iCLIP -- Transcriptome على صعيد رسم الخرائط من البروتين RNA التفاعلات مع القرار الفردي النكليوتيد

Published 4/30/2011
71 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology
 

ERRATUM NOTICE

Summary

الترتيب المكاني للRNA البروتينات ملزم على نص هو أحد المحددات الرئيسية لمرحلة ما بعد النسخي التنظيم. ولذلك ، قمنا بتطوير الفرد والأشعة فوق البنفسجية النوكليوتيدات يشابك القرار ومناعي (iCLIP) الذي يسمح دقيقة الجينوم على نطاق ورسم خرائط للمواقع الملزم للبروتين النووي الريبي ملزمة.

Cite this Article

Copy Citation

Konig, J., Zarnack, K., Rot, G., Curk, T., Kayikci, M., Zupan, B., et al. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. J. Vis. Exp. (50), e2638, doi:10.3791/2638 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تركيبة فريدة والترتيب المكاني للRNA ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) على نسخة دليل الجوانب المتنوعة في مرحلة ما بعد النسخي البند 1. لذلك ، خطوة أساسية نحو تنظيم محضر التفاهم على المستوى الجزيئي هي لاكتساب المعلومات الموضعية على مواقع الربط من الممارسات التجارية التقييدية 2.

ويمكن دراسة البروتينات والحمض النووي الريبي التفاعلات الكيميائية الحيوية باستخدام الأساليب ، ولكن هذه الطرق لا تتناول الحمض النووي الريبي ملزمة في سياقها الأصلي الخلوية. المحاولات الأولية لدراسة البروتينات والحمض النووي الريبي المجمعات في بيئتها الخلوية المستخدمة لتنقية تقارب أو مناعي جنبا إلى جنب مع الفرق عرض أو تحليل ميكروأري (RIP - CHIP) 3-5. وكانت هذه الأساليب عرضة لتحديد التفاعلات غير المباشرة أو غير الفسيولوجية - 6. يشار استراتيجية من أجل زيادة نوعية والقرار الموضعية ، على أنه قدم CLIP (الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط ومناعي) 7،8. CLIP يجمع عبر ربط الأشعة فوق البنفسجية من البروتينات وجزيئات الحمض النووي الريبي مع مخططات تنقية صارمة بما في ذلك تغيير طبيعة بولي أكريلاميد هلام إستشراد. بالاشتراك مع تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية ، وقد ثبت CLIP كأداة قوية لدراسة البروتينات والحمض النووي الريبي التفاعل على نطاق والجينوم واسعة (ويشار إلى CLIP - HITS CLIP أو بعدها) 9،10. مؤخرا ، تم إدخال PAR - CLIP يستخدم النظير لريبونوكليوزيد photoreactive عبر ربط 11،12.

على الرغم من نوعية عالية من البيانات التي تم الحصول عليها ، والتجارب CLIP كثيرا ما تولد من التعقيد مكتبات [كدنا] تسلسل محدودة. هذا يرجع جزئيا إلى كمية محدودة من شارك في المنقى واثنين من الحمض النووي الريبي RNA ربط الكفاءة ردود الفعل المطلوبة لإعداد المكتبة. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت المقايسات تمديد التمهيدي cDNAs أن العديد من اقتطاع قبل الأوان بنسبة 13 في النوكليوتيدات crosslinked. يتم فقدان هذه cDNAs اقتطاع خلال بروتوكول CLIP معيار إعداد المكتبة. نحن وضعت مؤخرا iCLIP (فردية النوكليوتيدات CLIP القرار) ، والذي يجسد cDNAs اقتطاعها من خلال استبدال واحدة من الخطوات غير فعالة الربط بين الجزيئات RNA مع التعميم أكثر كفاءة ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ [كدنا] (الشكل 1) 14. الأهم من ذلك ، تسلسل cDNAs اقتطاع يقدم أفكارا في موقف للموقع عبر وصلة في القرار النوكليوتيدات. طبقنا بنجاح iCLIP لدراسة الجسيمات C hnRNP منظمة على نطاق واسع الجينوم وتقييم دورها في تنظيم الربط 14.

Protocol

1. الأشعة فوق البنفسجية عبر الربط بين خلايا الأنسجة

  1. إزالة وسائل الاعلام وإضافة 6 مل الجليد الباردة PBS إلى الخلايا المزروعة في صحن 10 سم (ما يكفي لمدة ثلاث تجارب).
  2. إزالة غطاء ووضعت على الجليد. أشرق مرة واحدة مع 150 ميغا جول / سم 2 في 254 نانومتر.
  3. حصاد الخلايا عن طريق كشط مع رافع الخلية.
  4. 2 تعليق نقل خلية لكل مل من ثلاثة microtubes. تدور بسرعة أعلى لمدة 10 ثانية عند 4 درجة مئوية إلى الخلايا بيليه ، ثم إزالة طاف.
  5. الإضافية تجميد الخلية في كريات الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. حبة إعداد

  1. إضافة 100 ميكرولتر من البروتين Dynabeads (Dynal ، 100،02) في تجربة جديدة لmicrotube (استخدام البروتين Dynabeads G للماوس أو أجسام الماعز).
  2. تغسل حبات 2X مع تحلل العازلة (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ؛ 1 ٪ NP - 40 ؛ 0.1 ٪ SDS ؛ 0.5 ٪ deoxycholate الصوديوم ؛ 1 / 100 مثبط البروتياز كوكتيل الثالث ، Calbiochem).
  3. Resuspend الخرز في 100 العازلة تحلل ميكرولتر مع الضد 20-10 ميكروغرام.
  4. تدوير أنابيب في درجة حرارة الغرفة ل30-60 دقيقة.
  5. غسل 3X مع 900 ميكرولتر العازلة تحلل وترك في الماضي حتى يغسل استعداد للشروع في الخطوة 4.1.

3. تحلل الخلايا والحمض النووي الريبي الهضم الجزئي

  1. Resuspend الكرية خلية في 1 مل العازلة تحلل ونقل إلى microtubes مل 1.5.
  2. يعد التخفيف 1 / 500 من أنا ريبونوكلياز (Ambion ، AM2295). أضف 10 ميكرولتر التخفيف أنا ريبونوكلياز فضلا عن 2 الدناز توربو ميكرولتر إلى lysate الخلية (1 / 500 ريبونوكلياز التخفيفات الأول [منخفضة ريبونوكلياز] تستخدم لإعداد المكتبة ، 1 / ​​50 التخفيفات [عالية ريبونوكلياز] ضرورية للسيطرة على خصوصية الضد) .
  3. احتضان العينات المطلوبة لل3 دقائق بالضبط عند 37 درجة مئوية ، والهز في 1100 دورة في الدقيقة. نقل على الفور إلى جليد.
  4. تدور عند 4 درجة مئوية و 22000 لمدة 20 دقيقة ز لمسح lysate. جمع بعناية طاف (اترك حوالي 50 lysate ميكرولتر مع بيليه).

4. مناعي

  1. إزالة غسل العازلة من الخرز (من الخطوة 2.5) ، ثم إضافة lysate الخلية (من الخطوة 3.4).
  2. تدوير عينات لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  3. تجاهل طاف وتغسل حبات 2X مع 900 العازلة عالية من الملح ميكرولتر (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 ، 1 M كلوريد الصوديوم ، EDTA 1 ملم و 1 ٪ NP - 40 ؛ 0.1 ٪ SDS ؛ deoxycholate الصوديوم 0.5 ٪).
  4. غسل 2X مع 900 العازلة غسل ميكرولتر (20 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 و 10 ملي MgCl 2 ؛ 0.2 ٪ توين - 20).

5. نزع الفسفات من الحمض النووي الريبي 3'ends

  1. تجاهل وطاف resuspend الخرز في 20 مزيج PNK ميكرولتر (15 ميكرولتر المياه ؛ 4 ميكرولتر الحموضة PNK 5X 6.5 العازلة [350mMTris ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 6.5 ؛ 50mMMgCl 25mMdithiothreitol 2] ؛ 0.5 انزيم PNK ميكرولتر ؛ 0.5 ميكرولتر RNasin [Promega]).
  2. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 500 ميكرولتر العازلة يغسل ويغسل 1X عالية مع الملح العازلة.
  4. غسل 2X مع العازلة يغسل.

6. رابط لربط الحمض النووي الريبي ينتهي 3 '

  1. إزالة بعناية وطاف resuspend الخرز في 20 ميكرولتر مزيج ربط (9 ميكرولتر المياه ؛ 4 ميكرولتر العازلة ربط 4X [200 mMTris - حمض الهيدروكلوريك ؛ MM 40m GCL 2 و 40 ملي dithiothreitol] ؛ 1 ميكرولتر RNA يغاز [NEB] ؛ 0.5 ميكرولتر RNasin [Promega] ؛ 1.5 ميكرولتر قبل adenylated رابط L3 [20 ميكرومتر] ؛ 4 ميكرولتر PEG400 [81170 ، سيغما]).
  2. يحضن بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
  3. إضافة 500 ميكرولتر العازلة يغسل ويغسل ثم 2X مع 1 العازلة عالية من الملح مل.
  4. غسل 2X مع 1 مل العازلة يغسل ويترك في 1 مل من غسل الثانية.

7. وسم نهاية RNA 5 '

  1. إزالة وطاف resuspend حبات في 8 ميكرولتر من مزيج PNK الساخنة (0.4 ميكرولتر PNK [NEB] ؛ 0.8 ميكرولتر 32 - P - γ ATP ؛ 0.8 ميكرولتر العازلة PNK 10X [NEB] (6) ؛ المياه ميكرولتر).
  2. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  3. إزالة مزيج PNK الساخنة وresuspend حبات العازلة في 20 ميكرولتر 1X تحميل Nupage (Invitrogen).
  4. على احتضان thermomixer عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  5. المكان فورا على مغناطيس لترسيب حبات فارغة وتحميل طاف على هلام (راجع الخطوة 8).

8. SDS - PAGE ونقل الغشاء

  1. تحميل عينات على NuPAGE 4-12 ٪ مكرر تريس هلام (Invitrogen) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام 0.5 لتر من اجتماعات الأطراف 1X تشغيل العازلة (Invitrogen). أيضا تحميل 5 ميكرولتر من علامة حجم البروتين قبل الملون (على سبيل المثال PAGE حاكم زائد ، Fermentas ، SM1811).
  2. تشغيل لمدة 50 دقيقة هلام في 180 V.
  3. إزالة الجبهة جل والتخلص من النفايات الصلبة و(يحتوي على الخطوط المشعة ATP).
  4. نقل البروتينات والحمض النووي الريبي المجمعات من الجل لغشاء النيتروسليلوز باستخدام جهاز نقل Novex الرطب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (Invitrogen ، ونقل في 30 ح 1 V).
  5. بعد نقل ، وشطف الغشاء العازلة في برنامج تلفزيوني ، ثم لف في التفاف ساران وتعريضها لفوجي فيلم في -80 درجة مئوية (مكان ملصقا الفلورسنت بجوار الغشاء لمحاذاة في وقت لاحق رانه فيلم وغشاء ؛ أداء التعرض لمدة 30 دقيقة ، وأكثر من ليلة 1H).

9. RNA العزلة

  1. عزل بروتين المجمعات الحمض النووي الريبي من التجربة المنخفضة ريبونوكلياز باستخدام صورة الإشعاع الذاتي من الخطوة 8.5 كقناع. قص قطعة من هذا الغشاء إلى شرائح صغيرة عدة ووضعها في microtube مل 1.5.
  2. إضافة 200 PK ميكرولتر العازلة (100 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4 و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي EDTA) و 10 ميكرولتر بروتيناز K (روش ، 03115828001) إلى قطع الغشاء. احتضان تهتز في 1100 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من PKurea العازلة (100 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4 و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي EDTA ؛ 7 M اليوريا) ، واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. جمع الحل وإضافتها معا مع 400 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الفينول / الكلوروفورم (Ambion ، 9722) إلى المرحلة 2 مل أنبوب جل قفل الثقيلة (713-2536 ، VWR).
  5. احتضان لمدة 5 دقائق عند 30 درجة مئوية ، والهز في 1100 دورة في الدقيقة. فصل المراحل عن طريق الدوران لمدة 5 دقائق في الدقيقة 13000 في درجة حرارة الغرفة.
  6. نقل الطبقة المائية في أنبوب جديد (يجب الحرص على عدم لمس هلام مع ماصة). إضافة 0.5 glycoblue ميكرولتر (Ambion ، 9510) و 40 م 3 ميكرولتر الصوديوم الهيدروجيني 5.5 وخلات المزيج. ثم إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، ومزيج من جديد ويعجل في أكثر من ليلة -20 درجة مئوية.

10. عكس النسخ

  1. تدور لمدة 20 دقيقة في 15000 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية. إزالة طاف بيليه ويغسل مع 0.5 مل من الايثانول 80 ٪.
  2. Resuspend الكرية 7.25 في الحمض النووي الريبي ميكرولتر / مزيج التمهيدي (6.25 ميكرولتر المياه ؛ 0.5 التمهيدي Rclip ميكرولتر [0.5pmol/μl] ؛ 0.5 ميكرولتر dNTP مزيج [10MM]). لكل تجربة أو تكرار ، واستخدام التمهيدي Rclip مختلفة تحتوي على تسلسل الباركود الفرد (انظر 14).
  3. احتضان لمدة 5 دقائق عند 70 درجة مئوية قبل التبريد إلى 25 درجة مئوية.
  4. إضافة 2.75 ميكرولتر RT مزيج (2 ميكرولتر العازلة RT 5X ؛ 0.5 ميكرولتر 0.1M DTT ؛ 0.25 ميكرولتر مرتفع الثالث عكس المنتسخة [Invitrogen]).
  5. احتضان 5 دقائق عند 25 درجة مئوية و 20 دقيقة في درجة حرارة 42 درجة مئوية ، 40 دقيقة عند 50 درجة مئوية و 5 دقائق عند 80 درجة مئوية قبل التبريد إلى 4 درجات مئوية.
  6. إضافة 90 ميكرولتر TE العازلة ، 0.5 و 10 ميكرولتر glycoblue خلات الصوديوم ميكرولتر الرقم الهيدروجيني 5.5 والمزيج. ثم يضاف 250 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، ومزيج من جديد ويعجل في أكثر من ليلة -20 درجة مئوية.

11. تنقية هلام من [كدنا]

  1. تدور باستمرار وغسل العينات (انظر 10.1) ، ثم resuspend الكريات في 6 ميكرولتر من المياه.
  2. إضافة 6 ميكرولتر 2X العازلة تحميل TBE - اليوريا (Invitrogen). عينات الحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 3 دقائق مباشرة قبل التحميل.
  3. تحميل العينات في جل الجاهزة TBE - اليوريا 6 ٪ (Invitrogen) وتشغيل لمدة 40 دقيقة عند 180 V كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. تحميل أيضا علامة منخفضة الوزن الجزيئي لقطع اللاحقة (أنظر أدناه).
  4. قطع ثلاثة نطاقات 120-200 في الإقليم الشمالي (عالية) ، 85-120 الإقليم الشمالي (وسط) والإقليم الشمالي 70-85 (منخفضة). استخدام صبغة theupper وعلامات على دعم هلام البلاستيك لتوجيه الختان (انظر الشكل 3). علما بأن التمهيدي Rclip وتسلسل حساب L3 معا لمدة 52 NT تسلسل CLIP.
  5. إضافة 400 TE ميكرولتر وسحق شريحة هلام الى قطع صغيرة باستخدام حقنة 1 مل المكبس. احتضان تهتز في 1100 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  6. مكان اثنين من الزجاج 1 سم قبل المرشحات (Whatman ، 1823010) في عمود SpinX Costar (كورننغ إنكوربوريتد ، 8161). نقل الجزء السائل من العينة إلى العمود. تدور ل1 دقيقة في 13000 دورة في الدقيقة في أنبوب مل 1.5.
  7. إضافة 0.5 glycoblue ميكرولتر و 40 ميكرولتر خلات الصوديوم الهيدروجيني 5.5 ، ثم مزج العينة. إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، ومزيج من جديد ويعجل في أكثر من ليلة -20 درجة مئوية.

12. ربط من التمهيدي إلى 5'end من [كدنا]

  1. تدور باستمرار وغسل العينات (انظر 10.1) ، ثم resuspend الكريات في 8 مزيج ربط ميكرولتر (6.5 ميكرولتر المياه ؛ 0.8 ميكرولتر 10X CircLigase الاحتياطي الثاني ؛ 0.4 ​​ميكرولتر 50 ملي MnCl 2 ؛ 0.3 ميكرولتر ؛ Circligase الثاني [Epicentre]) ، واحتضان ل 1 ح عند 60 درجة مئوية.
  2. إضافة 30 ميكرولتر مزيج الصلب بنسبة ضئيلة (26 ميكرولتر المياه ؛ 3 الاحتياطي FastDigest ميكرولتر [Fermentas] ؛ 1 ميكرولتر cut_oligo [10 ميكرومتر]). احتضان لمدة 1 دقيقة في 95 درجة مئوية. انخفاض درجة الحرارة ثم كل 20 ثانية في موعد أقصاه 1 درجة مئوية حتى 25 درجة مئوية وصلت.
  3. إضافة 2 BamHI ميكرولتر (Fermentas السريع) ويحضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. إضافة TE 50 ميكرولتر glycoblue و 0.5 ميكرولتر والمزيج. أضف 10 ميكرولتر خلات الصوديوم الهيدروجيني 5.5 والمزيج ، ثم يضاف 250 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100 ٪. مزيج مرة أخرى ، ويعجل في أكثر من ليلة -20 درجة مئوية.

13. PCR التضخيم

  1. تدور باستمرار وغسل العينات (انظر 10.1) ، ثم resuspend بيليه في 19 ميكرولتر المياه.
  2. تحضير مزيج PCR (19 ميكرولتر [كدنا] (1) ؛ مزيج التمهيدي ميكرولتر P5/P3 solexa ، 10 ميكرومتر لكل منهما ؛ Accuprime 20 ميكرولتر Supermix 1 انزيم [Invitrogen]).
  3. تشغيل البرنامج PCR التالية : 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، [94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 68 درجة مئوية لمدة 30 ثانية] دورات 25-35 ، و 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق و 4 درجات مئوية عن أي وقت مضى.
  4. مزيج المنتج 8 PCR ميكرولتر مع 2 ميكرولتر من 5X TBE العازلة التحميل وتحميل على هلام الجاهزة TBE 6 ٪ (Invitروجين). وصمة عار الجل مع أنني Sybrgreen (Invitrogen) وتحليلها مع تصوير هلام.
  5. الباركود في الاشعال Rclip السماح لعينات مختلفة متعددة قبل تقديم لتسلسل إنتاجية عالية. تقدم 15 ميكرولتر للمكتبة لترتيب وتخزين بقية.

14. رابط والتمهيدي متواليات

قبل adenylated 3 'الحمض النووي رابط :

[نحن أجل المحول من الحمض النووي من IDT ثم جعل من aliquots 20μM.]

الحمض النووي

15. ممثل النتائج :

قبل أن تتابع مكتبة iCLIP ، يمكن رصد نجاح التجربة في خطوتين : صورة الإشعاع الذاتي للمجمع البروتين RNA بعد نقل غشاء (الخطوة 8.5) وصورة هلام المنتجات PCR (الخطوة 13.4). في صورة الإشعاع الذاتي من العينات منخفضة ريبونوكلياز ، ينبغي أن ينظر إلى النشاط الإشعاعي المنتشر فوق الوزن الجزيئي للبروتين (الشكل 2 ، نموذج 4). لالرفيع ريبونوكلياز العينات ، ويتركز هذا النشاط الإشعاعي أقرب إلى الوزن الجزيئي للبروتين (الشكل 2 ، نموذج 3). عندما يتم استخدام أي جسم في مناعي ، ينبغي الكشف عن أية إشارة (الشكل 2 ، وعينات 1 و 2). ضوابط هامة أخرى لخصوصية مناعي إما بحذف اشعة فوق البنفسجية أو استخدام الخلايا التي لا تعبر عن البروتين من الفائدة 14.

ينبغي صورة هلام المنتجات PCR (الخطوة 13.4) تظهر مجموعة الحجم الذي يتوافق مع جزء [كدنا] (عالية أو متوسطة أو منخفضة) المنقى في الخطوة 11.4 (الشكل 4 ، الممرات 4-6). علما بأن الاشعال PCR P3Solexa وP5Solexa إدخال إضافي 76 NT لحجم [كدنا]. إذا لم يتم استخدام الأجسام المضادة خلال مناعي ، ينبغي الكشف عن أية منتجات PCR المقابلة (الشكل 4 ، والممرات 1-3). يمكن التمهيدي المنتج ديمر تظهر في حوالي 140 NT.

من أجل تحقيق النتائج ممثل عالية الإنتاجية التسلسل والتحليلات بيوينفورمتيك اللاحقة انظر 14.

الشكل 1
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لبروتوكول iCLIP. والبروتينات والحمض النووي الريبي تساهميا المجمعات عبر ربط المجراة باستخدام اشعة فوق البنفسجية (الخطوة 1). يتم تنقية هذا البروتين في المصالح مع الحمض النووي الريبي ملزمة (الخطوات 2-5). للسماح لفتيلة محددة تسلسل النسخ العكسي ، وligated محول RNA إلى 3 'نهاية الحمض النووي الريبي ، في حين أن 5' يسمى بالإشعاع نهاية (الخطوات 6 و 7). وتنقيته عبر ربط البروتين النووي الريبي RNA من المجمعات مجانا باستخدام SDS - PAGE ونقل غشاء (الخطوة 8). واستعاد الجيش الملكي النيبالي من الغشاء بواسطة هضم البروتين مع بروتين K ترك ببتيد المتبقية في الارتباط عبر النوكليوتيدات (الخطوة 9). النسخ العكسي (RT) باقتطاع في ببتيد المتبقية ويقدم منطقتين محول شطورة ومتواليات الباركود (الخطوة 10). اختيار حجم يزيل مجانا RT التمهيدي قبل التعميم. والخطية التالية يولد قوالب مناسبة لتضخيم PCR (الخطوات 11-15). أخيرا ، وارتفاع إنتاجية تولد يقرأ في التسلسل التي تليها مباشرة في تسلسل النوكليوتيدات الباركود من قبل الأخير من [كدنا] (الخطوة 16). منذ هذا الموقف النوكليوتيدات one يقع المنبع من النوكليوتيدات عبر ربط ، يمكن استخلاصه الموقع ملزم مع دقة عالية.

الشكل 2
الشكل 2. صورة الإشعاع الذاتي عبر ربط مجمعات C - RNA hnRNP تغيير طبيعة استخدام هلام إستشراد ونقل الغشاء. hnRNP C - RNA والمجمعات المناعة تنقيته من مقتطفات الخلية باستخدام جسم مضاد ضد C hnRNP (α hnRNP C ، وعينات 3 و 4). وكان يهضم جزئيا باستخدام الحمض النووي الريبي منخفضة (+) أو عالية (+ +) تركيز ريبونوكلياز. ويمكن ملاحظة تحول المجمعات صعودا من حجم البروتين (40 كيلو دالتون) (نموذج 4). وهذا التحول هو أقل وضوحا عندما استخدمت تركيزات عالية من ريبونوكلياز (نموذج 3). إشارة المشعة يختفي عندما تم استخدام أي جسم في مناعي (عينات 1 و 2).

الشكل 3
الشكل 3. تخطيطي 6 ٪ TBE - اليوريا هلام (Invitrogen) للاسترشاد بها في استئصال المنتجات iCLIP [كدنا]. يتم تشغيل الجل لمدة 40 دقيقة عند 180 V مما أدى إلى وجود نمط الهجرة استنساخه من cDNAs والأصباغ (الضوء والظلام الأزرق) في هلام. استخدام شفرة حلاقة لقطع (خط أحمر) وارتفاع (H) ، متوسطة (M) ومنخفضة (L) الكسور [كدنا]. تبدأ بقطع في منتصف صبغ اللون الأزرق الفاتح وعلى الفور فوق علامة على الكاسيت هلام البلاستيك. تقسيم كسور متوسطة ومنخفضة وتقليم الكسر العالية حوالي 1 سم فوق صبغ اللون الأزرق الفاتح. استخدام تخفيضات العمودي تسترشد الجيوب وصبغ لفصل المسارات المختلفة (في هذا المثال 1-4). يمكن أن تكون ملطخة الممر علامة (م) وتصوير لمراقبةبعد أحجام القطع. يشار إلى أحجام جزء على اليمين.

الشكل 4
الشكل 4. تحليل PCR - مكتبات iCLIP [كدنا] تضخيم استخدام هلام إستشراد. استعاد الجيش الملكي النيبالي من غشاء (الشكل 1) وكتب وعكس حجم المنقى التي تستخدم تغيير طبيعة الكهربائي للهلام (الشكل 2). كسور حجم ثلاثة من [كدنا] (عالية [H] : 120-200 الإقليم الشمالي والمتوسطة [M] : 85-120 NT ومنخفضة [L] : 70-85 NT) تم استردادها ، circularized ، وإعادة خطي وتضخيم PCR. ويمكن ملاحظة توزيع المنتجات PCR مختلفة الحجم نتيجة لأحجام مختلفة من كسور الإدخال. منذ التمهيدي PCR يقدم 76 NT إلى [كدنا] ، وينبغي أن أحجام تتراوح ما بين 196-276 NT عالية ، 161-196 الإقليم الشمالي للمتوسط ​​و146-161 الإقليم الشمالي للكسور حجم صغير. منتجات PCR غائبة عندما تم استخدام أي جسم لمناعي (الممرات 1-3).

Discussion

منذ بروتوكول iCLIP يحتوي على مجموعة متنوعة من التفاعلات الإنزيمية والخطوات لتنقية ، فإنه ليس من السهل دائما تحديد المشكلة عند تجربة فشل. من أجل السيطرة على لخصوصية تحديد المواقع عبر الارتباط RNA ، ينبغي الحفاظ على واحد أو أكثر من عناصر التحكم في كافة مراحل التجربة السلبية الكاملة والتحليلات الحسابية لاحقا. يمكن أن تكون هذه الضوابط العينة عدم الأضداد ، والخلايا غير عبر ربط ، أو مناعي من الخلايا أو الأنسجة خروج المغلوب. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تحكم هذه التجارب لا تنقي أي مجمعات البروتين RNA ، وبالتالي ينبغي أن تعطي أي إشارة على جل SDS - PAGE ، وليس بعد اكتشاف منتجات التضخيم PCR. ينبغي عالية الإنتاجية تسلسل هذه المكتبات التحكم عودة تسلسل فريد قليلة جدا. لا ينصح الخلايا ضربة قاضية كعنصر تحكم التسلسل ، لأن تسلسل الناتجة تقابل ما زال عبر ربط مواقع من البروتين نفسه الذي تتم تنقيته من الخلايا ضربة قاضية بكميات أصغر.

وينبغي أيضا الاحتياطات الواجب اتخاذها لتجنب تلوث المنتجات مع PCR من التجارب السابقة. أفضل وسيلة للحد من هذه المشكلة هو لفصل مكانيا الخطوات السابقة واللاحقة PCR. من الناحية المثالية ، ينبغي إجراء تحليل PCR المنتجات وجميع الخطوات اللاحقة في غرفة منفصلة. وعلاوة على ذلك ، يجب على كل عضو في المختبر استخدام الخاصة بها مجموعة من المخازن والكواشف الأخرى. في هذه الطريقة ، يمكن تحديد مصادر التلوث أسهل.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

الكتاب أشكر جميع أعضاء المختبرات الندبة ، وLuscombe Zupan للمناقشة والمساعدة التجريبية. نشكر جيمس هادفيلد ونيك ماثيوز عن التسلسل الإنتاجية العالية. نود أن نشير إلى أن الأسلوب الموصوفة هنا iCLIP أسهم عدة خطوات مع بروتوكول CLIP الأصلي الذي وضعه جنسن كيرك وJU في مختبر روبرت دارنيل. وأيد هذا العمل عن طريق منح المجلس الأوروبي للبحوث 206726 - CLIP لJU والطويلة الأجل للعلوم الإنسان حدود الزمالة لبرنامج JK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads Invitrogen 10001D use protein G for mouse or goat antibody
RNase I Ambion AM2295 activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I New England Biolabs M0204S
PNK New England Biolabs M0201S
proteinase K Roche Group 03115828001
Superscript III reverse transcriptase Invitrogen 18080044
Circligase II Epicentre Biotechnologies CL9021K
FastDigest® BamHI Fermentas FD0054
AccuPrime™ SuperMix I Invitrogen 12342010 this PCR mix gives the best results in our hands

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
  2. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. RNA. 14, 802-813 (2008).
  3. Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5, 1071-1082 (1999).
  4. Brooks, S. A., Rigby, W. F. Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique. Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).
  5. Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).
  6. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  7. Ule, J. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302, 1212-1215 (2003).
  8. Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37, 376-386 (2005).
  9. Licatalosi, D. D. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456, 464-469 (2008).
  10. Yeo, G. W. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).
  11. Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles. Methods. 26, 170-181 (2002).
  12. König, J. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).

Erratum

Formal Correction: Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution
Posted by JoVE Editors on 07/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to:

"...as well as 2 μl Turbo DNase..."

instead of:

"...as well as 2 ml Turbo DNase..."

Comments

71 Comments

  1. Hi,

    First I would like to say this latest method is really neat. I also like Julian's comment at the end of the video when he said with a big smirk, "You have to perform each of the 64 steps with 100% accuracy". :D That is epic.

    On a more serious note, I am just wondering if anyone can suggest what sort of primer I should use if I want to start by cloning my insert into TOPO vector instead of doing nextGen sequencing. Any help is appreciated.

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2011 - 3:47 AM
  2. Hi Paul, thanks for your fun comment! TOPO cloning dŒsn²17;t require any specific primer, so you could use the one described in the protocol. Unless you wish to do something specific, such as concatemerization of sequences before inserting them into vector. Feel free to post more questions! Jernej

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 11, 2011 - 4:19 PM
  3. For more iCLIP questions and answers, use the following Googledoc: http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 13, 2011 - 11:28 AM
  4. Hi Jernej,
    Is it possible to use a 3' linker with a phosphorylated 5' end instead of a pre-adenylated 5' end and adding some ATP during the 3' linker ligation step? Thanks. Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 13, 2011 - 10:13 PM
  5. Yes, just follow the protocol as described in Konig et al, NSMB ²010 (PMID ²0601959). More on Googledoc.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 14, 2011 - 3:48 AM
  6. Hi Jernej,

    Sorry to keep bombarding you with questions. In the supplementary section of your NSMB ²010 paper, shrimp alkaline phosphatase was used to desphosphorylate 3' ends. My understanding is that SAP can only desphosphorylate 5' ends. I am wondering if you had dephosphorylated 3' ends step using PNK before using SAP to dephosphorylate 5' ends.

    Quote from Konig et al, NSMB ²010: "For dephosphorylation of 3²4²; ends, Dynabeads were resuspended in ² µl 10&#²15; Shrimp alkaline phosphatase buffer (Promega), 17.5 µl H²O and 0.1 µl Shrimp alkaline
    phosphatase (Promega) and incubated at 37°C for 10 min with intermittent shaking (10 sec at 700 rpm followed by ²0 sec pause)."

    Thank you again for your help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2011 - 4:04 AM
  7. We did use SAP in the NSMB protocol - it dŒsn't work as well as PNK on the 3' ends. We couldn't use PNK at the time, because PNK carryover into ligation reaction would create problems in the presence of ATP. In jove protocol, ligation reaction lacks ATP, therefore we can use PNK to dephosphorylate the 3' ends.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2011 - 6:30 PM
  8. Hi Jernej,

    On 3.² it says add ²ml Turbo DNAse into the 1.5 ml tube. I am wondering if that amount is correct.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 9, 2011 - 11:45 PM
  9. Hello Paul,
    you are right, it should be two micro liters. Sorry for that, I will try to have it changed,
    Julian

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 6:56 AM
  10. Hi Jernej, great protocol! Just a precision, the L3 oligo is a pre-adenylated DNA or RNA oligo? Not clear as the original Clip and iClip uses RNA...

    Thanks a bunch,

    Marco

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 12, 2011 - 3:58 PM
  11. Hi Marco. It's a DNA oligo. Best, Jernej

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 12, 2011 - 4:02 PM
  12. Hi Jernej,

    I am wondering if the 3²P-ATP batch that you normally use in your lab for step 6.1 always has close to a 100% reported radioactivity. What is the lowest percentage of remaining 3²P that you can usually still get away with? I can still get some decent signal when using 3²P-ATP that has ~50-60% remaining radioactivity but my bands on the films are not as intense as the one that I see in your publications. I am trying to work out the best schedule for ordering some 3²P-ATP and starting my experiments. Thanks again.

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 14, 2011 - 11:32 PM
  13. We don't use ATP if it's more than two weeks old, thus we have >50% radioactivity. But signal intensity also depends on the efficiency of crosslinking and IP,and amount of protein expression in the cells.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2011 - 4:23 AM
  14. Hi Jernej,
    Thank you for the protocol. What results if I reduce the cell samples to 100-1000 (not 10*6-7 cells) ? Thanks for your reply.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 12:24 AM
  15. That would be challenging. If you have an abundant protein that cross-links well to RNA, then it might be possible. So try running the radioactive protein-RNA complex on the gel - if you good signal after overnight exposure, then it's doable.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 4:52 AM
  16. Hi, Jernej !
    Thank you for the reply. I have another questions: How stable if the RNA-RNA and RNA-Protein photocrosslinking? How to degrade these proteins or remove the photocrosslinking? Thank you a lots.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 6:36 AM
  17. Hi Jernej,

    I again have some more questions. Do you still expose the nitrocellulose membrane at -80C when using phosphoimager instead of a film? I'm also wondering what exposure time your lab uses when using a phosphorimager screen.

    Secondly, I am wondering how many libraries containing different barcodes you can run together in a single flow cells.

    Thank you again Jernej. This protocol has been extremely useful.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:49 PM
  18. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  19. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  20. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  21. Hi Jernej,

    In regards to one of the FAQs from Google docs.

    - When analysing PCR products, I see a band corresponding to the size of primer dimers, especially in the sample that was cut low from cDNA gel.

    Yes, it is common to see this band in the sample that was cut low from cDNA gel, and sometimes also in other samples. This is due to contamination from short cDNAs that only contain the sequence of RT primer. If this primer dimer is the dominant product on gel, we advise against sequencing the corresponding sample.

    I seem to be getting this short cDNA contamination all the time. Do you have any advice on how I could try to minimise the contamination? Have you ever isolated fragments of correct-size cDNA from a TBE-urea gel and sent only the isolated fragment for sequencing when you have short cDNA contaminations? Do you think that will work? I think that the concentration of L3 linker that I had used might have been too much. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2011 - 7:45 PM
  22. There are several possible reasons for this. Maybe one aspect of the protocol is not working, and therefore you are not producing any specific cDNA. If you have no cDNA input, then with enough cycles, you can amplify the primer-primer from any part of the gel. If you are using mammalian cells, try to get the protocol working first with hnRNP C or TIA with Santa cruz antibodies that we used in recent publications. Otherwise, using too much L3 can be a problem.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 23, 2011 - 4:35 AM
  23. Very useful protocol. I have two questions.

    1. For dephosphorylation of RNA 3'ends, pH 6.5 PNK buffer is used, rather than the pH 7.6 buffer, provided by NEB. Have you compared these two conditions internally?
    ². In the protocol, the final PCR product is not isolated and quantitated before submitting for the sequencing. Are there any potential problems of doing these two steps? Can I isolate the PCR product and re-PCR using the same primers to get more product (for Illumina Hiseq)? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 5, 2012 - 3:40 PM
  24. You can find more related answers in Googledoc http://goo.gl/4tSci, but short answers are also below:

    1. We haven²17;t compared conditions, but increased phophatase activity of PNK at lower pH has been reported in literature, you can read more in the Pubmed ID 1184²1²0.

    ². The PCR product needs to be quantified. We use both qPCR and bioanalyser. Normally, the products of the first PCR should look clean on the gel, otherwise it is a sign of a library that is of low complexity, and is unlikely to generate informative data. Therefore we advise against re-PCR, but it can be done as the last resource.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 5, 2012 - 4:56 PM
  25. Hi Jernej,

    I noticed you use +/- 10 multiplexed libraries; I was wondering if you knew how many are necessary for a successful run (i.e. to provide sufficient distribution for cluster identification)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 2:20 PM
  26. The way the primers are designed here, no multiplexing is necessary, because the first three nucleotides in the primer sequence are random (part of randomer = NNN).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 2:28 PM
  27. I appreciate your experiment. I have some qeustions.

    In this protocol, what dŒs barcode do high-throughout squencing?

    I don't understand function of barcode



    Reply
    Posted by: seung kuk P.
    May 23, 2012 - 6:45 AM
  28. Hi,
    this might be a really naive question but I'm wondering at the UV cross linking step, when you say you irradiate once, dŒ's this mean 1 min?

    Thank you!
    Zsofi

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    June 18, 2012 - 1:19 PM
  29. Hello, Thank you for this helpful technique, I just have a question. My experiments protocols are: 1. UV-crosslink RNA-protein; ². Isolate the RNA-protein complex by immunopricitation; 3. Isolate the binding RNA. 3²P-labeling the binding RNA. 4. Analysis the RNA by microarray.
    Because I do not need to sequence the RNA, and I only want to isolate the binding RNA for microarray analysis after UV-crosslink RNA-protein, so I wonder whether I need to do the step 5-7 in your protocols or I could skip from step 4 to step 8 in your protocol?

    Thanks very much, I look forward to your kind reply!

    Sean

    Reply
    Posted by: xiaoyun w.
    July 22, 2012 - 9:09 PM
  30. It is unlikely you will have enough cDNA for microarray hybridisation without some kind of amplification. You can try using steps 4-8, but you could also amplify in other ways.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 23, 2012 - 6:03 AM
  31. Hi Jernej,

    Is there any published article on how to analyse iCLIP's high-throughput sequencing data? I have just got my sequencing results back following steps in your protocol. I want to make sure I check with you before digging into the data. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 1, 2012 - 10:15 PM
  32. The article is not yet published, but is in preparation by Tomaz Curk ( http://www.fri.uni-lj.si/en/tomaz-curk/), who made a public server: http://icount.biolab.si/. You can contact Tomaz at tomaz.curk@fri.uni-lj.si for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2012 - 5:47 AM
  33. Hi,
    it is so powerful technique! But I cannot IP any protein follow protocol. Is there any difference in affinity between different antibodies and their antigen? Could you give me some advice? Maybe we could decrease concentration of SDS or sodium deoxycholate?
    Thanks, I look forward to your kind reply!
    Min

    Reply
    Posted by: Min S.
    August 5, 2012 - 11:04 PM
  34. Hi Min, you can find advice on IP googledoc http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2012 - 3:35 AM
  35. Hi Jernej,

    With the barcoding system, I am just wondering if the three random nucleotides are there for indexing purpose during Illumina sequencing run but it's not necessary for splitting the different libraries later on. For RC1, the sequencing results will be something like NNNGGTTNN.... During analysis, do you usually trim the 3-bp from the 5'-end of the results and split the different replicates after the trimming step? I have just realised this was slightly different to the barcoding system used in your NSMB paper. -paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2012 - 9:41 PM
  36. Hi Paul! You can find the answer under the topic of "Use of random barcode in data analysis" in http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 7, 2012 - 7:58 AM
  37. Hi Jernej,

    I started optimising CLIP couple of months ago and I'm at the stage that I'm convinced that I can efficiently cross link RNA to my protein (checked it by specific qRT PCR). I'm lucky because I don't need to fiddle with the IP since I've optimised before and works fine. But just to double check, after IP and western blotting a smear and a lower amount of original kDa protein is a good sing for cross linking yes?
    So my problems started at the RNase A step, I don't see any changes in size/appearance on WB after treatment... I'm convinced that my protein creates a massive complex (couple of 100 kDa) and it is because my target RNA is 10 kb to start with and there are at least 3 proteins binding to it. I'm working with a RNA virus, that's the explanation for it. I think the reason I don't see any change in kDA is because the complex dŒsn't even enter the gel to start up with. Although I used the given buffer which should break any membrane apart but the proteins are still there possibly protecting the RNA. Did you ever come across similar problems and would you have any suggestions? Also, I understand that the RNase trimming is necessary for the efficient RT step but is it a problem if the RNA is too long? What is too long? DŒs this depend on the RT enzyme used I recon or is this also important for the sequencing?

    I would greatly appreciate yur help because I'm stuck...

    Thank you,
    Zsofi

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    October 10, 2012 - 7:38 AM
  38. Hi Zsofi,

    For partial RNAse digestion we use RNase I (step 3). We use two different concentrations: a lower one that makes fragments with a mean between 50-100 bp and a higher concentration that fragments RNA to around 10bp. The lower one is used for preparing libraries, the higher one is used for analytical reasons.

    The RNAse step is important to (1) allow the protein RNA complex enter the Gel (²) to narrow down the crosslink site to a fragment with a size compatible with high throughput sequencing (maximum around 300 bp). So you definitely need to optimize this step for your experiments.

    If the complex you are studying is not covalently linked it should fall apart during the denaturing Gel run. Only a small fraction of your complex will have all the proteins of your complex crosslinked to the RNA at the same time since crosslinking is a very inefficient step. Therefore with the higher RNAse concentration you should be able to see a radioactive signal at the size of the protein you are studying.

    I hope that helps, best regards,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    October 11, 2012 - 9:49 AM
  39. Hi Julian,

    I have had some trouble with the RNase step when nuclease-ing the total lysate... In my troubleshooting efforts I read that RNase I is inhibited by 0.1% SDS, which is the concentration used in your lysis buffer. It dŒsn't seem that you guys have any problem though...do you think this is due to using an excess of RNase I or what? Just curiously confused. Thanks,

    sam

    Reply
    Posted by: Sam F.
    February 5, 2013 - 6:00 PM
  40. Hi Sam,

    in our experience the inhibition of RNase I by SDS is not an issue. You just optimize the concentration of RNase I to obtain the desired fragmentation. If you have problems doing that with your buffer conditions, you could also do the RNase digestion on the beads instead of in the lysate.

    Best,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 6, 2013 - 6:19 AM
  41. Thanks for the quick reply Julian. Your recommendation to do the "on bead" digestion is exactly what I have done and it seems to be working fine. Cheers

    Posted by: Sam F.
    February 6, 2013 - 10:12 AM
  42. Hi,

    I was wondering how many minutes have you irradiated the cells in case of HNRNP C?

    Reply
    Posted by: Niaz M.
    November 26, 2012 - 6:29 PM
  43. Hi Niaz,
    we are normally not measuring time of irradiation but the Energy per square centimeter:
    Step 1.²: ... Irradiate once with 150 mJ/cm² at ²54 nm.
    In our Stratalinker this takes 50s. However time of irradiation is not very informative here since it changes with the age or quality of the lamps, etc.
    Cheers, Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    November 27, 2012 - 6:20 AM
  44. Hi,

    Thank you for wonderful protocol !

    I would like to confirm about adaptor and primer sequences.
    1. L3 adaptor and Rclip RT primer has ²²0;same²²1; sequences, not ²²0;complementary²²1; sequences. Are they O.K.? In my understanding, L3 and TR primers should have ²²0;complementary sequences.
    ². P3 Solexa 3²17; 11 nt sequence (TCTTCCGATCT) looks ²²0;extra²²1;. Both of P5 and P3 have the same sequence, which is complementary to Rclip RT primer or L3 adaptor. I think only P5 should have this sequence.

    Thank you for your help.

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 3:04 AM
  45. Hi,

    Thank you for wonderful protocol !

    I would like to confirm about adaptor and primer sequences.
    1. L3 adaptor and Rclip RT primer has ²²0;same²²1; sequences, not ²²0;complementary²²1; sequences. Are they O.K.? In my understanding, L3 and TR primers should have ²²0;complementary sequences.
    ². P3 Solexa 3²17; 11 nt sequence (TCTTCCGATCT) looks ²²0;extra²²1;. Both of P5 and P3 have the same sequence, which is complementary to Rclip RT primer or L3 adaptor. I think only P5 should have this sequence.

    Thank you for your help.

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 3:04 AM
  46. Hi Lisa,

    it is correct that the ends of P3 and P5 primers are the same. This is because of Illumina's primer design for their high throughput sequencing platform. When you look at the 3' end of the Rclip primers (after the Bamhi cleavage site) you can see that they are actually complementary to the 3'end of the L3 adapter.

    Cheers,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    December 18, 2012 - 10:05 AM
  47. I got it !!!
    Thank you :)

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 1:11 PM
  48. Hi
    Thanks for the protocol. I have one question that has been bothering me, though. Both the RNA ligase and PNK buffers will expose the antibody column to relatively high dithiothreitol (DTT) concentrations (10 mM and 5 mM respectively). Why dŒsn't this destroy the column by reducing the disulphide bonds holding the heavy and light antibody chains together? Have you ever tried to improve the immunoprecipitation step by attempting to minimize the DTT concentration as much as possible or is this not an issue. Any assistance would be greatly appreciated. Thanks - Greg

    Reply
    Posted by: Greg C.
    February 3, 2013 - 2:13 PM
  49. Hi Greg, we haven't seen an effect of the DTT in the buffers on the IP efficiency, it seems that the concentration is not high enough to reduce the IgG - however, it is worth testing this the first time you do IP, since it is plausible that this will vary dependent on the source of your buffers (company used for PNK and ligase), or antibodies.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2013 - 2:45 AM
  50. Hi Jernej,
    Thanks for the reply. The antibody I am using is definitely sensitive to the level of DTT found in the PNK buffer and I need to limit the over-all exposure of the column to DTT as much as possible. As a result, rather than using PNK as the 3' phosphatase, I would like to use an alkaline phosphatase. I noticed that in your ²010 NSMB paper you are using Shrimp Alkaline Phosphatase and in your ²009 Methods paper you use FAST AP. Did you find that the Shrimp phosphatase is significantly better ?

    Thanks again - Greg

    Reply
    Posted by: Greg C.
    February 8, 2013 - 3:52 PM
  51. Hi Greg, we don't have any evidence to suggest that one is better than the other for the on-bead reaction. At the time we were using SAP in the lab generally since it can be heat-inactivated, so therefore we also used it for on-bead (even though here you can't heat-inactivate it on beads). So you can go ahead with either one.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2013 - 5:29 AM
  52. I should also add that even though we didn't compare FAST AP and SAP, we did compare SAP with PNK, and we had a lot better results with PNK. It seems that SAP is not efficient as a 3' phosphatase. So it may be better for you to determine the minimal DTT amount in the buffer that is compatible with your antibody, and then continue using it with PNK and ligase. If you use fresh DTT, 1mM is likely to be sufficient both for PNK and RNA ligase.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2013 - 5:39 AM
  53. Thanks, I really appreciate the advice.
    -Greg

    Posted by: Greg C.
    February 9, 2013 - 9:03 AM
  54. Hi, thanks for the awesome video. I have two questions related to the reagents:
    1. What concentration is the PEG400? (it only says 4 ul in the protocol).
    ². Under "Reverse transcription", step 6, what is the pH of the TE buffer you use? Is it pH 8?
    Thank you very much for your help. -QT

    Reply
    Posted by: Qiumin T.
    February 7, 2013 - 1:22 PM
  55. Hi QT,
    (1) we are using PEG400 from Sigma (²0²398). It is a viscous liquid.
    (²) Yes, the it is pH 8
    Cheers, Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 7, 2013 - 4:56 PM
  56. Thank you so much Julian. I have another question. Could you recommend a protocol for doing iCLIP with mouse brain tissue? Do you know whether the tissue prep steps from this protocol ( http://ago.rockefeller.edu/Ago_HITS_CLIP_Protocol_June_²009.pdf) will work well for iCLIP as well?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 13, 2013 - 5:52 PM
  57. This protocol should be fine. We also recently published a bookchapter about the iCLIP protocol which contains information on tissue samples and lots of other useful info and background:
    http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.100²/97835²764458².ch10/summary

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 14, 2013 - 5:19 AM
  58. The pre-publication version of the book chapter is available here: http://www².mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/jule/publications/Konig_wiley.pdf.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2013 - 1:54 PM
  59. I enjoyed reading about your updated iCLIP protocol in the book Tag-based Next Generation Sequencing from Wiley. I would be grateful for more details about the amount and activity of the 3²-P that you use to radioalabel the RNA. In both the book chapter and the JoVE article I see only volumes, not activities.

    In the figure for step 9, the radiolabel on the 5' end of the RNA is missing, but shouldn't it still be there? At what point in the protocol can we be reasonably sure that we are dealing with unlabeled material?

    Also, have you ever explored non-radioactive approaches to labeling, or is the sensitivity of these methods too low for the purposes of this protocol?

    Thanks!

    John

    Reply
    Posted by: John S.
    June 17, 2013 - 9:23 AM
  60. Dear John,

    with the current protocol most of the radioactivity is gone after the gel purification of the cDNA. You can increase this effect by treating the samples with RNAse after the reverse transcription (The radioactive RNA fragments then running much faster then the cDNAs in the gel). We are currently working on a protocol where we fragment the RNA by alkaline hydrolysis, which will be available soon (We want to avoid using too much RNAse at our desks).

    In addition you should always measure your samples with a Geiger counter. If your final PCRs are still hot, then you should decrease the fraction of beads that go into the labeling reaction.

    Best wishes,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    June 19, 2013 - 11:52 AM
  61. Hi,
    I have a question which relies on your experience with the data generated with CLIP:
    because of the UV irradiation the protein crosslinks to the RNA which even after proteinase K treatment presents an obstruction to the reverse transcriptase which therefore either skips or adds random nucleotide(s). So my question is that how long the deletions/insertions can be? Is it only one nucleotide or can also be 20?

    Thank you very much!!!

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    August 8, 2013 - 12:06 PM
  62. We see that >80% of cDNAs truncate at the crosslink site, and the mutations are quite rare in the remaining sequences. All we know about crosslink-induced mutations has been published here: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22863408.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 8, 2013 - 12:15 PM
  63. Thanks for your protocol. I have a question about the IgG background signal in the p32 labeled Western Blot. I used mouse IgG1 isotype as a control. I did not crosslink the IgG to the beads, so IgG1 stays around 50 and 25 KDa region. I do observe some radioactivity band around 50 kDa. Do you notice this in your experiments as well? Since it is close to my protein region, can you give me some suggestions to avoid this?

    Sincerely,
    Mei

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 9, 2013 - 1:42 PM
  64. We don't get a signal in control IP. Most likely this is an RBP that non-specifically binds under your conditions. It is important to wash with high-salt buffer, and rotate the tubes for ±5min during these washes. Also, diluting the lysate before IP may help. Standard IP optimisations, basically.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2013 - 2:24 PM
  65. Hi,
    Thank you for wonderful protocol.
    Usually how much RNA concentration one should get after Isolation from membrane? I would appreciate your reply.

    Reply
    Posted by: Bhagya B.
    August 13, 2013 - 5:29 AM
  66. Hi,
    Thank you for wonderful protocol.
    Usually how much RNA concentration one should get after Isolation from membrane? I would appreciate your reply.

    Reply
    Posted by: Bhagya B.
    August 13, 2013 - 5:57 AM
  67. Hi,
    I have 2 more questions. In this protocol you did not remove 5' phosphate of the RNA, can you still label the 5' side with P32 by PNK later? Another question, is it possible to just p32 label the RNA, cut the band, extract, degrade the protein and add 3' linker for RT later?

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 21, 2013 - 2:06 PM
  68. Normal PNK has phosphatase activity, so it can replace the 5' phosphate. The original CLIP protocol from Ule et al, Science 2003 added 3' linker after RNA extraction, but as explained in Ule et al, Methods 2005., the efficiency and purity of the protocol increases if linker is ligated on beads.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2013 - 2:15 PM
  69. Thanks for this amazing protocol and your rapid and very helpful exchange here in this site.

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 21, 2013 - 2:26 PM
  70. Hello, thank you for this wonderful protocol.
    I have a question:
    -I get positive Radioactive signal at the right size of positive CTRL used in this protocol in the NOT UV samples, it looks exactly as I was using high RNAse condition. why?
    I am phosphorylating the protein? is it possible?
    thank you

    Reply
    Posted by: jessica c.
    February 27, 2016 - 8:45 PM
  71. Hi Jessica, you are right, if you see signal in the non-UV control, this means that the protein is getting phosphorylated in some other way. If it has a kinase domain it may even phosphorylate itself. Or maybe some kinase is getting co-purified? You could check for this by omitting PNK from the phosphorylation reaction.

    Reply
    Posted by: Jernej U.
    March 16, 2016 - 11:07 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats