Kemirgenler itibaren İlköğretim Yetişkin Fibroblast Kültürleri kurulması

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu makalede, izolasyon ve bakım, cilt ve akciğer dokusunda yaban kemirgenler birincil fibroblast kültürlerinin için bir protokol tanımlamaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biyolojik çalışmalar için, birincil hücreler, kanser hücre hatları yerine kullanmanın önemi, yaygın olarak kabul haline geliyor. Birincil hücreler, hücre döngüsü kontrolü, apoptozis çalışmaları tercih ve DNA onarımı, kanser hücreleri, bu süreçlere dahil genlerindeki mutasyonlar taşıyan. İlköğretim hücreleri süresiz replikatif yaşlanması veya aneuploidization başlangıcı nedeniyle kültür olamaz. Bu nedenle, yeni kültürler, düzenli bir şekilde kurulması gerekmektedir. Kemirgen embriyonik fibroblastlar izolasyonu için prosedür iyi kurulmuş, ama çoğu zaman bir meydan okuma sunuyor yetişkin fibroblast kültürlerinde izole eder. Insan hastalığı fare modelleri izole Yetişkin kemirgen fibroblastlar, insan hasta fibroblastlar karşılaştırarak tercih edilen bir kontrol olabilir. Ayrıca, hamile kadın kolayca elde edilemez yabani kemirgenler ile çalışırken yetişkin fibroblastlar sadece kullanılabilir bir malzeme. Burada kemirgen cilt ve akciğerlerden yetişkin fibroblastlar izolasyonu ve kültürü için bir protokol sağlar. Bu yordamı Biz yirmi kemirgen türleri üzerinde laboratuvarda fareler ve sıçanlar, kunduz, kirpi, sincap gibi yabani kemirgenler fibroblastlar izole etmek için başarıyla kullanılır.

Protocol

1. Başlamadan Önce

  1. % 70 etanol ile makas ve forseps sterilize edin.
  2. 30 ml beher içindeki küçük manyetik karıştırıcı yerleştirin, iki folyo katmanlar ve otoklav ile kaplayın.
  3. Steril su içinde 28 Wunsch Liberase Blendzyme 3 ünite / mL stok çözelti hazırlayın. -20 ° C'de 0.5 mL alikotları ve donma yapın Her kullanımdan önce yeni bir kısım çözülme. Çözüm çözme sonrası bulanık görünebilir. Vorteksleyin çözüm açık hale gelinceye kadar.
  4. Isınma hücre kültür ortamı.

2. Hayvan Numune Hazırlama

Dikkat: vahşi hayvanların kuduz virüsü gibi böyle bir patojenler içerebilir. Her zaman açık kavuz farkında olun.

  1. Hayvan Euthanize ve 4 karkas ° C Ancak, hayvanların alanında toplanan sanki bu tür pratik değilse, hemen karkas kullanmak en iyisidir, karkaslar 24 saat içinde kullanılmalıdır. 24 saat sonra hücre verimi azalır.
  2. (Doku kültürü kaputu), cerrahi süit ya da kimyasal kaputun içindeki hayvan teşrih.
  3. Koltukaltı alan koltuk altı cilt daha ince olduğu gibi, daha az yağ içeren cilt örnekleri toplamak için uygun bir site ve kürk daha az yoğundur. % 70 etanol ile kesi yeri temizleyin. Kürk etanol ile ıslatılmış olduğundan emin olun.
  4. Keskin bir bistüri ile kesi sitesi etrafında kürk Tıraş. Istenen kesi yeri daha büyük bir alan Tıraş. Cilt için kesintileri en aza indirmek için deneyin. % 70 etanol ile bölgede Sprey ve kurumaya bırakın.
  5. Bir deri örneği tüketim yaklaşık 1 cm 2 bir parçasını toplamak için. Doku forseps ile cilt çimdik, ve makasla kesmek. Yağ kollajenaz sindirim müdahale gibi, deri ile yağ tabakası kesmek için deneyin. Akciğer örnekleri toplamak için, göğüs bölgesinde% 70 etanol ile yıkayın ve T şeklinde bir kesi yapmak ve cilt kapakları dışında çekerek makas ile göğüs cilt açmak. Açılan kas alanı% 70 etanol ile yıkayın ve kurumaya bırakın. Steril forseps ve makas (büyük hayvanlar için kemik kesiciler kullanmak) kullanılarak göğüs kafesi kesin. Iç organları kirlenmesini önlemek için steril teknikler kullanın. Hayvan kürk dokundu araçların iç organları dokunmayın. Steril forseps ve makas kullanılarak yaklaşık 1 cm 2 akciğer parçaları kesin.
  6. Yeri doku parçaları steril PBS ile 50 ml tüpler kurumasını önlemek için.
  7. 50 ml tüpler dışında etanol ile doku parçaları ile yıkayın ve doku kültürü kaputu götürün.
  8. Düzgün hayvan karkas atmayın.

3. Ayıklanıyor Hücreler

  1. Doku parçaları steril neşter kullanılarak 10 cm doku kültürü çanak içine aktarın. Örneği ile çok PBS transferi yapmayın.
  2. Iki neşter kullanılarak ~ 1 mm adet doku kesin. Merkezinde başlayan ve çekme dışında bir makas eylemini kullanarak iki ucu kullanın. Parça parça kesmeyin, doku tıkıştırılmış tutun. Kesme cilt macun benzer yeterli olduğunda, parçalar halinde ayrı ama ince germek olacaktır. Akciğer doku kesmek için kolay ve küçük parçalar halinde ayrı olacaktır.
  3. Bir neşter kullanarak, steril heyecan çubuğu ile kesilmiş doku steril 30 ml beher içine aktarın. Ile DMEM/F12 medya 10 ml / 0.14 Wunsch birimleri mL Liberase Blendzyme 3 ve 1X antimikotik / antibiyotik doku kesmek için kullanılan plaka yıkayın ve doku parçaları ile 30 ml beher çözüm ekleyin.
  4. Steril folyo ile beher Kapak ve 37 ° inkübe ° C, yavaş yavaş karıştırarak, 30 ila 90 dakika. Inkübasyon süresini tür ve doku tipine bağlıdır. Doku üzerinde sindirmek için özen gösterin. Doku parçaları, sindirim sonunda hala mevcut zaman en iyi verimi elde edilir. Cilt, akciğer sindirimi daha uzun sürer. Büyük hayvanların Cilt sindirimi uzun sürer. 30 dakika sonra sindirim, ve sonra her 10 dakikada bir kontrol edin. Cilt sindirim işlemi tamamlandığında, medya bulutlu ve deri parçaları birbirinden ayrı olur ve parçaların kenarlarında "bulanık" hale gelir. Akciğer sindirim kırmızı beyaz ve yapışkan lifleri oluşmaya başlar ve akciğer parçaları renk değiştiren kesilmelidir.
  5. Yığınları kırmak için ve doku parçaları aşağı yukarı içeren pipetleyin çözüm. Steril 50 ml tüp çözüm aktarın. Parçaları 10 ml pipet kesme ve sindirim yoluyla kolayca hareket yapıldı. 10 ml% 15 FBS, antimikotik / antibiyotik 1X sıcak DMEM/F12 medya beher 3 kez doku parçaları ile durulayın ve 50 ml tüp medya ekleyebilirsiniz. 50 mL tüp ve inversiyon bir kaç kez karıştırın kapatın. Medya FBS Liberase sindirim duracaktır.
  6. 5 dakika için bir sallanan kova doku kültürü santrifüj 524 g dönerler. Süpernatantı. % 15 FBS, 1X antimikotik / antibiyotik ile 10 ml sıcak DMEM/F12 medya pelletini tekrar. Pipetleyin süspansiyon iledoku parçaları kırmak için maksimum kuvvet.
  7. % 15 FBS, 1X, 5 dakika için bir sallanan kova doku kültürü santrifüj 524 g / antibiyotik antimikotik, mix ve santrifüj ile DMEM/F12 medya başka bir 30 ml ekleyin. Liberase izlerini kaldırmak için bir kez daha tekrarlayın.
  8. Ile DMEM/F12 medya 10 ml% 15 FBS pelletini tekrar 1X antimikotik / antibiyotik ve 37 doku kültürü inkübatör 10 cm doku kültürü çanak ve yeri ° C,% 5 CO 2 transfer% 3 O 2 .
  9. Plakalar, fibroblastlar ve medya renk için her gün kontrol edin. Izolasyon başarılı olursa, fibroblastlar doku parçaları tarama ve plaka takmak (Şekil 1). Fibroblast, 2-5 gün içinde doku parçaları çıkmak için başlar.
  10. Eğer medya sarı renk değiştirir, bu potansiyel kirlenme veya hücrelerin aşırı kalabalık gösterir. Mikroskop altında yüksek büyütmede plakaları inceleyin. , Bakteri, mantar veya solucan mevcut levhalar (Bu laboratuar hayvanları ile nadiren bir konudur, ancak doğadan toplanan numunelerin oluşabilir) iptal edilir. Hiçbir kirlenme mevcut, ancak medya renk değiştirdiyseniz, bu çok fazla hücre veya aynı tabak içinde yerleştirilen çok sayıda doku parçaları ya da neden olmaktadır. % 60 daha fazla plaka takılı fibroblastlar kapsadığı ise, plaka üzerinde ortamı değiştirmek ve yeni medya ile yeni bir plaka doku parçaları aktarmak. Pek çok fibroblastlar plaka bağlı, medya değiştirmek ve 2-4 tabak doku parçaları bölmek.
  11. 7 gün sonra, medyada daha önce değiştirilmiş olsaydı, medya değiştirmek ve yeni medya ile yeni bir plaka doku parçaları aktarmak.
  12. Hücre ve doku parçaları, ek bir 7 gün süreyle inkübe edin. 14 gün yaşayabilir fibroblastlar doku parçaları çıkmış durumdayız.
  13. Hücre izolasyonu başından itibaren 14 gün sonra, eski ortam ve doku parçaları atmak% 15 FBS, 1X Penisilin / Streptomisin, non-esansiyel amino asitleri ile yeni bir plaka üzerinde 5x10 5 hücre / plaka EMEM hücreleri ve plaka onları hasat ve sodyum piruvat. EMEM medya tek ve diğer hücre türleri ölmeye veya prolifere duracaktır fibroblastların büyümeyi desteklemek.
  14. Hücreleri% 80-90 izdiham ulaştıktan sonra, bir kısım hücreler gelecekte kullanmak üzere dondurun.
  15. 5x10 5 hücre / plaka bölme onları kültür hücreleri hücrelerinin% 80-90 izdiham ulaştığınızda devam edin.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Normal fibroblastlar belirgin çıkıntılar (lamellipodia) (Şekil 2) ile büyük hücrelerdir. Fibroblastlar bir tek tabaka büyür. Sağlıklı büyüyen kültür, plaka yüzey üzerinde yüksek hücreleri yuvarlak, ama plaka (Şekil 3) müstakil tanınan M aşamasında% 1-10 hücreleri, içerir. Tipik olarak, 5x10 5 hücre numaralı seribaşı 10 cm çanak, 3-4 gün içinde konfluent olur . Iki katına zaman türler arasında büyük ölçüde değişir ve bazı uzun ömürlü kemirgen türleri 1 için daha büyük olabilir. Hücrelerin çoğalması G1 aşamasında tutuklama bir tabak doldurduğunuzda. Fibroblastlar Tipik konfluent plaka hücreleri (Şekil 4) sıkışık bir tabaka içerir. Hücrelerin% 90 izdiham ulaştığınızda yarma için hazır. İsterseniz, hücrelerin düzenli medya değişiklikleri (bir veya iki kez bir hafta) ile uzun süre için tutuklandı konfluent bir plaka üzerinde muhafaza edilebilir.

Şekil 1
Şekil 1. Günlük 7 fotoğraf çekmek için önce unattached hücreleri ve enkaz kaldırmak için fare deri (A) ve akciğer (B) Fibroblast izolasyon medya değiştirildi.

Şekil 2
Şekil 2. Fare akciğer fibroblastlar.

Şekil 3
Şekil 3. 10X büyütme fotoğrafı fare fibroblastların M-aşamada hücre içeren bir alan.

Şekil 4
Şekil 4. 10X büyütmede fotoğraflandı fare fibroblastlar konfluent plaka.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Normal birincil fibroblastlar, biyolojik araştırmalar yılında kurulan kanser hücre hatları için mükemmel bir alternatif sağlar. Fibroblastların önemli bir avantajı, onkogenler ve tümör bastırıcılarının mutasyonlar taşımak ve sağlam hücre döngüsü kontrol noktaları korumak olduğunu. Bu normal fibroblastlar, hücre döngüsü kontrolü, DNA onarımı ve apoptozis çalışmaları için tercih edilen bir sistem yapar. Burada açıklanan protokol birincil fibroblastlar izolasyon ve bakımı için basit bir reçete sunar. Bu protokol, 20 tür kemirgen başarılı fibroblastlar izole etmek için kullanılmıştır.

Kontaminasyonu önlemek için hücre kültürleri ile çalışırken her zaman kısırlık korumak için önemlidir. Eğer laboratuvarda aynı zamanda kültürler HeLa hücrelerinde gibi agresif kanser hücresi hatlarında, fibroblastlar kanser hücreleri ayrı ayrı ele alınması gerekir. Birincil kültürler için bir kaput ve inkübatör için tercih edilir.

Bu fizyolojik oksijen konsantrasyonu% 3 primer hücre kültürleri korumak için tercih edilir. Atmosferik (% 20) oksijen, ömrünü kültürler ve artar oksidatif stres kısaltır. Fare fibroblastlar oksidatif strese karşı duyarlıdır ve% 20 (atmosfer) oksijen bakımı yapıldığında ~ 14 nüfus çiftlenmeler içinde kriz senesce ya da girecek. Fare fibroblastlar% 3 oksijen 2 süresiz olarak muhafaza edilebilir.

Her zaman kültürlerin nüfus iki katına sayısının kaydını tutmak. Büyük türlerinin (8.000 g üzerinde vücut kitle) replikatif yaşlanması sergilemek olasıdır ve hatta% 3 oksijen 1, kültür sınırlı bir ömre sahip. Örneğin, fare ve sıçan gibi küçük türlerin, hücreleri% 3 oksijen süresiz çoğalacak, ama sonunda anöploid olabilir. Eğer mümkünse, düşük nüfus iki katına hücreleri kullanarak deneyler başlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Bu protokolün ilk sürümü ile bize sağlamak için Dr. Steven Austad teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü ve Ellison Tıp Vakfı VG hibe tarafından desteklenen ve AS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 media Invitrogen 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified Invitrogen 01437-036 The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic Invitrogen 15420-096
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Liberase TM Research Grade Roche 05401127001 Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media ATCC 30-203 The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel Multiple suppliers
Three Gas Control incubator Forma or Heraeus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
  2. Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).

Comments

29 Comments

  1. Very helpful protocol. Got it working at the very first try, Would highly recommend the protocol.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 14, 2012 - 5:10 PM
  2. I have recently isolated fibroblasts from fresh fibrotic human lung. I used collagenase and plated the cells via your protocol. the cells seem to be of ² populations: one is long (²0% of plate) typical of fibroblast but the other cells are round. They look like they just started to adhere to the plate. What cells could these be? Is this happen often? COuld they be a subset of fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 4, 2012 - 9:33 AM
  3. Hi
    The round cells are epithelial cells that always accompany lung fibroblast isolation. These cells will just float. After you switch the media to EMEM (mentioned in Step 13) and start splitting the fibroblasts, these cells will go away.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:11 PM
  4. I have used your protocol successfully before on human lung tissue. However this time, the majority of our cells were epithelial- look very much like keritanocytes. Is there something we could do to only keep the fibroblasts growing- change to MEM media?
    Also, the next time we try this protocol, is there anything we can do to not get so many epithelial cells?WIll be happy for any suggestions. Thanks.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 5, 2012 - 8:14 AM
  5. Hi Barbara,
    We always get the round epithelial cells during our lung fibroblast isolation too. When you switch to EMEM media and start splitting the fibroblasts, they will be selected for and the epithelial cells will be lost.
    Next time you try the protocol, you can use EMEM media for the whole isolation procedure instead of DMEM/F1² to minimize the epithelial cells you get. But the trade-off is that the efficiency of isolation might decrease. Good luck.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:15 PM
  6. A note from the authors:
    Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3, they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 054011²7001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:31 PM
  7. Thank you so much for your reply. I split them yesterday and changed the media to MEM.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 6, 2012 - 7:35 AM
  8. What is the best way to remove tissue peices on day 7? Especially with the larger tissue peices, ones that you can clearly see, produce more epithelial cells, where as the small peices (as in your pictures) produce mostly pure fibroblasts. Also, do you transplant the tissues on day 7 regardless of the confluency of your plate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:59 AM
  9. On day 7, we gently aspirate the supernatant (with the tissue pieces) with a pipette, transfer it to a new plate and provide the original plate with fresh media. In this way, the small pieces attached to the plate are not disturbed and the other tissue debris with the potential to give out more fibroblasts can do so on a new plate.
    Also, yes, it is a good idea to transfer the tissues on a new plate on day 7.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 3:43 PM
  10. When you trypsinize initially, do you do this aggressively and try to remove all the cells from the plate (fibroblast and epithelial)? I have found that the fibroblasts seem to trypsinize first and can thus help to purify the culture, but my cell yield is significantly smaller (too small). Thank you for you help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:05 PM
  11. The first trypsinization dŒs not have to be aggressive. As long as all the fibroblasts are off the plate and floating, we dont worry about the epithelial cells. They usually disappear after the first couple of passages with EMEM media. The fibroblasts are fast growing and will be selected for with passaging.
    To improve the yield, I would suggest ² things in the isolation procedure : Mincing the tissue very well and incubating the tissue pieces for a longer time in the Collagenase enzyme (while taking care to avoid over-digestion).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:18 PM
  12. You recommend storing 0.5 mL aliquots of Blendzyme at ²8 units/ml (i.e. 14 wunsch units per aliquot) but you recommend using 0.14 units/ml in 10 mls of media, or 1.4 wunsch units per digestion) This implies each aliquot is for 10 digestions. Is this correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 10:59 AM
  13. Yes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 11:04 AM
  14. After 14 days I achieve confluence and then split into fibroblast specific growth media and these cells have no trouble reaching 80-90%. When I subsequently split this population the cells senesce. Is there any obvious reason for this? It would think that 14 days of growth would cause a primary cell to senesce but your protocol suggests that I should be able to continue splitting my cells and further purfy in the process. I appreciate your help!

    Reply
    Posted by: Justin K.
    May 4, 2012 - 10:49 AM
  15. Hi Justin
    Are these mouse fibroblasts? Are you growing them in ²0% oxygen? If you are, then they will senesce. We grow all our cells in 3% oxygen and 5% CO² conditions.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 9, 2012 - 3:06 PM
  16. Hi, one of the first steps recommends to euthanize the animal and store it at 4oC. Do we complete this step even if we plan on using the animal right away? If so, for how long do we store the animal at 4oC? Is putting it on ice also acceptable?

    Reply
    Posted by: J A.
    May 13, 2012 - 7:49 PM
  17. No..It is best to use the animal right away. The 4C step is only if circumstances make it impossible to process it right away. In this case, we store the corpse at 4C(better) or on ice(in case of wild caught animals) for not more than ²4 hours.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 13, 2012 - 7:57 PM
  18. Also, another question I have is about the tissue fragments in the media. When would be the best time to remove them from the cells and replace them with media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 14, 2012 - 12:42 AM
  19. It depends. Usually, if the media turns yellow a few days after isolation and if there aren't enough fibroblasts on the plate, we collect the fragments, suspend them in fresh media and plate them back. As the protocol says, day 14 is when we usually get rid of the tissue fragments.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 14, 2012 - 2:51 PM
  20. Hi,

    I a couple of questions about the reagents used. My first question is about the liberase enzyme used. I noticed that the liberase enzyme 3 from Roche has been discontinued. Would you recommend replacing it with the Liberase TM Research Grade medium enzyme with Thermolysin? If so, would you recommend keeping the concentration the same (.14 U/mL)? My second question is about the Fetal Bovine Serum used in this experiment. I understand that you recommend using the Qualified Fetal Bovine Serum because it has been shown to support the growth of primary fibroblast cultures. In my lab we use heat-inactivated FBS. Would you recommend me switching from heat-inactivated to qualified FBS?

    Thank you in advance for your help :)

    Reply
    Posted by: J A.
    May 21, 2012 - 11:25 AM
  21. Yes. We now use TM instead of Liberase 3 with the same concentration.
    I understand that heat-inactivation of FBS is usually done to get rid of complement factors. I don't know how critical it is for your experiments to do this but we never use heat-inactivated serum.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 3:06 PM
  22. I also have a question about plating the tissue into the media. ²4- hours after I plated my tissue pieces into the media, I looked at my cultures under the microscope and saw little round cells that adhered to the plate. I understand that the protocol mentions that fibroblasts do not typically exit the tissue for at least 48 hours, and the round epithelial cells that assist the growth of fibroblasts usually float through the media. I was just wondering if seeing these cells after ²4 hours is normal.

    Reply
    Posted by: J A.
    May 24, 2012 - 12:59 PM
  23. Yes it is normal, more for lung fibroblast isolation. Once the fibroblasts start growing, the round cells will be selected against.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 2:57 PM
  24. Hi,

    I was wondering what concentration of trypsin EDTA you used? I use trypsin 0.²5% trypsin EDTA to remove my cells during splitting (after an incubation time of 4 minutes). After trypsinizing the cells for 4 minutes, I have noticed that less than half of them are detached from the plate. I am afraid to leave the cells in trypsin for longer than 4 minutes because I do not want to damage them. Any suggestions?

    Reply
    Posted by: J A.
    July 18, 2012 - 1:05 AM
  25. We use Red trypsin with 0.²5% EDTA..Its very strong and we only treat cells with it for 1-² minutes. So you wash/rinse the plate with PBS after aspirating media, before adding trypsin? Because the FBS in the media inhibits trypsin activity and if the plates are not washed with PBS first, trypsin cannot act properly.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    July 18, 2012 - 11:28 AM
  26. Thank you for such detailed procedure. I am curious is it possible that the keratinocytes also exist in the fibroblast culture? Thank you.

    Reply
    Posted by: Hua-Ling C.
    September 19, 2012 - 3:16 AM
  27. Dear all, my adult fibroblasts (GFP positive C67Bl/6 mice) are not growing very well (DMEM, high glucose, Na-pyrovate, Pen/Strp, 15%FBS). Do you have any suggestions about what I could add to the media to increase proliferation? Thanks a lot. Gunnar

    Reply
    Posted by: Gunnar P.
    March 1, 2013 - 2:03 PM
  28. Can this protocol be adapted to isolate cancer-associated fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Wei L.
    July 9, 2013 - 2:59 PM
  29. Do you know what is the best marker to check the purity of mouse lung fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Jenny t.
    July 15, 2014 - 5:02 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics