iCLIP - トランスクリプトーム全体の個々のヌクレオチド分解能タンパク質- RNA相互作用のマッピング

Biology
 

ERRATUM NOTICE

Summary

転写でRNA結合蛋白質の空間配置は、転写後調節の重要な決定要因である。したがって、我々は、RNA結合タンパク質の結合部位の正確なゲノムワイドなマッピングを可能にする個々のヌクレオチドの解像度のUV架橋及び免疫沈降(iCLIP)を開発。

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Konig, J., Zarnack, K., Rot, G., Curk, T., Kayikci, M., Zupan, B., Turner, D. J., Luscombe, N. M., Ule, J. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. J. Vis. Exp. (50), e2638, doi:10.3791/2638 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

転写でRNA結合タンパク質(RBPs)のユニークな組成と空間配置は、転写後調節1の多様な側面をガイド。したがって、分子レベルでの転写調節を理解することに向けた重要なステップはRBPs 2の結合部位の位置情報を得ることです。

タンパク質- RNA相互作用は、生化学的手法を用いて検討することができますが、これらのアプローチは、そのネイティブ細胞状況でのRNA結合に対処していない。ディファレンシャルディスプレイやマイクロアレイ分析(RIP -チップ)3-5と組み合わせてアフィニティー精製や免疫沈降法を採用し、携帯環境でのタンパク質- RNA複合体を研究する初期の試み。これらのアプローチは、間接的または非生理的な相互作用6を識別する傾向があった。特異性と位置分解能を向上させるためには、CLIP(UV架橋及び免疫沈降)と呼ばれる戦略は7,8を導入されました。 CLIPは、UV架橋変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を含む厳密な精製スキームとタンパク質とRNA分子のを兼ね備えています。ハイスループットシーケンシング技術と組み合わせることで、CLIPはゲノムワイドスケールでのタンパク質- RNA相互作用(HITS - CLIPまたはCLIP - seqと呼ばれる)9,10を研究する強力なツールとして証明されています。最近では、PAR - CLIPは、11,12の架橋のために光反応性リボヌクレオシド類似体を使用することを導入されました。

得られたデータの高い特異性にもかかわらず、CLIPの実験は、しばしば限られたシーケンスの複雑さのcDNAライブラリーを生成します。これは部分的に共精製されたRNAの制限された量とライブラリの準備に必要な2つの非効率的なRNAのライゲーション反応によるものです。さらに、プライマー伸長アッセイは、多くのcDNAが架橋ヌクレオチド13で途中で切り捨てることが示された。そのような切り詰められたcDNAは、標準のクリップライブラリの準備のプロトコル中に失われます。我々は最近、より効率的な分子内cDNAを環状化(図1)14で非効率的な分子間のRNAライゲーションのステップのいずれかに置き換えることによって切り捨てられたcDNAをキャプチャiCLIP(個々のヌクレオチドの解像度のCLIP)を、開発しました。重要なことは、切り捨てられたcDNAを配列決定する塩基の解像度でクロスリンク部位の位置への洞察を提供します。私たちは正常にゲノムワイドな規模でのhnRNP C粒子の組織を研究し、スプライシングの調節14にその役割を評価するiCLIPを適用する。

Protocol

1。 UV架橋組織培養の細胞

  1. メディアを取り出して、10cmのプレート(十分な三つの実験用)で培養した細胞を6 mlの氷冷したPBSを加える。
  2. 氷の上に蓋と場所を削除します。 254nmで少なくとも150ミリジュール/ cm 2の一回照射する。
  3. セルリフターでこすることにより細胞を収集する。
  4. threeマイクロチューブの各々に2 mlの細胞懸濁液を移す。 4℃で10秒トップスピードでスピンは℃で、細胞をペレット化し、上清を除去します。
  5. スナップインの凍結-80ドライアイスとストアの細胞ペレットを° C使用時まで。

2。ビーズの準備

  1. 新鮮なマイクロチューブに実験あたり蛋白質ダイナビーズ(DYNAL、100.02)(マウスまたはヤギ抗体をプロテインGのダイナビーズを使用)100μLを加える。
  2. 溶解バッファー(; 100mMのNaCl、1%NP - 40、0.1%SDS、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、100分の1プロテアーゼ阻害剤カクテルIII、Calbiochem社の50mM Tris - HCl、pH7.4)で2倍のビーズを洗浄する。
  3. 20から10μgの抗体を用いた100μlの溶解バッファーでビーズを再懸濁します。
  4. 30〜60分間室温でチューブを回転させる。
  5. 900μlの溶解緩衝液で3倍洗浄し、4.1のステップに進むために準備されるまで最後の洗浄に残す。

3。細胞溶解および部分的なRNAの消化

  1. 1mlの溶解緩衝液と1.5 mlのマイクロチューブへの転送で細胞ペレットを再懸濁します。
  2. アーゼI(Ambion社、AM2295)の1 / 500希釈を準備します。 10μlのRNaseの私の希釈だけでなく、細胞溶解液に2μlのターボDNaseを追加(1 / 500アーゼIの希釈液[低アーゼ]ライブラリの準備のために使われ、50分の1希釈液[高アーゼ]抗体の特異性のために制御することが必要です) 。
  3. 1100 rpmで振盪し、37℃で正確に3分間° Cのサンプルをインキュベートする。すぐに氷に転送する。
  4. 4℃とライセートをクリアするには、20分間22000グラムを回転させる。慎重に(ペレットと約50μlのライセートを残す)上清を集める。

4。免疫沈降

  1. ビーズ(ステップ2.5から)から、洗浄バッファーを除去し、細胞溶解液を(ステップ3.4から)を追加。
  2. 4℃で2時間のサンプルを回転℃に
  3. 上清を捨て、900μlの高塩緩衝液(50mMトリス- HCl、pH 7.4; 1MのNaCl、1mMのEDTA、1%NP - 40、0.1%SDS、0.5%デオキシコール酸ナトリウム)と2倍のビーズを洗浄する。
  4. 900μlの洗浄バッファー(; 10mMのMgCl 2、0.2%Tween - 20を20mMトリス- HCl、pH7.4)で2倍洗浄する。

5。 RNA 3'末端の脱リン酸化

  1. 上清を捨て、20μlのPNKミックス(15μlの水、4μlの5 × PNKのpH6.5の緩衝液[350mMTris -塩酸、pH 6.5、50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0.5μlのPNKの酵素、0.5μlのRNasin [プロメガ社製])でビーズを再懸濁します。
  2. 37℃で20分間インキュベート℃に
  3. 500μlの洗浄バッファーを追加し、高塩濃度緩衝液で1倍を洗う。
  4. 洗浄バッファーで2倍洗浄する。

6。 3'末端をRNAにリンカーライゲーション

  1. 注意深く上清を除去し、(9μlの水、20μlのライゲーションミックスでビーズを再懸濁し、4μlの4倍のライゲーションバッファー[200 mMTris -塩酸、40mのMM GCL 2、40mMのジチオスレイトール]、1μlのRNAリガーゼ[NEB];0.5μlのRNasin [プロメガ]、1.5μlのプレポリアデニル化リンカL3 [20μM];4μlのPEG400 [81170、シグマ])。
  2. 16歳で一晩インキュベート℃、
  3. 500μlの洗浄バッファーを追加してから、1ミリリットル高塩濃度緩衝液で2倍の洗浄。
  4. 回目の洗浄を1 mlで1 mlの洗浄バッファーで2倍とまま洗う。

7。 RNAの5'末端標識

  1. 上清を除去し、ホットPNKミックス8μlでビーズを再懸濁(0.4μLPNK [NEB]; 0.8μlを32 P -γ- ATP、0.8μlの10 × PNKバッファ[NEB]、6μlの水)。
  2. 37℃で5分間インキュベート℃を
  3. ホットPNKミックスを削除し、20μlの1 × Nupageのローディングバッファー(Invitrogen)中でビーズを再懸濁します。
  4. ℃で10分間、70℃サーモミキサーでインキュベートする。
  5. すぐに沈殿するために磁石の上に空のビーズを配置し(ステップ8を参照)ゲル上清をロードする。

8。 SDS - PAGEおよび膜の転送

  1. 4-12%NuPAGE製造業者の指示に従ってビス - トリスゲル(Invitrogen社)にサンプルをロードする。緩衝液(Invitrogen)を実行して1 × MOPS 0.5リットルを使用してください。また、事前に染色されたタンパク質サイズマーカー(たとえば、このページの定規に加え、Fermentas、SM1811)の5μlをロードする。
  2. 180℃で50分間ゲルを実行V.
  3. ゲルの前面を削除し、固形廃棄物(遊離放射性ATPを含む)として廃棄する。
  4. ゲルからメーカーの指示(Invitrogen社、30 Vで転送1時間)に応じてNOVEXウェット転写装置を用いてニトロセルロース膜にタンパク質- RNA複合体を転送する。
  5. 転送後、PBSバッファーでメンブレンを洗い流した後、サランラップに包んで、-80 ° C(場所後のtを揃えるために膜の横の蛍光ステッカーをで富士フィルムに公開彼フィルムとメンブレン、30分、1時間と一晩のためのエクスポージャーを実行)。

9。 RNA分離

  1. マスクとして、ステップ8.5からオートラジオグラフを用いて、低RNaseの実験から、タンパク質- RNA複合体を分離する。いくつかの小さなスライスに膜のこの部分を切り取り、1.5 mlマイクロチューブに入れます。
  2. 膜片にし、10μlのプロテ​​イナーゼK(ロシュ、03115828001)200μlのPKバッファー(10mMのEDTA; 50mMのNaCl 100mMのトリス- HCl pH7.4)を追加します。 37℃で20分間1100 rpmで振盪しながらインキュベート℃を
  3. PKureaバッファ(; 50mMのNaCl、10mMのEDTA、100mMトリス- HCl pH7.4の7 M尿素)200μlを加え、37℃で20分間インキュベート℃を
  4. 解決策を収集し、RNAをフェノール/クロロホルム400μlの(Ambion社、9722)2 mlの位相ロックジェルヘビーチューブ(713〜2536、VWR)にそれを一緒に加える。
  5. 1100 rpmで振盪し、30℃で5分間℃でインキュベートする。室温で13,000 rpmで5分間回転させて位相を区切ります。
  6. (ピペットでゲルに触れないよう注意してください)​​を新しいチューブに水層を移す。 0.5μlのglycoblue(Ambion社、9510)と40μlの3 M酢酸ナトリウム液(pH5.5)と混合する。その後、1ミリリットルの100%エタノールを加える、-20℃で一晩再び混合し、沈殿

10。逆転写

  1. 15000回転、4で20分間スピン℃に上清を除去し、0.5ml 80%エタノールでペレットを洗浄。
  2. 7.25μlのRNA /プライマーミックスでペレットを再懸濁し(6.25μlの水、0.5μlのRCLIPのプライマー[0.5pmol/μl];0.5μlのdNTPミックス[10mMの])。各実験や複製については、個々のバーコードのシーケンスを(14を参照)を含む異なるRCLIPのプライマーを使用してください。
  3. 70℃で5分間インキュベート° C 25℃に冷却する前に
  4. 2.75μlのRTミックス(;0.5μlの0.1M DTT、0.25μlを上付きIII逆転写酵素[インビトロジェン] 2μlの5 × RTバッファー)を追加します。
  5. ° C、42℃で20分° C、50℃40分80℃、5分間4℃℃に冷却する前に、Cは25で5分間インキュベート
  6. 90μlのTEバッファー、0.5μlのglycoblueと10μlの酢酸ナトリウムのpHは5.5とミックスを追加。その後、250μlの100%エタノールを追加し、-20℃で一晩再び混合し、沈殿

11。 cDNAのゲルの浄化

  1. スピンダウンすると(10.1を参照)のサンプルを洗い、その後水6μlにペレットを懸濁します。
  2. 6μlの2 × TBE -尿素のローディングバッファー(Invitrogen社)を追加します。熱サンプルを80℃に直接ロードする前に、3分間。
  3. プレキャスト6パーセントTBE -尿素ゲル(Invitrogen社)にサンプルをロードし、製造業者によって説明されているように180 Vで40分間実行する。また、その後のカット​​(下記参照)のための低分子量マーカーをロードする。
  4. 120から200 NT(高)、85から120ヌクレオチド(培地)と70〜85ヌクレオチド(低)で3つのバンドをカット。 theupperの染料と(図3を参照)切除を導くためにプラスチック製のゲルのサポート上のマークを使用してください。そのRCLIPのプライマーおよびL3のシーケンスが一緒にCLIPのシーケンスの52 NTのアカウントを注意してください。
  5. 400μlのTEを追加し、1 mlのシリンジのプランジャーを使用して小片にゲルスライスを押しつぶす。 37℃2時間1,100 rpmで振盪しながらインキュベート℃に
  6. 場所コスターSpinXの列(コーニング社、8161)に2つの1 cmのガラスプレフィルター(ワットマン、1823010)。カラムにサンプルの液体部分を転送します。 1.5 mlチューブに13,000 rpmで1分間スピン。
  7. 0.5μlのglycoblueと40μlの酢酸ナトリウムのpHは5.5を追加してから、サンプルを混ぜる。 1ミリリットルの100%エタノールを追加し、-20℃で一晩再び混合し、沈殿

12。 cDNAの5'末端にプライマーのライゲーション

  1. スピンダウンとサンプルを洗う(10.1参照)、その後、8μlのライゲーションミックスでペレットを再懸濁(6.5μlの水、0.8μlの10xのCircLigaseバッファーII、0.4μLの50mMのMnCl 2を 、0.3μL、Circligase II [EPICENTRE])とインキュベート60℃で1時間
  2. 30μlのオリゴアニーリング混合追加(26μlの水を、3μlのFastDigestバッファ[Fermentas];1μlのcut_oligo [10μM])。 95℃で1分間インキュベート℃にその後、毎20秒に1ずつ温度を下げる° Cを25日まで℃に達しています。
  3. 2μlのBamHI部位(高速Fermentas)と37℃で30分間インキュベート℃を追加
  4. 50μlのTEおよび0.5μlのglycoblueとミックスを追加。 10μlの酢酸ナトリウムのpHは5.5とミックスを追加してから、250μlの100%エタノールを加える。 -20℃で再び混ぜ合わせ、一晩沈殿

13。 PCRの増幅

  1. スピンダウンすると(10.1を参照)のサンプルを洗浄し、19μlの水でペレットを再懸濁します。
  2. (;1μlのプライマー混合P5/P3 solexa、10μMの各、20μlのAccuprimeスーパーミックス1酵素[インビトロジェン] 19μlのcDNA)をPCRミックスを調製する。
  3. 以下のPCRのプログラム実行:25-35サイクル 、68℃で3分間、4 [30秒、94℃で15秒、65℃で30秒→68℃] 94℃2分間を、° C永遠に。
  4. プレキャスト6パーセントTBEゲル(Invitの2 5倍TBEローディング緩衝液の液と負荷で8μlのPCR産物を混ぜてロゲン)。 Sybrgreen I(Invitrogen社)でゲルを染色し、ゲルイメージャーで分析する。
  5. RCLIPのプライマーのバーコードは、ハイスループットシーケンシングのために提出する前に、多重異なるサンプルすることができます。シークエンシングのためのライブラリの15μLを提出し、残りを保存する。

14。リンカーとプライマー配列

プレポリアデニル3'リンカーDNA:

[我々は、20μMのアリコートを作成してIDTからDNAアダプターを注文して。]

DNA

15。代表的な結果:

膜の転送(ステップ8.5)およびPCR産物(ステップ13.4)のゲルイメージの後にタンパク質- RNA複合体のオートラジオグラフ:iCLIPライブラリの塩基配列決定に先立って、実験の成功は、2つの手順でモニターできます。低RNaseの試料のオートラジオグラフでは、びまん性放射能はタンパク質の分子量(図2、サンプル4)の上に見られるべきである。高のRNaseのサンプルの場合は、この放射能が近いタンパク質の分子量(図2、サンプル3)に焦点を当てています。は抗体が免疫沈降で使用されていない場合、シグナルは(図2、サンプル1及び2)検出されるべきである。免疫沈降の特異性のためのさらなる重要な制御には、関心14のタンパク質を発現していないUV照射または使用セルを省略する。

PCR産物(ステップ13.4)のゲルイメージは、ステップ11.4(図4、レーン4-6)で精製したcDNAの割合(高、中、低)に対応するサイズの範囲を示す必要があります。 PCRプライマーP3SolexaとP5SolexaはcDNAのサイズに追加の76 NTを導入することに注意してください。は抗体が免疫沈降中に使用されていない場合は、対応するPCR産物が(図4、レーン1-3)を検出するべきではありません。プライマーダイマーの製品は、約140 NTで表示できます。

ハイスループットシーケンシングおよびその後のバイオインフォマティクス解析の代表的な結果を得るために14を参照してください。

図1
図1。iCLIPプロトコルの模式図。タンパク質- RNA複合体は、UV照射(ステップ1)を用いてin vivoで共有結合をクロスリンクされています。目的のタンパク質が結合したRNA(ステップ2-5)と一緒に精製される。最後放射能(ステップ6および7)ラベル付けされている逆転写の配列特異的なプライミングを可能にするため、RNAのアダプタは、5'のに対し、RNAの末尾"を3に連結される。架橋タンパク質- RNA複合体はSDS - PAGEおよび膜の転送(ステップ8)を使って無料のRNAから精製されています。 RNAは、プロテイナーゼKは、ヌクレオチドのクロスリンク(手順9)で、残りのポリペプチドを残してタンパク質を消化することにより膜から回収される。逆転写(RT)は、残りのポリペプチドで切り捨て二開裂可能なアダプタ領域とバーコードシーケンス(ステップ10)を紹介します。サイズの選択は、環状化する前に無料のRTプライマーを削除します。以下の線形化は、PCR増幅(ステップ11-15)に適したテンプレートを生成します。最後に、ハイスループットシーケンシングは、バーコードシーケンスがすぐに(ステップ16)cDNAの最後のヌクレオチドが続いているの読み取りを生成します。このヌクレオチド位置するので上流に架橋された塩基、結合部位の一つ上の位置は、高分解能で推定することができます。

図2
図2架橋hnRNP C - RNA複合体のオートラジオグラフは、変性ゲル電気泳動およびメンブレンの転送を使用して。 hnRNP C - RNA複合体は、hnRNP C(αhnRNP C、試料3および4)に対する抗体を用いた細胞抽出物から免疫精製した。 RNAが部分的に低い(+)または高を用いて消化した(+ +)に含まれるRNaseの濃度。タンパク質のサイズ(40 kDa)をから上方にシフトする複合体は、(サンプル4)観察することができます。 RNaseの高濃度(試料3)を使用したときのシフトはあまり顕著です。は抗体が免疫沈降(サンプル1及び2)で使用されなかったときに放射性シグナルが消えます。

図3
iCLIP cDNA産物の切除を導くために図3。回路図を6%TBE -尿素ゲル(Invitrogen社)。ゲルは、ゲル中のcDNAおよび色素(青色光と闇)の再現可能な移行パターンにつながる180 Vで40分間実行されます。 (赤線)、高(H)、ミディアム(M)、および低(L)cDNAの分画をカットするためにカミソリの刃を使用してください。ライトブルーの染料の途中で、すぐにプラスチック製のゲルカセット上にマークが上記切断することから始めます。培地と低い分画を分割し、水色色素上記の約1cmの高い割合をトリミング。ポケットと別の車線を(この例1-4)を分離する色素によって導か垂直カットを使用してください。マーカーレーン(m)を制御するために染色し、画像化することができます切断後のサイズ。フラグメントサイズは​​、右上に表示されます。

図4
図4。ゲル電気泳動を用いてPCR増幅iCLIP cDNAライブラリーの解析。膜(図1)から回収したRNAは逆転写であり、変性ゲル電気泳動(図2)を使用してサイズを精製。 cDNAの3つのサイズ分画(高[H]:120〜200 NT、培地[M]:85から120 NTおよび低[L]:70から85ヌクレオチド)は環状、再線形化、回収してPCR -増幅した。異なるサイズ分布のPCR産物は、入力画分の異なるサイズの結果として観察することができます。 PCRのプライマーは、cDNAを、76 NTを導入しているので、大きさは中、低のサイズ分画のための146から161 NTのために高い、161〜196 ntのために196から276 NT間の範囲にしてください。は抗体が免疫沈降(レーン1-3)のために使用されていないときにPCR産物は存在しない。

Discussion

iCLIPプロトコルは、酵素反応と精製段階の多様な範囲を含んでいるので、それは実験が失敗する問題を識別するために、必ずしも容易ではない。同定されたRNAの相互リンクサイトの特異性をコントロールするために、一つ以上のネガティブコントロールは、完全な実験とその後の計算論throughout維持されるべきである。これらのコントロールは、非抗体サンプル、非架橋の細胞、またはノックアウト細胞や組織から免疫沈降することができます。理想的には、これらの対照実験では、任意のタンパク質- RNA複合体を浄化してはならないため、SDS - PAGEゲル上に信号を与えないこと、およびPCR増幅後には検出可能な製品があります。これらの制御ライブラリのハイスループットシーケンシングは非常にいくつかのユニークな配列を返す必要があります。結果のシーケンスはまだ少量でノックダウン細胞から精製されているのと同じタンパク質の架橋部位に対応するので、ノックダウン細胞は、シーケンシング制御としては推奨されません。

注意事項は、以前の実験からのPCR産物の混入を避けるために注意する必要があります。この問題を最小限にする最良の方法は、事前事後のPCRステップを空間的に分離することです。理想的には、PCR産物とすべての後続のステップの分析は別の部屋で実行する必要があります。また、研究室の各メンバーは、バッファや他の試薬の独自のセットを使用する必要があります。この方法では、汚染の源は簡単に識別することができます。

Disclosures

利害の衝突は宣言されません。

Acknowledgements

著者は、議論や実験的な援助のためにウレ、ラスコームとジュパン研究所のすべてのメンバーに感謝。我々は、ハイスループットシーケンシングのためにジェームズハドフィールドとニックマシューズに感謝。我々はiCLIPメソッドがここにロバートダーネルの研究室でカークジェンセンとJUによって開発された株式は、オリジナルのクリップのプロトコルでいくつかの手順を、説明することを指摘したいと思います。この作品は、欧州研究評議会の助成金JUとJKに長期ヒューマンフロンティアサイエンスプログラムのフェローシップへ206726 - CLIPによってサポートされていました

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads Invitrogen 10001D use protein G for mouse or goat antibody
RNase I Ambion AM2295 activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I New England Biolabs M0204S
PNK New England Biolabs M0201S
proteinase K Roche Group 03115828001
Superscript III reverse transcriptase Invitrogen 18080044
Circligase II Epicentre Biotechnologies CL9021K
FastDigest® BamHI Fermentas FD0054
AccuPrime™ SuperMix I Invitrogen 12342010 this PCR mix gives the best results in our hands

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
  2. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. RNA. 14, 802-813 (2008).
  3. Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5, 1071-1082 (1999).
  4. Brooks, S. A., Rigby, W. F. Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique. Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).
  5. Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).
  6. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  7. Ule, J. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302, 1212-1215 (2003).
  8. Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37, 376-386 (2005).
  9. Licatalosi, D. D. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456, 464-469 (2008).
  10. Yeo, G. W. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).
  11. Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles. Methods. 26, 170-181 (2002).
  12. König, J. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).

Erratum

Formal Correction: Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution
Posted by JoVE Editors on 07/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to:

"...as well as 2 μl Turbo DNase..."

instead of:

"...as well as 2 ml Turbo DNase..."

Comments

71 Comments

  1. Hi,

    First I would like to say this latest method is really neat. I also like Julian's comment at the end of the video when he said with a big smirk, "You have to perform each of the 64 steps with 100% accuracy". :D That is epic.

    On a more serious note, I am just wondering if anyone can suggest what sort of primer I should use if I want to start by cloning my insert into TOPO vector instead of doing nextGen sequencing. Any help is appreciated.

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2011 - 3:47 AM
  2. Hi Paul, thanks for your fun comment! TOPO cloning dŒsn²17;t require any specific primer, so you could use the one described in the protocol. Unless you wish to do something specific, such as concatemerization of sequences before inserting them into vector. Feel free to post more questions! Jernej

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 11, 2011 - 4:19 PM
  3. For more iCLIP questions and answers, use the following Googledoc: http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 13, 2011 - 11:28 AM
  4. Hi Jernej,
    Is it possible to use a 3' linker with a phosphorylated 5' end instead of a pre-adenylated 5' end and adding some ATP during the 3' linker ligation step? Thanks. Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 13, 2011 - 10:13 PM
  5. Yes, just follow the protocol as described in Konig et al, NSMB ²010 (PMID ²0601959). More on Googledoc.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 14, 2011 - 3:48 AM
  6. Hi Jernej,

    Sorry to keep bombarding you with questions. In the supplementary section of your NSMB ²010 paper, shrimp alkaline phosphatase was used to desphosphorylate 3' ends. My understanding is that SAP can only desphosphorylate 5' ends. I am wondering if you had dephosphorylated 3' ends step using PNK before using SAP to dephosphorylate 5' ends.

    Quote from Konig et al, NSMB ²010: "For dephosphorylation of 3²4²; ends, Dynabeads were resuspended in ² µl 10&#²15; Shrimp alkaline phosphatase buffer (Promega), 17.5 µl H²O and 0.1 µl Shrimp alkaline
    phosphatase (Promega) and incubated at 37°C for 10 min with intermittent shaking (10 sec at 700 rpm followed by ²0 sec pause)."

    Thank you again for your help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2011 - 4:04 AM
  7. We did use SAP in the NSMB protocol - it dŒsn't work as well as PNK on the 3' ends. We couldn't use PNK at the time, because PNK carryover into ligation reaction would create problems in the presence of ATP. In jove protocol, ligation reaction lacks ATP, therefore we can use PNK to dephosphorylate the 3' ends.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2011 - 6:30 PM
  8. Hi Jernej,

    On 3.² it says add ²ml Turbo DNAse into the 1.5 ml tube. I am wondering if that amount is correct.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 9, 2011 - 11:45 PM
  9. Hello Paul,
    you are right, it should be two micro liters. Sorry for that, I will try to have it changed,
    Julian

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 6:56 AM
  10. Hi Jernej, great protocol! Just a precision, the L3 oligo is a pre-adenylated DNA or RNA oligo? Not clear as the original Clip and iClip uses RNA...

    Thanks a bunch,

    Marco

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 12, 2011 - 3:58 PM
  11. Hi Marco. It's a DNA oligo. Best, Jernej

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 12, 2011 - 4:02 PM
  12. Hi Jernej,

    I am wondering if the 3²P-ATP batch that you normally use in your lab for step 6.1 always has close to a 100% reported radioactivity. What is the lowest percentage of remaining 3²P that you can usually still get away with? I can still get some decent signal when using 3²P-ATP that has ~50-60% remaining radioactivity but my bands on the films are not as intense as the one that I see in your publications. I am trying to work out the best schedule for ordering some 3²P-ATP and starting my experiments. Thanks again.

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 14, 2011 - 11:32 PM
  13. We don't use ATP if it's more than two weeks old, thus we have >50% radioactivity. But signal intensity also depends on the efficiency of crosslinking and IP,and amount of protein expression in the cells.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2011 - 4:23 AM
  14. Hi Jernej,
    Thank you for the protocol. What results if I reduce the cell samples to 100-1000 (not 10*6-7 cells) ? Thanks for your reply.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 12:24 AM
  15. That would be challenging. If you have an abundant protein that cross-links well to RNA, then it might be possible. So try running the radioactive protein-RNA complex on the gel - if you good signal after overnight exposure, then it's doable.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 4:52 AM
  16. Hi, Jernej !
    Thank you for the reply. I have another questions: How stable if the RNA-RNA and RNA-Protein photocrosslinking? How to degrade these proteins or remove the photocrosslinking? Thank you a lots.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 6:36 AM
  17. Hi Jernej,

    I again have some more questions. Do you still expose the nitrocellulose membrane at -80C when using phosphoimager instead of a film? I'm also wondering what exposure time your lab uses when using a phosphorimager screen.

    Secondly, I am wondering how many libraries containing different barcodes you can run together in a single flow cells.

    Thank you again Jernej. This protocol has been extremely useful.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:49 PM
  18. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  19. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  20. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  21. Hi Jernej,

    In regards to one of the FAQs from Google docs.

    - When analysing PCR products, I see a band corresponding to the size of primer dimers, especially in the sample that was cut low from cDNA gel.

    Yes, it is common to see this band in the sample that was cut low from cDNA gel, and sometimes also in other samples. This is due to contamination from short cDNAs that only contain the sequence of RT primer. If this primer dimer is the dominant product on gel, we advise against sequencing the corresponding sample.

    I seem to be getting this short cDNA contamination all the time. Do you have any advice on how I could try to minimise the contamination? Have you ever isolated fragments of correct-size cDNA from a TBE-urea gel and sent only the isolated fragment for sequencing when you have short cDNA contaminations? Do you think that will work? I think that the concentration of L3 linker that I had used might have been too much. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2011 - 7:45 PM
  22. There are several possible reasons for this. Maybe one aspect of the protocol is not working, and therefore you are not producing any specific cDNA. If you have no cDNA input, then with enough cycles, you can amplify the primer-primer from any part of the gel. If you are using mammalian cells, try to get the protocol working first with hnRNP C or TIA with Santa cruz antibodies that we used in recent publications. Otherwise, using too much L3 can be a problem.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 23, 2011 - 4:35 AM
  23. Very useful protocol. I have two questions.

    1. For dephosphorylation of RNA 3'ends, pH 6.5 PNK buffer is used, rather than the pH 7.6 buffer, provided by NEB. Have you compared these two conditions internally?
    ². In the protocol, the final PCR product is not isolated and quantitated before submitting for the sequencing. Are there any potential problems of doing these two steps? Can I isolate the PCR product and re-PCR using the same primers to get more product (for Illumina Hiseq)? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 5, 2012 - 3:40 PM
  24. You can find more related answers in Googledoc http://goo.gl/4tSci, but short answers are also below:

    1. We haven²17;t compared conditions, but increased phophatase activity of PNK at lower pH has been reported in literature, you can read more in the Pubmed ID 1184²1²0.

    ². The PCR product needs to be quantified. We use both qPCR and bioanalyser. Normally, the products of the first PCR should look clean on the gel, otherwise it is a sign of a library that is of low complexity, and is unlikely to generate informative data. Therefore we advise against re-PCR, but it can be done as the last resource.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 5, 2012 - 4:56 PM
  25. Hi Jernej,

    I noticed you use +/- 10 multiplexed libraries; I was wondering if you knew how many are necessary for a successful run (i.e. to provide sufficient distribution for cluster identification)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 2:20 PM
  26. The way the primers are designed here, no multiplexing is necessary, because the first three nucleotides in the primer sequence are random (part of randomer = NNN).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 2:28 PM
  27. I appreciate your experiment. I have some qeustions.

    In this protocol, what dŒs barcode do high-throughout squencing?

    I don't understand function of barcode



    Reply
    Posted by: seung kuk P.
    May 23, 2012 - 6:45 AM
  28. Hi,
    this might be a really naive question but I'm wondering at the UV cross linking step, when you say you irradiate once, dŒ's this mean 1 min?

    Thank you!
    Zsofi

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    June 18, 2012 - 1:19 PM
  29. Hello, Thank you for this helpful technique, I just have a question. My experiments protocols are: 1. UV-crosslink RNA-protein; ². Isolate the RNA-protein complex by immunopricitation; 3. Isolate the binding RNA. 3²P-labeling the binding RNA. 4. Analysis the RNA by microarray.
    Because I do not need to sequence the RNA, and I only want to isolate the binding RNA for microarray analysis after UV-crosslink RNA-protein, so I wonder whether I need to do the step 5-7 in your protocols or I could skip from step 4 to step 8 in your protocol?

    Thanks very much, I look forward to your kind reply!

    Sean

    Reply
    Posted by: xiaoyun w.
    July 22, 2012 - 9:09 PM
  30. It is unlikely you will have enough cDNA for microarray hybridisation without some kind of amplification. You can try using steps 4-8, but you could also amplify in other ways.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 23, 2012 - 6:03 AM
  31. Hi Jernej,

    Is there any published article on how to analyse iCLIP's high-throughput sequencing data? I have just got my sequencing results back following steps in your protocol. I want to make sure I check with you before digging into the data. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 1, 2012 - 10:15 PM
  32. The article is not yet published, but is in preparation by Tomaz Curk ( http://www.fri.uni-lj.si/en/tomaz-curk/), who made a public server: http://icount.biolab.si/. You can contact Tomaz at tomaz.curk@fri.uni-lj.si for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2012 - 5:47 AM
  33. Hi,
    it is so powerful technique! But I cannot IP any protein follow protocol. Is there any difference in affinity between different antibodies and their antigen? Could you give me some advice? Maybe we could decrease concentration of SDS or sodium deoxycholate?
    Thanks, I look forward to your kind reply!
    Min

    Reply
    Posted by: Min S.
    August 5, 2012 - 11:04 PM
  34. Hi Min, you can find advice on IP googledoc http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2012 - 3:35 AM
  35. Hi Jernej,

    With the barcoding system, I am just wondering if the three random nucleotides are there for indexing purpose during Illumina sequencing run but it's not necessary for splitting the different libraries later on. For RC1, the sequencing results will be something like NNNGGTTNN.... During analysis, do you usually trim the 3-bp from the 5'-end of the results and split the different replicates after the trimming step? I have just realised this was slightly different to the barcoding system used in your NSMB paper. -paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2012 - 9:41 PM
  36. Hi Paul! You can find the answer under the topic of "Use of random barcode in data analysis" in http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 7, 2012 - 7:58 AM
  37. Hi Jernej,

    I started optimising CLIP couple of months ago and I'm at the stage that I'm convinced that I can efficiently cross link RNA to my protein (checked it by specific qRT PCR). I'm lucky because I don't need to fiddle with the IP since I've optimised before and works fine. But just to double check, after IP and western blotting a smear and a lower amount of original kDa protein is a good sing for cross linking yes?
    So my problems started at the RNase A step, I don't see any changes in size/appearance on WB after treatment... I'm convinced that my protein creates a massive complex (couple of 100 kDa) and it is because my target RNA is 10 kb to start with and there are at least 3 proteins binding to it. I'm working with a RNA virus, that's the explanation for it. I think the reason I don't see any change in kDA is because the complex dŒsn't even enter the gel to start up with. Although I used the given buffer which should break any membrane apart but the proteins are still there possibly protecting the RNA. Did you ever come across similar problems and would you have any suggestions? Also, I understand that the RNase trimming is necessary for the efficient RT step but is it a problem if the RNA is too long? What is too long? DŒs this depend on the RT enzyme used I recon or is this also important for the sequencing?

    I would greatly appreciate yur help because I'm stuck...

    Thank you,
    Zsofi

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    October 10, 2012 - 7:38 AM
  38. Hi Zsofi,

    For partial RNAse digestion we use RNase I (step 3). We use two different concentrations: a lower one that makes fragments with a mean between 50-100 bp and a higher concentration that fragments RNA to around 10bp. The lower one is used for preparing libraries, the higher one is used for analytical reasons.

    The RNAse step is important to (1) allow the protein RNA complex enter the Gel (²) to narrow down the crosslink site to a fragment with a size compatible with high throughput sequencing (maximum around 300 bp). So you definitely need to optimize this step for your experiments.

    If the complex you are studying is not covalently linked it should fall apart during the denaturing Gel run. Only a small fraction of your complex will have all the proteins of your complex crosslinked to the RNA at the same time since crosslinking is a very inefficient step. Therefore with the higher RNAse concentration you should be able to see a radioactive signal at the size of the protein you are studying.

    I hope that helps, best regards,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    October 11, 2012 - 9:49 AM
  39. Hi Julian,

    I have had some trouble with the RNase step when nuclease-ing the total lysate... In my troubleshooting efforts I read that RNase I is inhibited by 0.1% SDS, which is the concentration used in your lysis buffer. It dŒsn't seem that you guys have any problem though...do you think this is due to using an excess of RNase I or what? Just curiously confused. Thanks,

    sam

    Reply
    Posted by: Sam F.
    February 5, 2013 - 6:00 PM
  40. Hi Sam,

    in our experience the inhibition of RNase I by SDS is not an issue. You just optimize the concentration of RNase I to obtain the desired fragmentation. If you have problems doing that with your buffer conditions, you could also do the RNase digestion on the beads instead of in the lysate.

    Best,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 6, 2013 - 6:19 AM
  41. Thanks for the quick reply Julian. Your recommendation to do the "on bead" digestion is exactly what I have done and it seems to be working fine. Cheers

    Posted by: Sam F.
    February 6, 2013 - 10:12 AM
  42. Hi,

    I was wondering how many minutes have you irradiated the cells in case of HNRNP C?

    Reply
    Posted by: Niaz M.
    November 26, 2012 - 6:29 PM
  43. Hi Niaz,
    we are normally not measuring time of irradiation but the Energy per square centimeter:
    Step 1.²: ... Irradiate once with 150 mJ/cm² at ²54 nm.
    In our Stratalinker this takes 50s. However time of irradiation is not very informative here since it changes with the age or quality of the lamps, etc.
    Cheers, Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    November 27, 2012 - 6:20 AM
  44. Hi,

    Thank you for wonderful protocol !

    I would like to confirm about adaptor and primer sequences.
    1. L3 adaptor and Rclip RT primer has ²²0;same²²1; sequences, not ²²0;complementary²²1; sequences. Are they O.K.? In my understanding, L3 and TR primers should have ²²0;complementary sequences.
    ². P3 Solexa 3²17; 11 nt sequence (TCTTCCGATCT) looks ²²0;extra²²1;. Both of P5 and P3 have the same sequence, which is complementary to Rclip RT primer or L3 adaptor. I think only P5 should have this sequence.

    Thank you for your help.

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 3:04 AM
  45. Hi,

    Thank you for wonderful protocol !

    I would like to confirm about adaptor and primer sequences.
    1. L3 adaptor and Rclip RT primer has ²²0;same²²1; sequences, not ²²0;complementary²²1; sequences. Are they O.K.? In my understanding, L3 and TR primers should have ²²0;complementary sequences.
    ². P3 Solexa 3²17; 11 nt sequence (TCTTCCGATCT) looks ²²0;extra²²1;. Both of P5 and P3 have the same sequence, which is complementary to Rclip RT primer or L3 adaptor. I think only P5 should have this sequence.

    Thank you for your help.

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 3:04 AM
  46. Hi Lisa,

    it is correct that the ends of P3 and P5 primers are the same. This is because of Illumina's primer design for their high throughput sequencing platform. When you look at the 3' end of the Rclip primers (after the Bamhi cleavage site) you can see that they are actually complementary to the 3'end of the L3 adapter.

    Cheers,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    December 18, 2012 - 10:05 AM
  47. I got it !!!
    Thank you :)

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 1:11 PM
  48. Hi
    Thanks for the protocol. I have one question that has been bothering me, though. Both the RNA ligase and PNK buffers will expose the antibody column to relatively high dithiothreitol (DTT) concentrations (10 mM and 5 mM respectively). Why dŒsn't this destroy the column by reducing the disulphide bonds holding the heavy and light antibody chains together? Have you ever tried to improve the immunoprecipitation step by attempting to minimize the DTT concentration as much as possible or is this not an issue. Any assistance would be greatly appreciated. Thanks - Greg

    Reply
    Posted by: Greg C.
    February 3, 2013 - 2:13 PM
  49. Hi Greg, we haven't seen an effect of the DTT in the buffers on the IP efficiency, it seems that the concentration is not high enough to reduce the IgG - however, it is worth testing this the first time you do IP, since it is plausible that this will vary dependent on the source of your buffers (company used for PNK and ligase), or antibodies.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2013 - 2:45 AM
  50. Hi Jernej,
    Thanks for the reply. The antibody I am using is definitely sensitive to the level of DTT found in the PNK buffer and I need to limit the over-all exposure of the column to DTT as much as possible. As a result, rather than using PNK as the 3' phosphatase, I would like to use an alkaline phosphatase. I noticed that in your ²010 NSMB paper you are using Shrimp Alkaline Phosphatase and in your ²009 Methods paper you use FAST AP. Did you find that the Shrimp phosphatase is significantly better ?

    Thanks again - Greg

    Reply
    Posted by: Greg C.
    February 8, 2013 - 3:52 PM
  51. Hi Greg, we don't have any evidence to suggest that one is better than the other for the on-bead reaction. At the time we were using SAP in the lab generally since it can be heat-inactivated, so therefore we also used it for on-bead (even though here you can't heat-inactivate it on beads). So you can go ahead with either one.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2013 - 5:29 AM
  52. I should also add that even though we didn't compare FAST AP and SAP, we did compare SAP with PNK, and we had a lot better results with PNK. It seems that SAP is not efficient as a 3' phosphatase. So it may be better for you to determine the minimal DTT amount in the buffer that is compatible with your antibody, and then continue using it with PNK and ligase. If you use fresh DTT, 1mM is likely to be sufficient both for PNK and RNA ligase.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2013 - 5:39 AM
  53. Thanks, I really appreciate the advice.
    -Greg

    Posted by: Greg C.
    February 9, 2013 - 9:03 AM
  54. Hi, thanks for the awesome video. I have two questions related to the reagents:
    1. What concentration is the PEG400? (it only says 4 ul in the protocol).
    ². Under "Reverse transcription", step 6, what is the pH of the TE buffer you use? Is it pH 8?
    Thank you very much for your help. -QT

    Reply
    Posted by: Qiumin T.
    February 7, 2013 - 1:22 PM
  55. Hi QT,
    (1) we are using PEG400 from Sigma (²0²398). It is a viscous liquid.
    (²) Yes, the it is pH 8
    Cheers, Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 7, 2013 - 4:56 PM
  56. Thank you so much Julian. I have another question. Could you recommend a protocol for doing iCLIP with mouse brain tissue? Do you know whether the tissue prep steps from this protocol ( http://ago.rockefeller.edu/Ago_HITS_CLIP_Protocol_June_²009.pdf) will work well for iCLIP as well?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 13, 2013 - 5:52 PM
  57. This protocol should be fine. We also recently published a bookchapter about the iCLIP protocol which contains information on tissue samples and lots of other useful info and background:
    http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.100²/97835²764458².ch10/summary

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 14, 2013 - 5:19 AM
  58. The pre-publication version of the book chapter is available here: http://www².mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/jule/publications/Konig_wiley.pdf.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2013 - 1:54 PM
  59. I enjoyed reading about your updated iCLIP protocol in the book Tag-based Next Generation Sequencing from Wiley. I would be grateful for more details about the amount and activity of the 3²-P that you use to radioalabel the RNA. In both the book chapter and the JoVE article I see only volumes, not activities.

    In the figure for step 9, the radiolabel on the 5' end of the RNA is missing, but shouldn't it still be there? At what point in the protocol can we be reasonably sure that we are dealing with unlabeled material?

    Also, have you ever explored non-radioactive approaches to labeling, or is the sensitivity of these methods too low for the purposes of this protocol?

    Thanks!

    John

    Reply
    Posted by: John S.
    June 17, 2013 - 9:23 AM
  60. Dear John,

    with the current protocol most of the radioactivity is gone after the gel purification of the cDNA. You can increase this effect by treating the samples with RNAse after the reverse transcription (The radioactive RNA fragments then running much faster then the cDNAs in the gel). We are currently working on a protocol where we fragment the RNA by alkaline hydrolysis, which will be available soon (We want to avoid using too much RNAse at our desks).

    In addition you should always measure your samples with a Geiger counter. If your final PCRs are still hot, then you should decrease the fraction of beads that go into the labeling reaction.

    Best wishes,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    June 19, 2013 - 11:52 AM
  61. Hi,
    I have a question which relies on your experience with the data generated with CLIP:
    because of the UV irradiation the protein crosslinks to the RNA which even after proteinase K treatment presents an obstruction to the reverse transcriptase which therefore either skips or adds random nucleotide(s). So my question is that how long the deletions/insertions can be? Is it only one nucleotide or can also be 20?

    Thank you very much!!!

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    August 8, 2013 - 12:06 PM
  62. We see that >80% of cDNAs truncate at the crosslink site, and the mutations are quite rare in the remaining sequences. All we know about crosslink-induced mutations has been published here: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22863408.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 8, 2013 - 12:15 PM
  63. Thanks for your protocol. I have a question about the IgG background signal in the p32 labeled Western Blot. I used mouse IgG1 isotype as a control. I did not crosslink the IgG to the beads, so IgG1 stays around 50 and 25 KDa region. I do observe some radioactivity band around 50 kDa. Do you notice this in your experiments as well? Since it is close to my protein region, can you give me some suggestions to avoid this?

    Sincerely,
    Mei

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 9, 2013 - 1:42 PM
  64. We don't get a signal in control IP. Most likely this is an RBP that non-specifically binds under your conditions. It is important to wash with high-salt buffer, and rotate the tubes for ±5min during these washes. Also, diluting the lysate before IP may help. Standard IP optimisations, basically.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2013 - 2:24 PM
  65. Hi,
    Thank you for wonderful protocol.
    Usually how much RNA concentration one should get after Isolation from membrane? I would appreciate your reply.

    Reply
    Posted by: Bhagya B.
    August 13, 2013 - 5:29 AM
  66. Hi,
    Thank you for wonderful protocol.
    Usually how much RNA concentration one should get after Isolation from membrane? I would appreciate your reply.

    Reply
    Posted by: Bhagya B.
    August 13, 2013 - 5:57 AM
  67. Hi,
    I have 2 more questions. In this protocol you did not remove 5' phosphate of the RNA, can you still label the 5' side with P32 by PNK later? Another question, is it possible to just p32 label the RNA, cut the band, extract, degrade the protein and add 3' linker for RT later?

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 21, 2013 - 2:06 PM
  68. Normal PNK has phosphatase activity, so it can replace the 5' phosphate. The original CLIP protocol from Ule et al, Science 2003 added 3' linker after RNA extraction, but as explained in Ule et al, Methods 2005., the efficiency and purity of the protocol increases if linker is ligated on beads.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2013 - 2:15 PM
  69. Thanks for this amazing protocol and your rapid and very helpful exchange here in this site.

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 21, 2013 - 2:26 PM
  70. Hello, thank you for this wonderful protocol.
    I have a question:
    -I get positive Radioactive signal at the right size of positive CTRL used in this protocol in the NOT UV samples, it looks exactly as I was using high RNAse condition. why?
    I am phosphorylating the protein? is it possible?
    thank you

    Reply
    Posted by: jessica c.
    February 27, 2016 - 8:45 PM
  71. Hi Jessica, you are right, if you see signal in the non-UV control, this means that the protein is getting phosphorylated in some other way. If it has a kinase domain it may even phosphorylate itself. Or maybe some kinase is getting co-purified? You could check for this by omitting PNK from the phosphorylation reaction.

    Reply
    Posted by: Jernej U.
    March 16, 2016 - 11:07 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics