasts are fast growing and will be selected for with passaging.
    To improve the yield, I would suggest ² things in the isolation procedure : Mincing the tissue very well and incubating the tissue pieces for a longer time in the Collagenase enzyme (while taking care to avoid over-digestion).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:18 PM
  12. You recommend storing 0.5 mL aliquots of Blendzyme at ²8 units/ml (i.e. 14 wunsch units per aliquot) but you recommend using 0.14 units/ml in 10 mls of media, or 1.4 wunsch units per digestion) This implies each aliquot is for 10 digestions. Is this correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 10:59 AM
  13. Yes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 11:04 AM
  14. After 14 days I achieve confluence and then split into fibroblast specific growth media and these cells have no trouble reaching 80-90%. When I subsequently split this population the cells senesce. Is there any obvious reason for this? It would think that 14 days of growth would cause a primary cell to senesce but your protocol suggests that I should be able to continue splitting my cells and further purfy in the process. I appreciate your help!

    Reply
    Posted by: Justin K.
    May 4, 2012 - 10:49 AM
  15. Hi Justin
    Are these mouse fibroblasts? Are you growing them in ²0% oxygen? If you are, then they will senesce. We grow all our cells in 3% oxygen and 5% CO² conditions.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 9, 2012 - 3:06 PM
  16. Hi, one of the first steps recommends to euthanize the animal and store it at 4oC. Do we complete this step even if we plan on using the animal right away? If so, for how long do we store the animal at 4oC? Is putting it on ice also acceptable?

    Reply
    Posted by: J A.
    May 13, 2012 - 7:49 PM
  17. No..It is best to use the animal right away. The 4C step is only if circumstances make it impossible to process it right away. In this case, we store the corpse at 4C(better) or on ice(in case of wild caught animals) for not more than ²4 hours.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 13, 2012 - 7:57 PM
  18. Also, another question I have is about the tissue fragments in the media. When would be the best time to remove them from the cells and replace them with media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 14, 2012 - 12:42 AM
  19. It depends. Usually, if the media turns yellow a few days after isolation and if there aren't enough fibroblasts on the plate, we collect the fragments, suspend them in fresh media and plate them back. As the protocol says, day 14 is when we usually get rid of the tissue fragments.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 14, 2012 - 2:51 PM
  20. Hi,

    I a couple of questions about the reagents used. My first question is about the liberase enzyme used. I noticed that the liberase enzyme 3 from Roche has been discontinued. Would you recommend replacing it with the Liberase TM Research Grade medium enzyme with Thermolysin? If so, would you recommend keeping the concentration the same (.14 U/mL)? My second question is about the Fetal Bovine Serum used in this experiment. I understand that you recommend using the Qualified Fetal Bovine Serum because it has been shown to support the growth of primary fibroblast cultures. In my lab we use heat-inactivated FBS. Would you recommend me switching from heat-inactivated to qualified FBS?

    Thank you in advance for your help :)

    Reply
    Posted by: J A.
    May 21, 2012 - 11:25 AM
  21. Yes. We now use TM instead of Liberase 3 with the same concentration.
    I understand that heat-inactivation of FBS is usually done to get rid of complement factors. I don't know how critical it is for your experiments to do this but we never use heat-inactivated serum.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 3:06 PM
  22. I also have a question about plating the tissue into the media. ²4- hours after I plated my tissue pieces into the media, I looked at my cultures under the microscope and saw little round cells that adhered to the plate. I understand that the protocol mentions that fibroblasts do not typically exit the tissue for at least 48 hours, and the round epithelial cells that assist the growth of fibroblasts usually float through the media. I was just wondering if seeing these cells after ²4 hours is normal.

    Reply
    Posted by: J A.
    May 24, 2012 - 12:59 PM
  23. Yes it is normal, more for lung fibroblast isolation. Once the fibroblasts start growing, the round cells will be selected against.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 2:57 PM
  24. Hi,

    I was wondering what concentration of trypsin EDTA you used? I use trypsin 0.²5% trypsin EDTA to remove my cells during splitting (after an incubation time of 4 minutes). After trypsinizing the cells for 4 minutes, I have noticed that less than half of them are detached from the plate. I am afraid to leave the cells in trypsin for longer than 4 minutes because I do not want to damage them. Any suggestions?

    Reply
    Posted by: J A.
    July 18, 2012 - 1:05 AM
  25. We use Red trypsin with 0.²5% EDTA..Its very strong and we only treat cells with it for 1-² minutes. So you wash/rinse the plate with PBS after aspirating media, before adding trypsin? Because the FBS in the media inhibits trypsin activity and if the plates are not washed with PBS first, trypsin cannot act properly.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    July 18, 2012 - 11:28 AM
  26. Thank you for such detailed procedure. I am curious is it possible that the keratinocytes also exist in the fibroblast culture? Thank you.

    Reply
    Posted by: Hua-Ling C.
    September 19, 2012 - 3:16 AM
  27. Dear all, my adult fibroblasts (GFP positive C67Bl/6 mice) are not growing very well (DMEM, high glucose, Na-pyrovate, Pen/Strp, 15%FBS). Do you have any suggestions about what I could add to the media to increase proliferation? Thanks a lot. Gunnar

    Reply
    Posted by: Gunnar P.
    March 1, 2013 - 2:03 PM
  28. Can this protocol be adapted to isolate cancer-associated fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Wei L.
    July 9, 2013 - 2:59 PM
  29. Do you know what is the best marker to check the purity of mouse lung fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Jenny t.
    July 15, 2014 - 5:02 PM

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