Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Tahlil, bakteri ve mantar erken biyofilm oluşumunu ölçmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem mikrotiter plate mikrobiyal biyofilm oluşumu için alt tabaka olarak kullanır ve biyofilm kristal viyole suşu kullanılarak görüntülenmiştir. Tahlil ya erken biyofilm oluşumu için bir kalitatif veya kantitatif sağlar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437, doi:10.3791/2437 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biyofilmler, tıbbi, endüstriyel ve doğal ortamlarda bulunabilir yüzeylere bağlı topluluklar, mikrop. Aslında, bir biyofilm yaşam muhtemelen çoğu ortamda mikropların büyüme baskın modu temsil eder. Olgun biyofilm birkaç farklı özellikleri var. Biyofilm mikropların genellikle toplum yapısı ve koruma sağlayan bir ekstrasellüler matriks ile çevrilidir. Bir biyofilm büyüyen Mikroplar genellikle sıvı dolu kanallar ile çevrili macrocolonies (binlerce hücre içeren) oluşan karakteristik bir mimariye sahip. Biyofilm yetiştirilen mikropların da, klinik olarak ilgili antibiyotik gibi antimikrobiyal ajanların bir dizi karşı direniş için kötü üne sahip.

Mikrotiter çanak testi, biyofilm oluşumu erken aşamalarında çalışma için önemli bir araçtır ve bu testte de, mantar biyofilm oluşumunu incelemek için kullanılmış olmasına rağmen, bakteriyel biyofilm çalışma için öncelikle tatbik edilmiştir. Bu testte, statik, toplu büyüme koşulları kullanır, çünkü genellikle akış hücresi sistemleri ile ilişkili olgun biyofilm oluşumu için izin vermez. Ancak, tahlil ve ekstrasellüler polisakkarit üretimi genler gibi biyofilm oluşumu başlangıcında (yani, kamçı, pili, adhezinleri siklik-di-GMP bağlayıcı ve metabolizmasında yer alan enzimler) için gerekli birçok faktör tespit etkili olmuştur. Ayrıca, yayınlanan iş mikrotiter yemekleri yetiştirilen biyofilm, bağışıklık sistemi etkileyiciler böyle bir antibiyotik hoşgörü ve direnç olgun biyofilm bazı özelliklerini geliştirmek olduğunu gösterir.

Bu basit mikrotiter çanak tahlil duvar ve / veya bir mikrotiter çanak alt bir biyofilm oluşumunu sağlar. Testin yüksek verim doğa genetik ekranlar için yararlı yanı sıra çeşitli büyüme koşulları altında birden fazla suşları tarafından test biyofilm oluşumu yapar. Bu testte Türevleri erken biyofilm oluşumu dahil olmak üzere, mikropların geniş bir yelpazede, değerlendirmek için kullanılan, ancak pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, stafilokoklar, enterokoklar, mikobakteriler ve mantarlar , sınırlı olmuştur.

Burada açıklanan protokol, model organizma Pseudomonas aeruginosa tarafından biyofilm oluşumunu incelemek için bu testin kullanımı üzerinde durulacak. Bu testte, biyofilm oluşumu ölçüde boya kristal viyole (CV) kullanılarak ölçülür. Ancak, diğer kolorimetrik ve metabolik lekeleri sayısı ölçümü için mikrotiter plate assay kullanarak biyofilm oluşumu bildirilmiştir. Mikrotiter plate testinin kolaylığı, düşük maliyet ve esneklik biyofilm çalışma için kritik bir araç haline getirmiştir.

Protocol

1. Biyofilm Büyüyen

  1. Yabani tip Pseudomonas aeruginosa veya gece boyunca zengin bir ortamda mutant suş (yani LB) bir kültür büyütün
  2. Biyofilm deneyleri için taze ortama aşırı gece kültür 1:100 sulandırınız. P. için standart bir biyofilm tahlil orta aeruginosa M63 minimal orta magnezyum sülfat, glukoz ve casamino asitleri (Tablo) ile desteklenmiş. Alternatif bir biyofilm teşvik etmek, daha az planktonik büyüme ve daha sağlam bir biyofilm, glikoz ve casamino asitler uyarır orta arginin tek karbon ve enerji kaynağı olarak değiştirilebilir.
  3. 96 tabak içinde de başına seyreltme 100 mcL ekleyin. Kantitatif testleri için, her tedavi için genellikle 4-8 çoğaltmak kuyu kullanın.
  4. Mikrotiter plate inkübe 4-24 saat 37 ° ° C.

2. Biyofilm Boyama

  1. Inkübasyondan sonra, plaka ters çevirip sallayarak dışarı sıvı hücreleri dökümü.
  2. Su küçük bir teknenin içinde yavaşça batığın plaka (yani, küvet gibi P1000 pipetmen dipleri için pipet ucu kutuları kullanın). Suyu dışarı sallayın. Bu işlemi ikinci kez tekrarlayın. Bu adım, bir sonraki adımda lekeli olabilir unattached hücreleri ve medya bileşenleri kaldırmak yardımcı olur ve arka plan boyama önemli ölçüde düşürür.
  3. Mikrotiter plate her bir kuyunun su kristal viyole 0.1% çözelti 125 mcL ekleyin. Çözüm yaparken eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. CV, toz hidroskopik ve lekeleri hazır giyim, deri, vb gibi tartım sırasında dikkatli kullanın
  4. Mikrotiter plate 10-15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  5. Yukarıda da belirtildiği gibi su dolu bir küvete daldırarak plaka 3-4 kez su ile durulayın, ayıklandığı ve tüm aşırı hücreleri ve boya plaka kurtulmak için bir yığın kağıt havlu üzerine şiddetle kurulayın.
  6. Mikrotiter plate baş aşağı çevirin ve birkaç saat veya gece boyunca kurumaya.
  7. Zaman kuru kalitatif testlerde, kuyular fotoğrafı olabilir.

3. Biyofilm miktarının

  1. CV çözünür mikrotiter plate her bir kuyunun su% 30 asetik asit 125 mcL ekleyin.
  2. Mikrotiter plate 10-15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  3. Yeni bir düz dipli mikrotiter çanak çözündüğünü CV 125 mcL aktarın.
  4. Sayısal olarak bir plaka okuyucu boş olarak su% 30 asetik asit kullanılarak 550 nm'de absorbans.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Şekil 1
Şekil 1 biyofilm oluşumu deneyleri için Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens ve Staphylococcus aureus için yapılan temsili bir sonuç göstermektedir. (A) P. aeruginosa (8 saat, 37 ° C) bir biyofilm ile iyi bir yan görünümü. (B) P. biyofilm ile iyi bir yan görünüm fluorescens (6 saat, 30 ° C). (C) biyofilm yukarıdan aşağıya görünüm S. kurdu düz bir alt mikrotiter plate aureus (iki kuyu, 24 saat, 37 ° C) P.. aeruginosa ve P. fluorescens hem hareketli organizmalar ve hava-sıvı arayüzü biyofilm oluşturmaktadır. S. aureus olmayan hareketli ve iyi altındaki bir biyofilm oluşturmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yöntem, çok çeşitli mikrobiyal türlerin kullanım için modifiye edilebilir. Non-motil mikropların genellikle kuyuların dibine bağlı hareketli mikropların genellikle, duvarlar ve / veya kuyuların dipleri bağlı. Biyofilm oluşumu (yani, büyüme ortamı, sıcaklığı, kuluçka süresi) için optimal koşulları her mikrop için ampirik olarak tespit edilmelidir. Ben her tür ya da durum (4-8) birden fazla performans için her bir plaka üzerinde bir negatif kontrol çoğaltır ve olumlu bir kontrolü de dahil olmak üzere tavsiye, ve eğer mümkünse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Sherry Kuçma, Pete Newell ve Robert Shanks Şekil 1 görüntüleri sağlamak için teşekkür ederim. Bu çalışma GAO, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe R01AI083256 tarafından desteklenen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 X M63 Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
K2HPO4 Fisher Scientific P288-500
(NH4)2SO4 Sigma-Aldrich A5132
Magnesium sulfate Fisher Scientific M63-500 Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Glucose Fisher Scientific D16-3 Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Casamino acids BD Biosciences 223050 Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave.
Arginine Sigma-Aldrich A5131 Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
Microtiter plates BD Biosciences 353911 Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated.
Microtiter plate lids BD Biosciences 353913 The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water.
Crystal violet Sigma-Aldrich 229641000 Prepare as a 0.1% solution in water.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
  2. O'Toole, G. A. Methods in Enzymology. Doyle, R. J. Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).
  3. Mah, T. F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
  4. Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).
  5. Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14. J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).
  6. Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G. A. Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces. Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).
  7. Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).
  8. Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein. Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).
  9. Mack, D. Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin. Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).
  10. Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
  11. Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).

Comments

2 Comments

  1. Please advise me on the subscribtion as my librarian tried to do the subscribtion but she failed.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 21, 2011 - 7:23 PM
  2. Hello Najla - What school you attend and whom is your librarian? If they are attempting to subscribe I can absolutely assist them in doing so.

    Best wishes,

    Ward Parry
    Director of Library Relations

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2011 - 10:27 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics