Microtiter تشكيل بيوفيلم الطبق الفحص

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

ويصف وسائل الفحص السريع لقياس وقت مبكر تشكيل بيوفيلم في البكتيريا والفطريات. يستخدم هذا الأسلوب لوحة microtiter كما التحتية لتشكيل بيوفيلم الميكروبية ، وبيوفيلم هو تصور استخدام الكريستال سلالة البنفسجي. في مقايسة يوفر إما فحص نوعي أو كمي لتشكيل بيوفيلم في وقت مبكر.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437, doi:10.3791/2437 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الأغشية الحيوية هي مجتمعات الميكروبات يعلق على الأسطح ، والتي يمكن العثور عليها في المواقع الطبية والصناعية والطبيعية. في الواقع ، الحياة في بيوفيلم ربما يمثل وضع تسود لنمو الميكروبات في معظم البيئات. الأغشية الحيوية الناضجة لها خصائص متميزة قليلة. وتحاط عادة بيوفيلم الميكروبات عن طريق المصفوفة خارج الخلية التي توفر بنية وحماية للمجتمع. الميكروبات تنمو في بيوفيلم أيضا أن يكون سمة العمارة تتألف عموما من macrocolonies (التي تحتوي على آلاف من الخلايا) محاطة مملوءة بسائل القنوات. بيوفيلم نابعة من الميكروبات هي أيضا سيئة السمعة لمقاومتهم لمجموعة من العوامل المضادة للجراثيم بما فيها المضادات الحيوية ذات الصلة سريريا.

في مقايسة طبق microtiter أداة هامة لدراسة المراحل المبكرة في تشكيل بيوفيلم ، وأنها طبقت بشكل أساسي لدراسة الأغشية الحيوية البكتيرية ، وعلى الرغم من أنه تم أيضا استخدام هذا الاختبار لدراسة تشكيل بيوفيلم الفطرية. لأن هذا الاختبار يستخدم ثابت ، دفعة للنمو الشروط ، فإنه لا يسمح لتشكيل الأغشية الحيوية الناضجة التي ترتبط عادة مع أنظمة الخلية التدفق. ومع ذلك ، فقد تم فحص فعالية في تحديد العديد من العوامل اللازمة لبدء تشكيل بيوفيلم (أي ، سياط ، الشعرة ، adhesins ، والإنزيمات المشاركة في دوري - DI - GMP ملزمة والأيض) ، وكذلك الجينات المسؤولة عن إنتاج السكاريد خارج الخلية. علاوة على ذلك ، يشير إلى أن الأعمال المنشورة الأغشية الحيوية التي تزرع في أطباق microtiter القيام تطوير بعض خصائص الأغشية الحيوية الناضجة ، مثل التسامح ومقاومة للمضادات الحيوية المستجيبات الجهاز المناعي.

هذا الطبق microtiter بسيط يسمح للمقايسة تشكيل بيوفيلم على و / أو الجدار السفلي من صحن microtiter. طبيعة إنتاجية عالية للمقايسة يجعله مفيدا للشاشات الجينية ، وكذلك اختبار تشكيل بيوفيلم عن سلالات متعددة في ظل ظروف النمو المختلفة. وقد استخدمت بدائل من هذا الاختبار في وقت مبكر لتقييم بيوفيلم تشكيل لطائفة واسعة من الميكروبات ، بما في ذلك ولكن ليس على سبيل الحصر ، pseudomonads ، الضمة الكوليرية ، كولاي ، staphylocci ، المعوية ، متفطرات والفطريات.

في البروتوكول الموصوفة هنا ، سوف نركز على استخدام هذا الاختبار لدراسة تشكيل بيوفيلم التي الزائفة الزنجارية الحي النموذجي. في هذا الاختبار ، يتم قياس مدى تشكيل بيوفيلم باستخدام صبغة الكريستال البنفسجي (السيرة الذاتية). ومع ذلك ، فقد تم الإبلاغ عن عدد آخر من البقع اللونية والتمثيل الغذائي للالكمي لتشكيل بيوفيلم باستخدام مقايسة لوحة microtiter. حققت سهولة وتكلفة منخفضة ومرونة microtiter مقايسة لوحة أنها أداة حاسمة لدراسة الأغشية الحيوية.

Protocol

1. تنامي وجود بيوفيلم

  1. تنمو ثقافة الزائفة الزنجارية البرية من نوع أو سلالة متحولة بين ليلة في المتوسط ​​الغني (أي LB)
  2. تمييع الثقافة في أكثر من ليلة 1:100 متوسطة جديدة لفحوصات بيوفيلم. ومقايسة بيوفيلم القياسية المتوسطة لP. الزنجارية هو M63 المتوسطة تستكمل مع الحد الأدنى من كبريتات المغنسيوم ، والجلوكوز والأحماض casamino (انظر الجدول). كما يمكن الاستعاضة عن بيوفيلم المعززة البديلة المتوسطة التي تحفز نمو أقل العوالق وبيوفيلم أكثر قوة ، والجلوكوز والأحماض casamino مع أرجينين مثل وحيد للكربون ومصدر الطاقة.
  3. إضافة 100 ميليلتر من تخفيف لكل بئر 96 في طبق بشكل جيد. لالمقايسات الكمية ، ونحن عادة استخدام الآبار 4-8 تكرار لكل علاج.
  4. احتضان لوحة microtiter ل24/04 ساعة عند 37 درجة مئوية.

2. تلطيخ للبيوفيلم

  1. بعد مرور فترة الحضانة ، تفريغ خارج الخلايا من خلال تحويل لوحة على والرج السائل.
  2. بلطف يغرق لوحة صغيرة في حوض من الماء (أي استخدام غيض من مربعات قيعان ماصة للP1000 pipetmen والحوض). نفض الماء. كرر هذه العملية مرة ثانية. هذه الخطوة تساعد على إزالة الخلايا غير مرتبط والمكونات وسائل الاعلام التي يمكن الملون في الخطوة التالية ، ويخفض بشكل كبير تلوين الخلفية.
  3. إضافة 125 ميكرولتر من محلول 0.1 ٪ من الكريستال البنفسجي في الماء إلى كل بئر من لوحة microtiter. ارتداء قفازات ومعطف مختبر في حين جعل الحل. الحذر عند استخدام وزنها من السيرة الذاتية كما هو مسحوق hydroscopic البقع بسهولة والملابس ، والجلد ، الخ.
  4. احتضان لوحة microtiter في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
  5. شطف لوحة 3-4 مرات مع غمر المياه في حوض من الماء على النحو المبين أعلاه ، ونفض لطخة بقوة على كومة من مناشف ورقية للتخلص من لوحة كل الخلايا الزائدة وصباغة.
  6. بدوره لوحة microtiter رأسا على عقب والجافة لبضع ساعات أو طوال الليل.
  7. للفحوصات النوعية ، ويمكن تصويرها عند الآبار الجافة.

3. قياس بيوفيلم

  1. إضافة 125 ميليلتر من حمض الخل 30 ٪ في كل بئر ماء لوحة من لmicrotiter solubilize السيرة الذاتية.
  2. احتضان لوحة microtiter في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-15 دقيقة.
  3. نقل 125 ميكرولتر من السيرة الذاتية solubilized إلى شقة جديدة طبق microtiter القاع.
  4. قياس الامتصاصية في قارئ لوحة عند 550 نانومتر باستخدام حمض الخليك بنسبة 30 ٪ في ماء فارغة.

4. ممثل النتائج :

الشكل 1
الشكل 1. يظهر نتيجة لممثل فحوصات أجريت لتشكيل بيوفيلم الزائفة الزنجارية ، الزائفة المتألقة والمكورات العنقودية الذهبية. (أ) عرض الجانب من البئر مع بيوفيلم من الزنجارية P. (8 ساعات و 37 درجة مئوية). (ب) وعرض الجانب من البئر مع بيوفيلم من P. المتألقة (6 ساعات و 30 درجة مئوية). (ج) شكلت وجهة نظر من أعلى إلى أسفل من بيوفيلم س. المذهبة في لوحة مسطحة القاع microtiter (بئرين ، 24 ساعة و 37 درجة مئوية). P. والزنجارية P. المتألقة كلاهما الكائنات متحركة وتشكيل بيوفيلم في واجهة الهواء السائل. S. المذهبة وغير متحركة ، وتشكل بيوفيلم في قاع البئر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يمكن تعديل هذه الطريقة للاستخدام مع طائفة واسعة من الأنواع الجرثومية. الميكروبات متحركة تلتزم عادة على الجدران و / أو قيعان الآبار ، بينما غير متحركة الميكروبات تلتزم عادة إلى أسفل الآبار. يجب تحديد الظروف المثلى لتشكيل بيوفيلم (أي نمو متوسطة ، ودرجة الحرارة ، والوقت من الحضانة) تجريبيا لكل ميكروب. أوصي أداء متعددة متماثلة لكل سلالة أو شرط (4-8) ، وبما في ذلك مراقبة إيجابية ، وإذا أمكن ، لمراقبة سلبية على كل لوحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

بي بفضل كوتشما شيري ، وروبرت بيت نيويل السيقان لتقديم الصور في الشكل 1. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01AI083256 لغاو

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 X M63 Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
K2HPO4 Fisher Scientific P288-500
(NH4)2SO4 Sigma-Aldrich A5132
Magnesium sulfate Fisher Scientific M63-500 Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Glucose Fisher Scientific D16-3 Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Casamino acids BD Biosciences 223050 Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Arginine Sigma-Aldrich A5131 Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
Microtiter plates BD Biosciences 353911 Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated.
Microtiter plate lids BD Biosciences 353913 The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water.
Crystal violet Sigma-Aldrich 229641000 Prepare as a 0.1% solution in water.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
  2. O'Toole, G. A. Methods in Enzymology. Doyle, R. J. Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).
  3. Mah, T. F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
  4. Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).
  5. Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14. J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).
  6. Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G. A. Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces. Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).
  7. Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).
  8. Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein. Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).
  9. Mack, D. Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin. Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).
  10. Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
  11. Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).

Comments

2 Comments

  1. Please advise me on the subscribtion as my librarian tried to do the subscribtion but she failed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 21, 2011 - 7:23 PM
  2. Hello Najla - What school you attend and whom is your librarian? If they are attempting to subscribe I can absolutely assist them in doing so.

    Best wishes,

    Ward Parry
    Director of Library Relations

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2011 - 10:27 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics