Établir des cultures primaires de fibroblastes adultes à partir de rongeurs

Biology

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Summary

Cet article décrit un protocole pour l'isolement et l'entretien des cultures de fibroblastes primaires de la peau et les tissus pulmonaires de rongeurs sauvages.

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Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing Primary Adult Fibroblast Cultures From Rodents. J. Vis. Exp. (44), e2033, doi:10.3791/2033 (2010).

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Abstract

L'importance de l'utilisation de cellules primaires, plutôt que de lignées cellulaires de cancer, pour des études biologiques est de plus largement reconnu. Les cellules primaires sont préférés dans les études sur le contrôle du cycle cellulaire, l'apoptose, et la réparation de l'ADN, les cellules cancéreuses sont porteurs de mutations dans les gènes impliqués dans ces processus. Les cellules primaires ne peuvent pas être cultivées indéfiniment en raison de l'apparition de la sénescence réplicative ou aneuploidization. Ainsi, de nouvelles cultures doivent être établis régulièrement. La procédure d'isolement de fibroblastes embryonnaires de rongeurs bien établie, mais d'isoler des cultures de fibroblastes adultes représente souvent un défi. Fibroblastes de rongeurs adultes isolés de modèles murins de maladies humaines peut être un contrôle préféré quand on les compare à des fibroblastes provenant de patients humains. Par ailleurs, les fibroblastes adultes sont les seuls matériaux disponibles lorsque vous travaillez avec des rongeurs sauvages où les femmes enceintes ne peuvent pas être obtenus facilement. Ici nous fournissons un protocole pour l'isolement et la culture de fibroblastes adultes de la peau des rongeurs et des poumons. Nous avons utilisé cette procédure avec succès pour isoler les fibroblastes de plus de vingt espèces de rongeurs à partir des souris de laboratoire et des rats à des rongeurs sauvages tels que le castor, le porc-épic et l'écureuil.

Protocol

1. Avant de partir

  1. Stériliser des ciseaux et des pinces à l'éthanol 70%.
  2. Placer les petits agitateur magnétique dans un bécher 30 mL, couvrir avec deux couches de papier d'aluminium, et autoclave.
  3. Préparer un 28 unités Wunsch / ml de solution stock Libérase Blendzyme 3 dans l'eau stérile. Faire aliquotes de 0,5 ml et congeler à -20 ° C. Dégeler une aliquote de nouvelles avant chaque utilisation. La solution peut paraître nuageux après décongélation. Vortex la solution jusqu'à ce qu'elle devienne claire.
  4. Réchauffez les milieux de culture cellulaire.

2. Préparation des échantillons d'animaux

Attention: les animaux sauvages peuvent contenir des agents pathogènes tels que virus de la rage. Soyez toujours conscient de dièses ouverte.

  1. Euthanasier l'animal et le lieu de la carcasse à 4 ° C. Il est préférable d'utiliser la carcasse immédiatement, toutefois, si cela n'est pas pratique, comme si les animaux sont recueillies sur le terrain, les carcasses peuvent être utilisés dans les 24 heures. Après 24 heures, les baisses de rendement des cellules.
  2. Disséquer l'animal dans le bloc opératoire ou dans hotte chimique (et non dans la hotte de culture de tissus).
  3. Aisselles zone est un site pratique pour recueillir des échantillons de peau comme la peau des aisselles est plus mince, contient moins de gras, et la fourrure est moins dense. Nettoyez le site d'incision avec de l'éthanol à 70%. Assurez-vous que la fourrure est imbibé d'éthanol.
  4. Rasez les poils autour du site d'incision avec un scalpel tranchant. Rasage une zone plus vaste que le site d'incision désirée. Essayez de minimiser les coupures de la peau. Vaporiser la zone avec 70% d'éthanol et laisser sécher.
  5. Pour recueillir un échantillon de peau d'accise d'un fragment d'environ 1 cm 2. Pincer la peau avec une pince de tissu et couper avec des ciseaux. Essayez de ne pas couper la couche de graisse avec la peau, sous forme de graisse interfère avec la digestion par la collagénase. Pour recueillir les échantillons pulmonaires, lavez la région de la poitrine avec de l'éthanol à 70%, et ouvert la peau sur la poitrine avec des ciseaux en faisant une incision en forme de T et en tirant en dehors des volets de la peau. Laver la zone musculaire ouvert avec 70% d'éthanol et laisser sécher. Couper la cage thoracique à l'aide des pinces stériles et les ciseaux (utilisation tailleurs d'os pour les gros animaux). Utiliser des techniques stériles pour éviter de contaminer les organes internes. Ne pas toucher les organes internes avec des instruments qui a touché la fourrure animale. Coupez les fragments pulmonaires d'environ 1 cm 2 à l'aide des pinces stériles et des ciseaux.
  6. Fragments de tissus place dans des tubes de 50 ml avec du PBS stérile pour éviter le dessèchement.
  7. Laver l'extérieur de l'tubes de 50 ml avec des fragments de tissu avec de l'éthanol, et les prendre à la hotte de culture de tissus.
  8. Débarrassez-vous correctement des carcasses d'animaux.

3. Cellules Extraction

  1. Transfert des fragments de tissu dans un plat de 10 cm de culture de tissu à l'aide scalpel stérile. Ne transférez pas trop de PBS avec l'échantillon.
  2. Coupez le tissu dans ~ 1 mm en utilisant deux morceaux scalpels. Utilisez deux lames de ciseaux en utilisant une action à partir du centre et en tirant à part. Gardez le tissu en boule, ne pas couper morceau par morceau. Quand la coupe est suffisamment la peau ressemble à du mastic, il ne sera pas séparée en morceaux, mais s'étendra mince. Le tissu pulmonaire est plus facile à couper, et il va séparer en petits morceaux.
  3. Avec un scalpel, le transfert du tissu découpé en 30 stériles bécher mL avec un barreau d'agitation stérile. Laver la plaque utilisée pour la découpe de tissus avec 10 ml de DMEM/F12 des médias avec les unités Wunsch 0,14 / mL Libérase Blendzyme 3, et 1X antibiotique / antimycotique, et ajouter la solution dans le bécher de 30 mL avec des fragments de tissus.
  4. Couvrir le bécher avec du papier stérile, et incuber à 37 ° C, en remuant doucement, pendant 30 à 90 minutes. La longueur de l'incubation dépend du type d'espèces et de tissus. Prenez soin de ne pas trop digérer les tissus. Meilleurs rendements sont obtenus lorsque des fragments de tissus sont encore présentes à la fin de la digestion. Peau prend plus de temps à digérer que le poumon. Peau d'animaux de grande taille prend plus de temps à digérer. Vérifiez la digestion après 30 minutes, puis toutes les 10 min. Lorsque la digestion est terminée la peau, les médias devient trouble et de fragments de peau séparés les uns des autres, et les bords des morceaux devenus "flou". La digestion du poumon doit être arrêté lorsque la couleur change pulmonaires fragments du rouge au blanc et commencer à former des fibres collante.
  5. Pipeter la solution contenant des fragments de tissus et pour briser les mottes. Transférer la solution dans le tube de 50 ml stérile. Si les fragments se déplacer facilement à travers la coupe 10 ml pipette et la digestion a été bien fait. Rincer le bécher 3 fois avec 10 ml d'eau tiède DMEM/F12 médias avec 15% de FBS, 1X antibiotique / antimycotique et ajouter le support sur le tube de 50 ml avec des fragments de tissus. Fermer le tube de 50 ml et mélanger par inversion à quelques reprises. Le FBS dans les médias cesseront de digestion Libérase.
  6. Centrifuger à 524 g dans une centrifugeuse de culture tissulaire seau balancer pendant 5 min. Enlever le surnageant. Reprendre le culot dans 10 ml d'eau tiède DMEM/F12 médias avec 15% de FBS, 1X antibiotique / antimycotique. Pipet la suspension avecforce maximale pour briser les morceaux de tissu.
  7. Ajouter un autre de 30 ml de DMEM/F12 médias avec 15% de FBS, 1X antibiotique / antimycotique, mélanger et centrifuger à 524 g dans une centrifugeuse de culture tissulaire seau balancer pendant 5 min. Répéter une fois de plus pour éliminer les traces d'Libérase.
  8. Reprendre le culot dans 10 ml de DMEM/F12 médias avec 15% de FBS, 1X antibiotique / antimycotique et transférer dans un plat de 10 cm de culture de tissu et placer dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C, 5% de CO 2, 3% O 2 .
  9. Vérifiez les plaques tous les jours pour les fibroblastes et la couleur des médias. Si l'isolement a été un succès, les fibroblastes ramper hors des fragments de tissu et attacher à la plaque (figure 1). Les fibroblastes commencent à quitter les fragments de tissus dans les 2-5 jours.
  10. Si les changements de supports de la couleur au jaune, cela indique une contamination potentielle ou le surpeuplement des cellules. Examiner les plaques sous la loupe à fort grossissement. Si les bactéries, les champignons ou les vers sont présents jeter les plaques (ce qui est rarement un problème avec les animaux de laboratoire, mais peut se produire lorsque les échantillons sont prélevés dans la nature). Si aucune contamination est présente, mais les médias ont changé de couleur, cela est causé soit par trop de cellules ou de fragments de tissus trop nombreux placés dans le même plat. Si plus de 60% de la plaque est recouverte par les fibroblastes joint, changer le support sur la plaque et le transfert des fragments de tissu d'une nouvelle plaque avec les nouveaux médias. Si ce n'est pas fibroblastes de nombreux attaché à la plaque, le changement des médias et de diviser les morceaux de tissu à un 2-4 plaques.
  11. Après 7 jours, si les médias n'avaient pas été changés plus tôt, changer le support et le transfert des fragments de tissu d'une nouvelle plaque avec les nouveaux médias.
  12. Incuber les cellules et de fragments de tissus pour 7 jours supplémentaires. Par tous les jours 14 fibroblastes viables ont quitté les fragments de tissus.
  13. Après 14 jours depuis le début de l'isolement cellulaire, jeter le vieux médias et des fragments de tissus, la récolte des cellules et la plaque entre eux sur une nouvelle plaque à 5x10 5 cellules / plaque avec EMEM FBS 15%, 1X pénicilline / streptomycine, acides aminés non essentiels , et de sodium pyruvate. Les médias EMEM viendra soutenir la croissance des fibroblastes types de cellules et d'autres ne vont mourir ou d'arrêter la prolifération.
  14. Après que les cellules atteignent 80-90% de confluence, de geler une partie aliquote de cellules pour une utilisation future.
  15. Poursuivre la culture des cellules en les découpant à 5x10 5 cellules / plaque lorsque les cellules atteignent 80-90% de confluence.

4. Les résultats représentatifs

Fibroblastes normaux sont de grosses cellules avec des protubérances de premier plan (lamellipodes) (figure 2). Fibroblastes poussent en monocouche. Une culture de croissance sain contient des cellules 1-10% dans la phase M, reconnu comme arrondi cellules élevées sur la surface de la plaque, mais pas détaché de la plaque (figure 3). Typiquement, un plat de 10 cm ensemencé avec 5x10 5 cellules confluentes devient en 3-4 jours. Le temps de doublement varie considérablement entre les espèces, et peut être plus élevé pour certaines des espèces de rongeurs à long terme 1. Lorsque les cellules de remplir une plaque qu'ils arrêtent la prolifération en phase G1. Plaque d'confluent de fibroblastes contient une couche de cellules serrées (figure 4). Lorsque les cellules atteignent la confluence de 90% qu'ils sont prêts pour le fractionnement. Si désiré, les cellules peuvent être maintenues sur une plaque arrêtés confluentes pendant de longues périodes de temps avec les changements de supports réguliers (une ou deux fois par semaine).

Figure 1
Figure 1. L'isolement des fibroblastes de peau de souris (A) et du poumon (B). Les médias a été changé pour éliminer les cellules seules et les débris avant de prendre les photos au jour 7.

Figure 2
Figure 2. Fibroblastes pulmonaires de la souris.

Figure 3
Figure 3. Un champ de fibroblastes de souris contenant des cellules en M-scène, photographiée à un grossissement de 10X.

Figure 4
Figure 4. Une plaque confluent de fibroblastes de souris, photographiées à un grossissement de 10X.

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Discussion

Normale fibroblastes primaires fournissent une excellente alternative aux établie lignées cellulaires de cancer dans la recherche biologique. Un avantage important des fibroblastes est qu'ils ne portent des mutations dans les oncogènes et suppresseurs de tumeur et de maintenir intactes les points de contrôle du cycle cellulaire. Cela rend les fibroblastes normaux d'un système privilégié pour les études de la régulation du cycle cellulaire, la réparation de l'ADN, et l'apoptose. Le protocole décrit ici fournit une recette simple pour l'isolement et l'entretien des fibroblastes primaires. Ce protocole a été utilisé avec succès pour isoler les fibroblastes provenant de plus de 20 espèces de rongeurs.

Il est important de maintenir la stérilité, à tout moment lorsque vous travaillez avec des cultures de cellules pour éviter toute contamination. Si le laboratoire a aussi agressive des cultures de lignées cellulaires du cancer tels que les cellules HeLa, les fibroblastes doivent être manipulés séparément des cellules cancéreuses. Il est préférable d'avoir une hotte désigné et incubateur de cultures primaires.

Il est préférable de maintenir les cultures de cellules primaires à la concentration en oxygène physiologique de 3%. Atmosphérique (20%) d'oxygène raccourcit la durée de vie des cultures et augmente le stress oxydatif. Fibroblastes de souris sont sensibles au stress oxydatif et la sénescence ou entrez crise au sein de ~ 14 doublements de population lors maintenu à 20% (atmosphérique) de l'oxygène. Fibroblastes de souris peut être maintenu indéfiniment à 2 3% d'oxygène.

Toujours garder une trace du nombre de doublement de population des cultures. Espèces de grande taille (masse corporelle supérieur à 8000 g) sont susceptibles d'exposer la sénescence réplicative, et aura une durée de vie limitée en culture, même à 3% d'oxygène 1. Des cellules provenant de plus petites espèces, comme les souris et les rats, vont proliférer indéfiniment à 3% d'oxygène, mais peuvent éventuellement devenir aneuploïdes. Si possible, commencer les expériences utilisant des cellules au doublement de population faible.

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Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Steven Austad de nous fournir la première version de ce protocole. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH et le Ellison Medical Foundation à VG et AS

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 media Invitrogen 11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified Invitrogen 01437-036 The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic Invitrogen 15420-096
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
Liberase TM Research Grade Roche 05401127001 Replacement enzyme.
A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 05401127001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media ATCC 30-203 The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel Multiple suppliers
Three Gas Control incubator Forma or Heraeus

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References

  1. Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
  2. Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).

Comments

29 Comments

  1. Very helpful protocol. Got it working at the very first try, Would highly recommend the protocol.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 14, 2012 - 5:10 PM
  2. I have recently isolated fibroblasts from fresh fibrotic human lung. I used collagenase and plated the cells via your protocol. the cells seem to be of ² populations: one is long (²0% of plate) typical of fibroblast but the other cells are round. They look like they just started to adhere to the plate. What cells could these be? Is this happen often? COuld they be a subset of fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 4, 2012 - 9:33 AM
  3. Hi
    The round cells are epithelial cells that always accompany lung fibroblast isolation. These cells will just float. After you switch the media to EMEM (mentioned in Step 13) and start splitting the fibroblasts, these cells will go away.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:11 PM
  4. I have used your protocol successfully before on human lung tissue. However this time, the majority of our cells were epithelial- look very much like keritanocytes. Is there something we could do to only keep the fibroblasts growing- change to MEM media?
    Also, the next time we try this protocol, is there anything we can do to not get so many epithelial cells?WIll be happy for any suggestions. Thanks.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 5, 2012 - 8:14 AM
  5. Hi Barbara,
    We always get the round epithelial cells during our lung fibroblast isolation too. When you switch to EMEM media and start splitting the fibroblasts, they will be selected for and the epithelial cells will be lost.
    Next time you try the protocol, you can use EMEM media for the whole isolation procedure instead of DMEM/F1² to minimize the epithelial cells you get. But the trade-off is that the efficiency of isolation might decrease. Good luck.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:15 PM
  6. A note from the authors:
    Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3, they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 - 10 mg, Cat. no. 054011²7001 - 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 5, 2012 - 12:31 PM
  7. Thank you so much for your reply. I split them yesterday and changed the media to MEM.

    Reply
    Posted by: Barbara S.
    April 6, 2012 - 7:35 AM
  8. What is the best way to remove tissue peices on day 7? Especially with the larger tissue peices, ones that you can clearly see, produce more epithelial cells, where as the small peices (as in your pictures) produce mostly pure fibroblasts. Also, do you transplant the tissues on day 7 regardless of the confluency of your plate?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 11:59 AM
  9. On day 7, we gently aspirate the supernatant (with the tissue pieces) with a pipette, transfer it to a new plate and provide the original plate with fresh media. In this way, the small pieces attached to the plate are not disturbed and the other tissue debris with the potential to give out more fibroblasts can do so on a new plate.
    Also, yes, it is a good idea to transfer the tissues on a new plate on day 7.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 3:43 PM
  10. When you trypsinize initially, do you do this aggressively and try to remove all the cells from the plate (fibroblast and epithelial)? I have found that the fibroblasts seem to trypsinize first and can thus help to purify the culture, but my cell yield is significantly smaller (too small). Thank you for you help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:05 PM
  11. The first trypsinization dŒs not have to be aggressive. As long as all the fibroblasts are off the plate and floating, we dont worry about the epithelial cells. They usually disappear after the first couple of passages with EMEM media. The fibroblasts are fast growing and will be selected for with passaging.
    To improve the yield, I would suggest ² things in the isolation procedure : Mincing the tissue very well and incubating the tissue pieces for a longer time in the Collagenase enzyme (while taking care to avoid over-digestion).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 6, 2012 - 4:18 PM
  12. You recommend storing 0.5 mL aliquots of Blendzyme at ²8 units/ml (i.e. 14 wunsch units per aliquot) but you recommend using 0.14 units/ml in 10 mls of media, or 1.4 wunsch units per digestion) This implies each aliquot is for 10 digestions. Is this correct?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 10:59 AM
  13. Yes

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 16, 2012 - 11:04 AM
  14. After 14 days I achieve confluence and then split into fibroblast specific growth media and these cells have no trouble reaching 80-90%. When I subsequently split this population the cells senesce. Is there any obvious reason for this? It would think that 14 days of growth would cause a primary cell to senesce but your protocol suggests that I should be able to continue splitting my cells and further purfy in the process. I appreciate your help!

    Reply
    Posted by: Justin K.
    May 4, 2012 - 10:49 AM
  15. Hi Justin
    Are these mouse fibroblasts? Are you growing them in ²0% oxygen? If you are, then they will senesce. We grow all our cells in 3% oxygen and 5% CO² conditions.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 9, 2012 - 3:06 PM
  16. Hi, one of the first steps recommends to euthanize the animal and store it at 4oC. Do we complete this step even if we plan on using the animal right away? If so, for how long do we store the animal at 4oC? Is putting it on ice also acceptable?

    Reply
    Posted by: J A.
    May 13, 2012 - 7:49 PM
  17. No..It is best to use the animal right away. The 4C step is only if circumstances make it impossible to process it right away. In this case, we store the corpse at 4C(better) or on ice(in case of wild caught animals) for not more than ²4 hours.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 13, 2012 - 7:57 PM
  18. Also, another question I have is about the tissue fragments in the media. When would be the best time to remove them from the cells and replace them with media?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 14, 2012 - 12:42 AM
  19. It depends. Usually, if the media turns yellow a few days after isolation and if there aren't enough fibroblasts on the plate, we collect the fragments, suspend them in fresh media and plate them back. As the protocol says, day 14 is when we usually get rid of the tissue fragments.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 14, 2012 - 2:51 PM
  20. Hi,

    I a couple of questions about the reagents used. My first question is about the liberase enzyme used. I noticed that the liberase enzyme 3 from Roche has been discontinued. Would you recommend replacing it with the Liberase TM Research Grade medium enzyme with Thermolysin? If so, would you recommend keeping the concentration the same (.14 U/mL)? My second question is about the Fetal Bovine Serum used in this experiment. I understand that you recommend using the Qualified Fetal Bovine Serum because it has been shown to support the growth of primary fibroblast cultures. In my lab we use heat-inactivated FBS. Would you recommend me switching from heat-inactivated to qualified FBS?

    Thank you in advance for your help :)

    Reply
    Posted by: J A.
    May 21, 2012 - 11:25 AM
  21. Yes. We now use TM instead of Liberase 3 with the same concentration.
    I understand that heat-inactivation of FBS is usually done to get rid of complement factors. I don't know how critical it is for your experiments to do this but we never use heat-inactivated serum.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 3:06 PM
  22. I also have a question about plating the tissue into the media. ²4- hours after I plated my tissue pieces into the media, I looked at my cultures under the microscope and saw little round cells that adhered to the plate. I understand that the protocol mentions that fibroblasts do not typically exit the tissue for at least 48 hours, and the round epithelial cells that assist the growth of fibroblasts usually float through the media. I was just wondering if seeing these cells after ²4 hours is normal.

    Reply
    Posted by: J A.
    May 24, 2012 - 12:59 PM
  23. Yes it is normal, more for lung fibroblast isolation. Once the fibroblasts start growing, the round cells will be selected against.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    May 24, 2012 - 2:57 PM
  24. Hi,

    I was wondering what concentration of trypsin EDTA you used? I use trypsin 0.²5% trypsin EDTA to remove my cells during splitting (after an incubation time of 4 minutes). After trypsinizing the cells for 4 minutes, I have noticed that less than half of them are detached from the plate. I am afraid to leave the cells in trypsin for longer than 4 minutes because I do not want to damage them. Any suggestions?

    Reply
    Posted by: J A.
    July 18, 2012 - 1:05 AM
  25. We use Red trypsin with 0.²5% EDTA..Its very strong and we only treat cells with it for 1-² minutes. So you wash/rinse the plate with PBS after aspirating media, before adding trypsin? Because the FBS in the media inhibits trypsin activity and if the plates are not washed with PBS first, trypsin cannot act properly.

    Reply
    Posted by: Amita V.
    July 18, 2012 - 11:28 AM
  26. Thank you for such detailed procedure. I am curious is it possible that the keratinocytes also exist in the fibroblast culture? Thank you.

    Reply
    Posted by: Hua-Ling C.
    September 19, 2012 - 3:16 AM
  27. Dear all, my adult fibroblasts (GFP positive C67Bl/6 mice) are not growing very well (DMEM, high glucose, Na-pyrovate, Pen/Strp, 15%FBS). Do you have any suggestions about what I could add to the media to increase proliferation? Thanks a lot. Gunnar

    Reply
    Posted by: Gunnar P.
    March 1, 2013 - 2:03 PM
  28. Can this protocol be adapted to isolate cancer-associated fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Wei L.
    July 9, 2013 - 2:59 PM
  29. Do you know what is the best marker to check the purity of mouse lung fibroblasts?

    Reply
    Posted by: Jenny t.
    July 15, 2014 - 5:02 PM

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