Microtiter डिश biofilm गठन परख

Immunology and Infection

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Summary

परख के लिए एक तेजी से करने के लिए जीवाणु और कवक में जल्दी biofilm गठन को मापने का मतलब है वर्णन. इस विधि माइक्रोबियल biofilm गठन के लिए बुनियाद के रूप में एक microtiter प्लेट का उपयोग करता है, और biofilm क्रिस्टल बैंगनी तनाव का उपयोग करने के लिए कल्पना है. परख या तो जल्दी biofilm गठन के लिए एक गुणात्मक या मात्रात्मक परख प्रदान करता है.

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O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437, doi:10.3791/2437 (2011).

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Abstract

Protocol

1. एक Biofilm बढ़ाएं

  1. जंगली प्रकार Pseudomonas aeruginosa या एक अमीर मध्यम में रात भर उत्परिवर्ती तनाव है (यानी लेग) के एक संस्कृति आगे बढ़ें
  2. Biofilm assays के लिए ताजा मध्यम में रात संस्कृति 1:100 पतला. पी. के लिए एक मानक biofilm परख मध्यम aeruginosa M63 न्यूनतम मैग्नीशियम सल्फेट, ग्लूकोज और casamino एसिड (टेबल देखें) के साथ पूरक माध्यम है . एक वैकल्पिक biofilm माध्यम है कि कम planktonic विकास और एक और अधिक मजबूत biofilm, ग्लूकोज और casamino एसिड को बढ़ावा देने को बढ़ावा देने के रूप में एकमात्र कार्बन और ऊर्जा के स्रोत के रूप में arginine के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
  3. एक 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति कमजोर पड़ने के 100 μL जोड़ें. मात्रात्मक assays के लिए, हम आम तौर पर प्रत्येक उपचार के लिए 4-8 को दोहराने के कुओं का उपयोग करें.
  4. 4-24 बजे के लिए 37 microtiter प्लेट सेते डिग्री सेल्सियस

2. Biofilm धुंधला

  1. ऊष्मायन के बाद, प्लेट मोड़ पर और बाहर तरल मिलाते द्वारा कोशिकाओं डंप.
  2. धीरे पानी की एक छोटी टब में डूब थाली (यानी, टब रूप P1000 pipetmen के लिए विंदुक टिप बक्से के नीचे का उपयोग करें). बाहर पानी हिलाएँ. इस प्रक्रिया को एक दूसरी बार दोहराएँ. इस कदम में मदद करता है स्वाधीन कोशिकाओं और मीडिया घटक है कि अगले चरण में दाग जा सकता है निकालने के लिए, और काफी पृष्ठभूमि धुंधला को कम करती है.
  3. Microtiter प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से पानी में क्रिस्टल वायलेट के एक 0.1% समाधान के 125 μL जोड़ें. जबकि समाधान बनाने के दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट पहनें. सावधानी बरतें जब बाहर CV वजन के रूप में hydroscopic पाउडर और आसानी से दाग कपड़ों, त्वचा, आदि है
  4. कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए microtiter प्लेट सेते हैं.
  5. ऊपर उल्लिखित के रूप में पानी के टब में submerging द्वारा थाली पानी के साथ 3-4 बार कुल्ला करने के लिए, बाहर शेक और कागज तौलिये के ढेर पर सख्ती दाग ​​करने के लिए सभी अतिरिक्त कोशिकाओं और डाई की थाली छुटकारा.
  6. Microtiter प्लेट उल्टा मुड़ें और कुछ घंटे या रात भर के लिए सूखी.
  7. गुणात्मक assays के लिए, कुओं सूखी जब फोटो खिंचवाने जा सकता है.

3. Biofilm बढ़ाता

  1. Microtiter प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 30% पानी में एसिटिक एसिड के 125 μL जोड़ें CV solubilize.
  2. कमरे के तापमान पर 10-15 मिनट के लिए microtiter प्लेट सेते हैं.
  3. एक नया फ्लैट तली microtiter पकवान solubilized CV के 125 μL स्थानांतरण.
  4. पानी में खाली के रूप में 30% एसिटिक एसिड का उपयोग कर 550 एनएम पर एक प्लेट रीडर में absorbance यों.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1
चित्रा 1 biofilm गठन Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens और Staphylococcus aureus के लिए प्रदर्शन assays के लिए एक प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है. (ए) पी. aeruginosa (8 बजे 37 ° C) के एक biofilm के साथ अच्छी तरह से एक तरफ देखने . (बी) अच्छी तरह से एक पी. के साथ एक biofilm तरफ देखने fluorescens (6 बजे, 30 डिग्री सेल्सियस). (सी) ऊपर से नीचे biofilm के दृश्य एस द्वारा गठित पी. microtiter फ्लैट नीचे की थाली में aureus (दो कुओं, 24 घंटे, 37 डिग्री सेल्सियस). aeruginosa और पी. fluorescens दोनों चलता - फिरता जीव हैं और हवा तरल अंतरफलक पर एक biofilm फार्म. एस aureus गैर चलता - फिरता है और अच्छी तरह से नीचे पर एक biofilm रूपों.

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Discussion

इस विधि माइक्रोबियल प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता के साथ प्रयोग के लिए संशोधित किया जा सकता है. चलता - फिरता रोगाणुओं आम तौर पर दीवारों और / या कुओं के नीचे का पालन करना है, जबकि गैर - चलता - फिरता रोगाणुओं आमतौर पर कुओं के नीचे का पालन करें. biofilm गठन (यानी, मध्यम विकास, तापमान, ऊष्मायन के समय) के लिए इष्टतम स्थितियों प्रत्येक सूक्ष्म जीव के लिए निर्धारित empirically चाहिए. मेरा सुझाव है एकाधिक प्रदर्शन प्रत्येक तनाव या शर्त (4-8) के लिए प्रतिकृति, और एक सकारात्मक नियंत्रण सहित, और यदि संभव हो तो, प्रत्येक प्लेट पर एक नकारात्मक नियंत्रण.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

शेरी Kuchma, पीट Newell और चित्रा 1 में छवियों को प्रदान करने के लिए रॉबर्ट Shanks मेरा धन्यवाद. इस काम NIH अनुदान R01AI083256 द्वारा गाओ करने के लिए समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 X M63 Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
K2HPO4 Fisher Scientific P288-500
(NH4)2SO4 Sigma-Aldrich A5132
Magnesium sulfate Fisher Scientific M63-500 Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Glucose Fisher Scientific D16-3 Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Casamino acids BD Biosciences 223050 Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Arginine Sigma-Aldrich A5131 Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
Microtiter plates BD Biosciences 353911 Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated.
Microtiter plate lids BD Biosciences 353913 The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water.
Crystal violet Sigma-Aldrich 229641000 Prepare as a 0.1% solution in water.

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References

  1. O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
  2. O'Toole, G. A. Methods in Enzymology. Doyle, R. J. Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).
  3. Mah, T. F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
  4. Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).
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Comments

2 Comments

  1. Please advise me on the subscribtion as my librarian tried to do the subscribtion but she failed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 21, 2011 - 7:23 PM
  2. Hello Najla - What school you attend and whom is your librarian? If they are attempting to subscribe I can absolutely assist them in doing so.

    Best wishes,

    Ward Parry
    Director of Library Relations

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2011 - 10:27 AM

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