iCLIP - Transcriptome רחב מיפוי של חלבון-RNA אינטראקציות עם רזולוציה נוקלאוטיד יחיד

Biology
 

ERRATUM NOTICE

Summary

הסידור המרחבי של חלבונים RNA מחייב על תעתיק הוא הקובע המפתח של תקנה שלאחר תעתיק. לכן, פיתחנו הפרט נוקלאוטיד UV ברזולוציה crosslinking ו immunoprecipitation (iCLIP) המאפשר מיפוי מדויק גנום רחב של אתרי הקישור של חלבון-RNA מחייב.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Konig, J., Zarnack, K., Rot, G., Curk, T., Kayikci, M., Zupan, B., Turner, D. J., Luscombe, N. M., Ule, J. iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. J. Vis. Exp. (50), e2638, doi:10.3791/2638 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הרכב ייחודי הסדר המרחבי של RNA מחייב חלבונים (RBPs) על תעתיק המדריך היבטים מגוונים של תקנה שלאחר תעתיק 1. לכן, צעד חיוני לקראת הבנה תקנה תמליל ברמה המולקולרית היא להשיג מידע מיקומית על אתרי הקישור של RBPs 2.

חלבון-RNA אינטראקציות ניתן ללמוד בשיטות ביוכימיות, אך גישות אלה אינן כתובת RNA מחייב בהקשר הסלולר המקורית שלו. ניסיונות ראשוניים ללמוד חלבון-RNA מתחמי בסביבה הסלולרי שלהם מועסקים טיהור זיקה או immunoprecipitation בשילוב עם תצוגת ההפרש או ניתוח microarray (RIP-Chip), 3-5. גישות אלה היו מועדים בזיהוי אינטראקציות עקיפה או שאינם פיזיולוגיים 6. על מנת להגביר את הספציפיות ופתרון מיקומית, אסטרטגיה המכונה CLIP (UV cross-linking ו immunoprecipitation) הוצג 7,8. CLIP משלב cross-linking UV של חלבונים ומולקולות RNA עם ערכות טיהור קפדני כולל ג'ל אלקטרופורזה denaturing polyacrylamide. בשילוב עם תפוקה גבוהה טכנולוגיות רצף, CLIP הוכח ככלי רב עוצמה כדי לחקור אינטראקציות חלבון-RNA בקנה מידה הגנום כולו (המכונה CLIP-היטים או CLIP-seq) 9,10. לאחרונה, PAR-CLIP הוצג המשתמשת אנלוגים ribonucleoside photoreactive עבור cross-linking 11,12.

למרות הספציפיות הגבוהה של נתונים המתקבלים, ניסויים CLIP לעתים קרובות ליצור ספריות cDNA של מורכבות רצף מוגבל. זה נובע בחלקו לכמות מוגבלת של שיתוף מטוהרים RNA ושני התגובות יעיל RNA קשירת הדרוש לשם הכנת הספרייה. בנוסף, תחל הרחבת מבחני ציינו כי cDNAs רבים לחתוך בטרם עת על 13 נוקליאוטידים crosslinked. CDNAs מקוצץ כאלה הם איבדו במהלך פרוטוקול סטנדרטי CLIP ספריה הכנה. פיתחנו לאחרונה iCLIP (נוקלאוטיד יחיד-CLIP רזולוציה), אשר לוכדת את cDNAs מקוצץ ידי החלפת אחד מולקולאריים הצעדים יעיל RNA קשירת עם circularization יעיל יותר cDNA intramolecular (איור 1) 14. חשוב לציין, רצף cDNAs מקוצץ מספק תובנות לגבי המיקום של אתר cross-הקישור ברזולוציה של נוקלאוטיד. אנו ליישם בהצלחה iCLIP ללמוד hnRNP ארגון C החלקיקים בקנה מידה הגנום כולו ולהעריך את תפקידה בתקנה שחבור 14.

Protocol

1. UV cross-linking של תאים בתרבית רקמה

  1. הסר את המדיה ולהוסיף 6 מ"ל קר כקרח PBS לתאים הגדלים צלחת 10 ס"מ (מספיק בשביל שלושה ניסויים).
  2. הסר את המכסה ומניחים על קרח. מקרינים פעם עם 150 mJ / 2 ס"מ על 254 ננומטר.
  3. קציר התאים על ידי גירוד עם מרים תא.
  4. העברת 2 מ"ל ההשעיה תא אחד של שלושה microtubes. ספין במהירות שיא עבור 10 שניות ב 4 ° C לתאי גלולה, ולאחר מכן להסיר supernatant.
  5. Snap-להקפיא את כדורי התא על הקרח חנות יבש ב -80 ° C עד השימוש.

2. ביד הכנה

  1. הוסף 100 μl של חלבון Dynabeads (Dynal, 100.02) עבור ניסוי microtube טרי (השתמש Dynabeads חלבון G עבור עכבר או נוגדנים עז).
  2. לשטוף עם חרוזים 2x חיץ תמוגה (50 mM טריס-HCl, pH 7.4, 100 מ"מ NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, deoxycholate נתרן 0.5%, 1 / 100 מעכבי פרוטאז קוקטייל השלישי, Calbiochem).
  3. Resuspend חרוזים במאגר 100 תמוגה μl עם נוגדן 20-10 מיקרוגרם.
  4. סובב צינורות בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות.
  5. לשטוף 3x עם חיץ 900 תמוגה μl ולהשאיר בכביסה האחרונה עד מוכנים לשלב 4.1.

3. תא תמוגה חלקי מערכת העיכול RNA

  1. Resuspend התא גלולה במאגר 1 מ"ל תמוגה ולהעביר microtubes 1.5 מ"ל.
  2. הכן דילול 1 / 500 של RNase אני (Ambion, AM2295). הוסף 10 μl דילול RNase אני, כמו גם 2 DNase טורבו μl lysate אל התא (1 / 500 RNase דילולים אני [נמוך RNase] משמשים להכנת ספריה, 1 / 50 דילולים [גבוה RNase] יש צורך לשלוט על סגוליות נוגדן) .
  3. דגירה דגימות 3 דקות בדיוק בשעה 37 ° C, רועד בסל"ד 1100. מיד להעביר קרח.
  4. ספין על 4 ° C ו 22,000 g עבור 20 דקות כדי לנקות את lysate. בזהירות לאסוף את supernatant (להשאיר על 50 lysate μl עם גלולה).

4. Immunoprecipitation

  1. הסר את חוצץ לשטוף מן חרוזים (משלב 2.5), ואז להוסיף את lysate תא (משלב 3.4).
  2. סובב את דגימות עבור 2 שעות על 4 ° C.
  3. בטל supernatant ולשטוף את החרוזים 2x עם חיץ 900 μl מלח גבוהה (50 מ"מ טריס-HCl, pH 7.4, 1 M NaCl: 1 mM EDTA; 1% NP-40, 0.1% SDS, נתרן deoxycholate 0.5%).
  4. לשטוף עם 2x חיץ 900 לשטוף μl (20 mM טריס-HCl, pH 7.4, 10 mM MgCl 2; 0.2% Tween-20).

5. Dephosphorylation של רנ"א 3'ends

  1. בטל supernatant ו resuspend החרוזים בתמהיל 20 PNK μl (15 μl מים; 4 pH μl 5x PNK 6.5 חיץ [350mMTris-HCl, pH 6.5, 50mMMgCl 25mMdithiothreitol 2]; 0.5 μl אנזים PNK; 0.5 μl RNasin [Promega]).
  2. דגירה של 20 דקות בשעה 37 ° C.
  3. הוסף 500 μl חיץ לרחוץ ולשטוף 1x עם חיץ גבוה מלח.
  4. לשטוף עם 2x חיץ לשטוף.

6. קשירת Linker ל RNA הקצוות "3

  1. הסר בזהירות את supernatant ו resuspend החרוזים בתמהיל קשירת μl 20 (9 μl מים; 4 קשירת μl חיץ 4x [200 mMTris-HCl: MM 40m gCl 2; 40 dithiothreitol mM]; 1 μl RNA האנזים [חוד]; 0.5 RNasin μl [Promega]; 1.5 מקשר μl מראש adenylated L3 [20 מיקרומטר]; 4 μl PEG400 [81170, סיגמא]).
  2. דגירה לילה בשעה 16 ° C.
  3. הוסף 500 μl חיץ לשטוף ולאחר מכן לשטוף עם 2x חיץ גבוה מלח 1 מ"ל.
  4. לשטוף עם 2x חיץ מ"ל 1 לרחוץ לעזוב מ"ל 1 של לשטוף את השני.

7. סוף תיוג RNA 5 "

  1. הסר את supernatant ו resuspend את החרוזים μl 8 תמהיל PNK חם (0.4 μl PNK [חוד]; 0.8 μl 32 P-γ-ATP; 0.8 חיץ μl 10x PNK [חוד]; 6 מים μl).
  2. דגירה של 5 דק 'ב 37 ° C.
  3. מוציאים את תערובת PNK חם resuspend את החרוזים 20 Nupage μl חיץ 1x העמסה (Invitrogen).
  4. לדגור על thermomixer ב 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  5. מיד מקום על מגנט כדי לזרז את החרוזים ריק לטעון את supernatant על הג'ל (ראה שלב 8).

8. SDS-PAGE והעברת הממברנה

  1. טען את דגימות על NuPAGE 4-12% Bis-טריס ג'ל (Invitrogen) על פי הוראות היצרן. אני השתמש 0.5 של 1x מגבים לרוץ חיץ (Invitrogen). גם עומס של 5 μl סמן טרום מוכתמים בחלבון גודל (למשל PAGE שליט פלוס, Fermentas, SM1811).
  2. הפעל את ג'ל 50 דקות ב 180 V.
  3. הסר את חזית ג'ל וזורקים כמו פסולת מוצקה (מכיל חופשי רדיואקטיבי ATP).
  4. מעבירים את חלבון-RNA מתחמי מן הג'ל על קרום nitrocellulose באמצעות מנגנון העברת Novex רטוב על פי הוראות היצרן (Invitrogen, העברת 1 h ב V 30).
  5. לאחר ההעברה, יש לשטוף את הממברנה במאגר PBS, אז לעטוף אותו בפלסטיק נצמד ולחשוף אותו סרט פוג'י ב -80 ° C (מקום מדבקה ניאון ליד הממברנה כדי ליישר לא מאוחרהוא סרט הממברנה; לבצע חשיפות של 30 דקות, 1h ומעלה בלילה).

9. בידוד RNA

  1. לבודד את חלבון-RNA מתחמי מניסוי נמוכה RNase באמצעות autoradiograph משלב 8.5 כמסיכה. חותכים את הקטע הזה של קרום לפרוסות קטנות כמה ולמקם אותם לתוך microtube 1.5 מ"ל.
  2. הוסף 200 μl חיץ קי (100 מ"מ טריס-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA) וכן 10 μl proteinase K (רוש, 03115828001) את פיסות קרום. דגירה רועד בסל"ד 1100 עבור 20 דקות בשעה 37 ° C.
  3. הוסף 200 μl של PKurea חיץ (100 מ"מ טריס-HCl pH 7.4, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA; 7 M אוריאה) ו דגירה של 20 דקות בשעה 37 ° C.
  4. איסוף הפתרון ולהוסיף אותו יחד עם 400 μl של רנ"א פנול / כלורופורם (Ambion, 9722) עד שלב 2 צינור מ"ל ג'ל נעל כבדה (713-2536, VWR).
  5. דגירה של 5 דקות בקצב של 30 ° C, רועד בסל"ד 1100. הפרד את השלבים על ידי ספינינג במשך 5 דקות ב 13,000 סל"ד בטמפרטורת החדר.
  6. מעבירים את השכבה המימית לתוך צינור חדש (להיזהר שלא לגעת בג'ל עם פיפטה). הוספת 0.5 μl glycoblue (Ambion, 9510) ו 40 אצטט μl 3 M נתרן pH 5.5 ומערבבים. לאחר מכן להוסיף 1 מ"ל אתנול 100%, מערבבים שוב לזרז את הלילה בבית -20 ° C.

10. הפוך שעתוק

  1. ספין של 20 דקות ב 15,000 סל"ד ו - 4 ° C. הסר את supernatant לשטוף את הכדור עם 0.5 מ"ל אתנול 80%.
  2. Resuspend את הכדור ב 7.25-RNA μl / תערובת פריימר (6.25 μl מים; 0.5 פריימר Rclip μl [0.5pmol/μl]; 0.5 μl dNTP לערבב [10mm]). עבור כל ניסוי או לשכפל, להשתמש פריימר Rclip שונה המכיל רצפים ברקוד אישי (ראה 14).
  3. דגירה של 5 דקות ב 70 מעלות צלזיוס לפני קירור עד 25 ° C.
  4. הוסף μl 2.75 RT לערבב (2 חיץ μl 5x RT; 0.5 μl 0.1M DTT: 0.25 μl כתב עילי III הפוך transcriptase [Invitrogen]).
  5. דגירה 5 דקות במהירות של 25 ° C, 20 דקות בשעה 42 ° C, 40 דקות בשעה 50 ° C ו 5 דק 'ב 80 ° C לפני קירור 4 ° C.
  6. הוסף 90 μl TE חיץ, 0.5 glycoblue μl ו 10 נתרן אצטט μl pH 5.5 ומערבבים. ואז להוסיף 250% אתנול 100 μl, מערבבים שוב לזרז את הלילה בבית -20 ° C.

11. ג'ל טיהור cDNA

  1. ספין למטה לשטוף את דגימות (ראו 10.1), ואז resuspend את כדורי ב μl 6 של מים.
  2. הוסף חוצץ 6 μl 2x TBE-אוריאה וטעינה (Invitrogen). דגימות חום עד 80 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות ישירות לפני הטעינה.
  3. טען את הדגימות על הג'ל 6% TBE-אוריאה precast (Invitrogen) ולרוץ 40 דקות ב 180 V כפי שתואר על ידי היצרן. גם לטעון סמן נמוך משקל מולקולרי לחיתוך הבאים (ראה להלן).
  4. גזור שלוש להקות ב 120-200 NT (גבוהה), 85-120 NT (בינוני) ו 70-85 NT (נמוך). השתמש theupper לצבוע את הסימנים על התמיכה ג'ל פלסטיק מדריך כריתה (ראה איור 3). שים לב כי תחל Rclip ואת רצף L3 ביחד מהווים NT 52 של רצף CLIP.
  5. הוסף 400 μl TE ולרסק את הפרוסה ג'ל לחתיכות קטנות באמצעות הבוכנה 1 מ"ל במזרק. דגירה רועד בסל"ד 1100 למשך 2 שעות ב 37 ° C.
  6. מניחים שתי 1 כוס ס"מ טרום מסננים (Whatman, 1823010) לתוך עמודה שחקן המשנה SpinX (Corning Incorporated, 8161). מעבירים את החלק הנוזלי של המדגם לעמודה. ספין דקות 1 ב 13,000 סל"ד לתוך צינור 1.5 מ"ל.
  7. הוספת 0.5 μl glycoblue ו 40 נתרן אצטט μl pH 5.5, ואז לערבב את המדגם. הוסף 1 מ"ל אתנול 100%, מערבבים שוב לזרז את הלילה בבית -20 ° C.

12. קשירת של פריימר על 5'end של cDNA

  1. ספין למטה לשטוף את דגימות (ראו 10.1), ואז resuspend את כדורי בתמהיל 8 קשירת μl (6.5 μl מים; 0.8 μl 10x CircLigase הצפת השנייה; 0.4 μl 50 מ"מ MnCl 2; 0.3 μl; Circligase II [Epicentre]) ו דגירה עבור h 1 ב 60 ° C.
  2. הוסף 30 μl לערבב אוליגו חישול (26 μl מים; 3 הצפת FastDigest μl [Fermentas]; 1 μl cut_oligo [10 מיקרומטר]). דגירה דקות 1 ב 95 ° C. ואז להקטין את הטמפרטורה כל 20 שניות עד 1 ° C עד 25 ° C הם הגיעו.
  3. הוסף 2 BamHI μl (Fermentas מהיר) ו דגירה למשך 30 דקות ב 37 ° C.
  4. הוסף 50 μl TE ו 0.5 glycoblue לערבב μl ו. הוסף 10 μl נתרן אצטט pH 5.5 ומערבבים, ואז מוסיפים 250 μl 100% אתנול. מערבבים שוב לזרז את הלילה בבית -20 ° C.

13. PCR הגברה

  1. ספין למטה לשטוף את דגימות (ראו 10.1), ואז resuspend גלולה במים 19 μl.
  2. מכינים את תערובת ה-PCR (19 μl cDNA: 1 μl תערובת פריימר P5/P3 solexa, 10 מיקרומטר אחד; 20 Accuprime μl Supermix האנזים 1 [Invitrogen]).
  3. הפעל את התוכנית הבאה PCR: 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דק ', [94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, 65 ° C למשך 30 שניות, 68 ° C למשך 30 שניות] 25-35 מחזורים, 68 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, 4 ° C לנצח.
  4. מיקס 8 μl מוצר PCR עם 2 μl של חיץ טעינת 5x TBE עומס על ג'ל 6% TBE precast (Invitרוגן). הכתם ג'ל עם Sybrgreen אני (Invitrogen) ולנתח עם imager ג'ל.
  5. ברקוד על primers Rclip מאפשרים דגימות זמנית שונה לפני הגשת עבור סידור תפוקה גבוהה. שלח 15 μl של הספרייה עבור סידור ולאחסן את כל השאר.

14. לינקר ו פריימר רצפים

הדנ"א מקשר טרום adenylated 3 ':

[אנחנו מזמינים את מתאם ה-DNA מן IDT ולאחר מכן לבצע aliquots של 20μM.]

ה-DNA

15. נציג תוצאות:

לפני רצף של הספרייה iCLIP, ההצלחה של הניסוי ניתן לפקח על שני שלבים: autoradiograph של מורכבות חלבון-RNA לאחר העברת קרום (שלב 8.5) ואת התמונה ג'ל של מוצרי ה-PCR (צעד 13.4). ב autoradiograph של הדגימות נמוך RNase, רדיואקטיביות מפוזר יש לראות מעל המשקל המולקולרי של החלבון (איור 2, מדגם 4). ל-high-RNase דגימות, רדיואקטיביות זו מתמקדת יותר משקל מולקולרי של החלבון (איור 2, מדגם 3). כאשר אין נוגדנים משמש immunoprecipitation, אות לא צריך להיות מזוהה (איור 2, דוגמאות 1 ו -2). שולט חשוב נוסף עבור הספציפיות של immunoprecipitation או להשמיט קרינה UV או להשתמש בתאים שאינם מבטאים את החלבון של עניין 14.

התמונה ג'ל של מוצרי ה-PCR (צעד 13.4) צריך להראות מגוון בגודל המתאים השבר cDNA (גבוהה, בינונית או נמוכה) מטוהרים בשלב 11.4 (איור 4, נתיבי 4-6). שים לב primers PCR P3Solexa ו P5Solexa להציג nt נוסף 76 לגודל של cDNA. אם אין נוגדנים משמש במהלך immunoprecipitation, המוצרים המתאימים PCR לא צריך להיות מזוהה (איור 4, נתיבי 1-3). דימר המוצר פריימר יכול להופיע על 140 nt.

לקבלת תוצאות נציג רצף תפוקה גבוהה ומנתח bioinformatic הבאים לראות 14.

איור 1
באיור 1. ייצוג סכמטי של פרוטוקול iCLIP. חלבון-RNA הם קומפלקסים קוולנטית צולבים in vivo באמצעות קרינת UV (שלב 1). החלבון של הריבית מטוהרים יחד עם RNA כבול (שלבים 2-5). כדי לאפשר תחול רצף ספציפי של שעתוק לאחור, מתאם RNA הוא ligated ל 3 "בסופו של רנ"א, בעוד 5 'סוף מסומן רדיואקטיבית (שלבים 6 ו 7). צולבים חלבון-RNA מתחמי הם מטוהרים מ-RNA בחינם באמצעות SDS-PAGE והעברת הממברנה (שלב 8). RNA הוא התאושש הממברנה על ידי לעכל את החלבון עם proteinase K להשאיר פוליפפטיד הנותרים בקישור הנגדית נוקלאוטיד (שלב 9). שעתוק הפוך (RT) חותכת את פוליפפטיד הנותרים ומציג שני אזורים מתאם cleavable רצפים ברקוד (שלב 10). בחירת גודל מסיר חינם פריימר RT לפני circularization. לינאריזציה הבאים מייצר תבניות מתאים הגברה PCR (שלבים 11-15). לבסוף, תפוקה גבוהה יוצרת רצף קורא בו רצפי ברקוד הם מיד אחריו נוקלאוטיד האחרון של cDNA (שלב 16). מאז זה בתנוחה אחת מאתרת נוקלאוטיד במעלה הזרם של צולבים נוקלאוטיד, האתר מחייב ניתן להסיק עם רזולוציה גבוהה.

איור 2
איור 2. Autoradiograph של צולבים hnRNP C-RNA מתחמי באמצעות ג'ל אלקטרופורזה denaturing והעברת הממברנה. hnRNP C-RNA מתחמי היו חיסונית מטוהרים מן תמציות התא באמצעות נוגדן כנגד hnRNP C (α hnRNP C, דגימות 3 ו 4). RNA היה מעוכל חלקית באמצעות נמוך (+) או גבוה (+ +) ריכוז של RNase. מתחמי הסטה כלפי מעלה מ גודל של חלבון (40 KDA) ניתן להבחין (מדגם 4). השינוי בולטת פחות כאשר ריכוזים גבוהים של RNase שימשו (מדגם 3). האות רדיואקטיבי נעלמת כאשר אין נוגדן שימש immunoprecipitation (דוגמאות 1 ו -2).

איור 3
איור 3. 6% סכמטי TBE-אוריאה ג'ל (Invitrogen) להנחות את כריתה של מוצרים iCLIP cDNA. הג'ל הוא לרוץ 40 דק 'ב 180 V המוביל דפוס הגירה לשחזור של cDNAs וצבעים (אור כחול כהה) בתוך הג'ל. השתמש סכין גילוח לחתוך (קו אדום) הגבוהה (H), בינוני (M), נמוך (L) שברים cDNA. התחל על ידי חיתוך באמצע צבע כחול בהיר ומיד לעיל סימן על הקלטת ג'ל פלסטיק. מחלקים את השברים בינוני נמוך לקצץ את החלק היחסי הגבוה כ 1 ס"מ מעל צבע תכלת. השתמש חתכים אנכיים מונחה על ידי בכיסים ואת צבע להפריד בין נתיבים שונים (בדוגמה זו 1-4). השביל סמן (מ ') יכול להיות מוכתם צילמו לשלוטגודל לאחר חיתוך. גדלים שבר מסומנים בצד ימין.

איור 4
איור 4. ניתוח של ה-PCR-הגברה ספריות iCLIP cDNA באמצעות ג'ל אלקטרופורזה. RNA התאושש הקרום (איור 1) היה עיבד הפוך גודל מטוהרים באמצעות ג'ל אלקטרופורזה denaturing (איור 2). שלושה שברים בגודל של cDNA (גבוה [ח]: 120-200 nt, בינוני [ז]: 85-120 nt נמוך [יב]: 70-85 NT) נמצאו, circularized, מחדש לינארית ו-PCR מוגבר. מוצרי ה-PCR של התפלגות גודל שונים ניתן לראות כתוצאה של גדלים שונים של שברים קלט. מאז פריימר PCR מציג 76 NT ל cDNA, גדלים צריך לנוע בין 196-276 nt גבוהה, 161-196 NT עבור בינוני 146-161 NT עבור שברים גודל נמוך. מוצרי ה-PCR נעדרים כאשר אין נוגדן שימש immunoprecipitation (נתיבי 1-3).

Discussion

מאז פרוטוקול iCLIP מכיל מגוון רחב של תגובות אנזימטיות צעדים טיהור, זה לא תמיד קל לזהות בעיה כאשר ניסוי נכשל. כדי לשלוט על סגוליות של זיהו RNA צולבות קישור לאתרים, אחד או יותר שולטת שלילי יש לשמור לאורך כל הניסוי להשלים ומנתח חישובית הבאים. בקרות אלה יכולים להיות המדגם ללא נוגדנים, הלא צולבים תאים או immunoprecipitation מתאי בנוקאאוט או רקמה. באופן אידיאלי, ניסויים אלו השליטה לא צריך לטהר את כל מתחמי חלבון-RNA, ולכן צריך לתת שום אות על ג'ל SDS-PAGE, ואין מוצרים לזיהוי לאחר הגברה PCR. תפוקה גבוהה רצף של ספריות אלה לשלוט צריך לחזור רצפים ייחודיים מעט מאוד. תאים מציאה אינם מומלצים כביקורת ריצוף, שכן רצפים וכתוצאה מכך עדיין מתאימות צולבות קישור לאתרים של אותו חלבון, אשר מטוהרים מתאי מציאה בכמויות קטנות יותר.

אמצעי זהירות צריך גם לנקוט כדי למנוע זיהום עם מוצרי ה-PCR מניסויים קודמים. הדרך הטובה ביותר כדי לצמצם בעיה זו היא מרחבית נפרד צעדים לפני ואחרי-PCR. באופן אידיאלי, הניתוח של מוצרי ה-PCR וכל השלבים הבאים יש לבצע בחדר נפרד. יתר על כן, כל חבר צריך להשתמש במעבדה קובע את buffers ו ריאגנטים אחרים. בדרך זו, מקורות זיהום ניתן לזהות בקלות.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Acknowledgements

המחברים מודים לכל חברי במעבדות Ule, לאסקומב וזופאן לדיון סיוע ניסיוני. אנו מודים ג'יימס Hadfield ואת ניק מתיוס עבור סידור תפוקה גבוהה. ברצוננו לציין כי השיטה המתוארת כאן iCLIP מניות בכמה צעדים עם פרוטוקול CLIP המקורית, שפותחה על ידי ג'נסן קירק ו JU במעבדה של רוברט דרנל. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה האירופית למחקר מענק 206,726-קליפ JU וגם לטווח ארוך גבולות תוכנית אנוש המדע מלגה כדי JK

Materials

Name Company Catalog Number Comments
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell IIâ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
Protein A Dynabeads Invitrogen 10001D use protein G for mouse or goat antibody
RNase I Ambion AM2295 activity can change from batch to batch
T4 RNA ligase I New England Biolabs M0204S
PNK New England Biolabs M0201S
proteinase K Roche Group 03115828001
Superscript III reverse transcriptase Invitrogen 18080044
Circligase II Epicentre Biotechnologies CL9021K
FastDigest® BamHI Fermentas FD0054
AccuPrime™ SuperMix I Invitrogen 12342010 this PCR mix gives the best results in our hands

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
  2. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. RNA. 14, 802-813 (2008).
  3. Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5, 1071-1082 (1999).
  4. Brooks, S. A., Rigby, W. F. Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique. Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).
  5. Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).
  6. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  7. Ule, J. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302, 1212-1215 (2003).
  8. Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37, 376-386 (2005).
  9. Licatalosi, D. D. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456, 464-469 (2008).
  10. Yeo, G. W. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).
  11. Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles. Methods. 26, 170-181 (2002).
  12. König, J. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).

Erratum

Formal Correction: Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution
Posted by JoVE Editors on 07/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to:

"...as well as 2 μl Turbo DNase..."

instead of:

"...as well as 2 ml Turbo DNase..."

Comments

71 Comments

  1. Hi,

    First I would like to say this latest method is really neat. I also like Julian's comment at the end of the video when he said with a big smirk, "You have to perform each of the 64 steps with 100% accuracy". :D That is epic.

    On a more serious note, I am just wondering if anyone can suggest what sort of primer I should use if I want to start by cloning my insert into TOPO vector instead of doing nextGen sequencing. Any help is appreciated.

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2011 - 3:47 AM
  2. Hi Paul, thanks for your fun comment! TOPO cloning dŒsn²17;t require any specific primer, so you could use the one described in the protocol. Unless you wish to do something specific, such as concatemerization of sequences before inserting them into vector. Feel free to post more questions! Jernej

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 11, 2011 - 4:19 PM
  3. For more iCLIP questions and answers, use the following Googledoc: http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 13, 2011 - 11:28 AM
  4. Hi Jernej,
    Is it possible to use a 3' linker with a phosphorylated 5' end instead of a pre-adenylated 5' end and adding some ATP during the 3' linker ligation step? Thanks. Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 13, 2011 - 10:13 PM
  5. Yes, just follow the protocol as described in Konig et al, NSMB ²010 (PMID ²0601959). More on Googledoc.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 14, 2011 - 3:48 AM
  6. Hi Jernej,

    Sorry to keep bombarding you with questions. In the supplementary section of your NSMB ²010 paper, shrimp alkaline phosphatase was used to desphosphorylate 3' ends. My understanding is that SAP can only desphosphorylate 5' ends. I am wondering if you had dephosphorylated 3' ends step using PNK before using SAP to dephosphorylate 5' ends.

    Quote from Konig et al, NSMB ²010: "For dephosphorylation of 3²4²; ends, Dynabeads were resuspended in ² µl 10&#²15; Shrimp alkaline phosphatase buffer (Promega), 17.5 µl H²O and 0.1 µl Shrimp alkaline
    phosphatase (Promega) and incubated at 37°C for 10 min with intermittent shaking (10 sec at 700 rpm followed by ²0 sec pause)."

    Thank you again for your help.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2011 - 4:04 AM
  7. We did use SAP in the NSMB protocol - it dŒsn't work as well as PNK on the 3' ends. We couldn't use PNK at the time, because PNK carryover into ligation reaction would create problems in the presence of ATP. In jove protocol, ligation reaction lacks ATP, therefore we can use PNK to dephosphorylate the 3' ends.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 5, 2011 - 6:30 PM
  8. Hi Jernej,

    On 3.² it says add ²ml Turbo DNAse into the 1.5 ml tube. I am wondering if that amount is correct.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 9, 2011 - 11:45 PM
  9. Hello Paul,
    you are right, it should be two micro liters. Sorry for that, I will try to have it changed,
    Julian

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 10, 2011 - 6:56 AM
  10. Hi Jernej, great protocol! Just a precision, the L3 oligo is a pre-adenylated DNA or RNA oligo? Not clear as the original Clip and iClip uses RNA...

    Thanks a bunch,

    Marco

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 12, 2011 - 3:58 PM
  11. Hi Marco. It's a DNA oligo. Best, Jernej

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 12, 2011 - 4:02 PM
  12. Hi Jernej,

    I am wondering if the 3²P-ATP batch that you normally use in your lab for step 6.1 always has close to a 100% reported radioactivity. What is the lowest percentage of remaining 3²P that you can usually still get away with? I can still get some decent signal when using 3²P-ATP that has ~50-60% remaining radioactivity but my bands on the films are not as intense as the one that I see in your publications. I am trying to work out the best schedule for ordering some 3²P-ATP and starting my experiments. Thanks again.

    Paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 14, 2011 - 11:32 PM
  13. We don't use ATP if it's more than two weeks old, thus we have >50% radioactivity. But signal intensity also depends on the efficiency of crosslinking and IP,and amount of protein expression in the cells.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 15, 2011 - 4:23 AM
  14. Hi Jernej,
    Thank you for the protocol. What results if I reduce the cell samples to 100-1000 (not 10*6-7 cells) ? Thanks for your reply.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 12:24 AM
  15. That would be challenging. If you have an abundant protein that cross-links well to RNA, then it might be possible. So try running the radioactive protein-RNA complex on the gel - if you good signal after overnight exposure, then it's doable.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 4:52 AM
  16. Hi, Jernej !
    Thank you for the reply. I have another questions: How stable if the RNA-RNA and RNA-Protein photocrosslinking? How to degrade these proteins or remove the photocrosslinking? Thank you a lots.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 6:36 AM
  17. Hi Jernej,

    I again have some more questions. Do you still expose the nitrocellulose membrane at -80C when using phosphoimager instead of a film? I'm also wondering what exposure time your lab uses when using a phosphorimager screen.

    Secondly, I am wondering how many libraries containing different barcodes you can run together in a single flow cells.

    Thank you again Jernej. This protocol has been extremely useful.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:49 PM
  18. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  19. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  20. Cross-linking forms a covalent bond, so is irreversible (read the paper!). -80 would ruin the phosphorimager screen, so don't do it! We normally multiplex ±10 libraries.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 15, 2011 - 7:53 PM
  21. Hi Jernej,

    In regards to one of the FAQs from Google docs.

    - When analysing PCR products, I see a band corresponding to the size of primer dimers, especially in the sample that was cut low from cDNA gel.

    Yes, it is common to see this band in the sample that was cut low from cDNA gel, and sometimes also in other samples. This is due to contamination from short cDNAs that only contain the sequence of RT primer. If this primer dimer is the dominant product on gel, we advise against sequencing the corresponding sample.

    I seem to be getting this short cDNA contamination all the time. Do you have any advice on how I could try to minimise the contamination? Have you ever isolated fragments of correct-size cDNA from a TBE-urea gel and sent only the isolated fragment for sequencing when you have short cDNA contaminations? Do you think that will work? I think that the concentration of L3 linker that I had used might have been too much. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2011 - 7:45 PM
  22. There are several possible reasons for this. Maybe one aspect of the protocol is not working, and therefore you are not producing any specific cDNA. If you have no cDNA input, then with enough cycles, you can amplify the primer-primer from any part of the gel. If you are using mammalian cells, try to get the protocol working first with hnRNP C or TIA with Santa cruz antibodies that we used in recent publications. Otherwise, using too much L3 can be a problem.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 23, 2011 - 4:35 AM
  23. Very useful protocol. I have two questions.

    1. For dephosphorylation of RNA 3'ends, pH 6.5 PNK buffer is used, rather than the pH 7.6 buffer, provided by NEB. Have you compared these two conditions internally?
    ². In the protocol, the final PCR product is not isolated and quantitated before submitting for the sequencing. Are there any potential problems of doing these two steps? Can I isolate the PCR product and re-PCR using the same primers to get more product (for Illumina Hiseq)? Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 5, 2012 - 3:40 PM
  24. You can find more related answers in Googledoc http://goo.gl/4tSci, but short answers are also below:

    1. We haven²17;t compared conditions, but increased phophatase activity of PNK at lower pH has been reported in literature, you can read more in the Pubmed ID 1184²1²0.

    ². The PCR product needs to be quantified. We use both qPCR and bioanalyser. Normally, the products of the first PCR should look clean on the gel, otherwise it is a sign of a library that is of low complexity, and is unlikely to generate informative data. Therefore we advise against re-PCR, but it can be done as the last resource.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 5, 2012 - 4:56 PM
  25. Hi Jernej,

    I noticed you use +/- 10 multiplexed libraries; I was wondering if you knew how many are necessary for a successful run (i.e. to provide sufficient distribution for cluster identification)?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 2:20 PM
  26. The way the primers are designed here, no multiplexing is necessary, because the first three nucleotides in the primer sequence are random (part of randomer = NNN).

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 29, 2012 - 2:28 PM
  27. I appreciate your experiment. I have some qeustions.

    In this protocol, what dŒs barcode do high-throughout squencing?

    I don't understand function of barcode



    Reply
    Posted by: seung kuk P.
    May 23, 2012 - 6:45 AM
  28. Hi,
    this might be a really naive question but I'm wondering at the UV cross linking step, when you say you irradiate once, dŒ's this mean 1 min?

    Thank you!
    Zsofi

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    June 18, 2012 - 1:19 PM
  29. Hello, Thank you for this helpful technique, I just have a question. My experiments protocols are: 1. UV-crosslink RNA-protein; ². Isolate the RNA-protein complex by immunopricitation; 3. Isolate the binding RNA. 3²P-labeling the binding RNA. 4. Analysis the RNA by microarray.
    Because I do not need to sequence the RNA, and I only want to isolate the binding RNA for microarray analysis after UV-crosslink RNA-protein, so I wonder whether I need to do the step 5-7 in your protocols or I could skip from step 4 to step 8 in your protocol?

    Thanks very much, I look forward to your kind reply!

    Sean

    Reply
    Posted by: xiaoyun w.
    July 22, 2012 - 9:09 PM
  30. It is unlikely you will have enough cDNA for microarray hybridisation without some kind of amplification. You can try using steps 4-8, but you could also amplify in other ways.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 23, 2012 - 6:03 AM
  31. Hi Jernej,

    Is there any published article on how to analyse iCLIP's high-throughput sequencing data? I have just got my sequencing results back following steps in your protocol. I want to make sure I check with you before digging into the data. Thank you.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 1, 2012 - 10:15 PM
  32. The article is not yet published, but is in preparation by Tomaz Curk ( http://www.fri.uni-lj.si/en/tomaz-curk/), who made a public server: http://icount.biolab.si/. You can contact Tomaz at tomaz.curk@fri.uni-lj.si for more information.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 2, 2012 - 5:47 AM
  33. Hi,
    it is so powerful technique! But I cannot IP any protein follow protocol. Is there any difference in affinity between different antibodies and their antigen? Could you give me some advice? Maybe we could decrease concentration of SDS or sodium deoxycholate?
    Thanks, I look forward to your kind reply!
    Min

    Reply
    Posted by: Min S.
    August 5, 2012 - 11:04 PM
  34. Hi Min, you can find advice on IP googledoc http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2012 - 3:35 AM
  35. Hi Jernej,

    With the barcoding system, I am just wondering if the three random nucleotides are there for indexing purpose during Illumina sequencing run but it's not necessary for splitting the different libraries later on. For RC1, the sequencing results will be something like NNNGGTTNN.... During analysis, do you usually trim the 3-bp from the 5'-end of the results and split the different replicates after the trimming step? I have just realised this was slightly different to the barcoding system used in your NSMB paper. -paul

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 6, 2012 - 9:41 PM
  36. Hi Paul! You can find the answer under the topic of "Use of random barcode in data analysis" in http://goo.gl/4tSci.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 7, 2012 - 7:58 AM
  37. Hi Jernej,

    I started optimising CLIP couple of months ago and I'm at the stage that I'm convinced that I can efficiently cross link RNA to my protein (checked it by specific qRT PCR). I'm lucky because I don't need to fiddle with the IP since I've optimised before and works fine. But just to double check, after IP and western blotting a smear and a lower amount of original kDa protein is a good sing for cross linking yes?
    So my problems started at the RNase A step, I don't see any changes in size/appearance on WB after treatment... I'm convinced that my protein creates a massive complex (couple of 100 kDa) and it is because my target RNA is 10 kb to start with and there are at least 3 proteins binding to it. I'm working with a RNA virus, that's the explanation for it. I think the reason I don't see any change in kDA is because the complex dŒsn't even enter the gel to start up with. Although I used the given buffer which should break any membrane apart but the proteins are still there possibly protecting the RNA. Did you ever come across similar problems and would you have any suggestions? Also, I understand that the RNase trimming is necessary for the efficient RT step but is it a problem if the RNA is too long? What is too long? DŒs this depend on the RT enzyme used I recon or is this also important for the sequencing?

    I would greatly appreciate yur help because I'm stuck...

    Thank you,
    Zsofi

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    October 10, 2012 - 7:38 AM
  38. Hi Zsofi,

    For partial RNAse digestion we use RNase I (step 3). We use two different concentrations: a lower one that makes fragments with a mean between 50-100 bp and a higher concentration that fragments RNA to around 10bp. The lower one is used for preparing libraries, the higher one is used for analytical reasons.

    The RNAse step is important to (1) allow the protein RNA complex enter the Gel (²) to narrow down the crosslink site to a fragment with a size compatible with high throughput sequencing (maximum around 300 bp). So you definitely need to optimize this step for your experiments.

    If the complex you are studying is not covalently linked it should fall apart during the denaturing Gel run. Only a small fraction of your complex will have all the proteins of your complex crosslinked to the RNA at the same time since crosslinking is a very inefficient step. Therefore with the higher RNAse concentration you should be able to see a radioactive signal at the size of the protein you are studying.

    I hope that helps, best regards,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    October 11, 2012 - 9:49 AM
  39. Hi Julian,

    I have had some trouble with the RNase step when nuclease-ing the total lysate... In my troubleshooting efforts I read that RNase I is inhibited by 0.1% SDS, which is the concentration used in your lysis buffer. It dŒsn't seem that you guys have any problem though...do you think this is due to using an excess of RNase I or what? Just curiously confused. Thanks,

    sam

    Reply
    Posted by: Sam F.
    February 5, 2013 - 6:00 PM
  40. Hi Sam,

    in our experience the inhibition of RNase I by SDS is not an issue. You just optimize the concentration of RNase I to obtain the desired fragmentation. If you have problems doing that with your buffer conditions, you could also do the RNase digestion on the beads instead of in the lysate.

    Best,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 6, 2013 - 6:19 AM
  41. Thanks for the quick reply Julian. Your recommendation to do the "on bead" digestion is exactly what I have done and it seems to be working fine. Cheers

    Posted by: Sam F.
    February 6, 2013 - 10:12 AM
  42. Hi,

    I was wondering how many minutes have you irradiated the cells in case of HNRNP C?

    Reply
    Posted by: Niaz M.
    November 26, 2012 - 6:29 PM
  43. Hi Niaz,
    we are normally not measuring time of irradiation but the Energy per square centimeter:
    Step 1.²: ... Irradiate once with 150 mJ/cm² at ²54 nm.
    In our Stratalinker this takes 50s. However time of irradiation is not very informative here since it changes with the age or quality of the lamps, etc.
    Cheers, Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    November 27, 2012 - 6:20 AM
  44. Hi,

    Thank you for wonderful protocol !

    I would like to confirm about adaptor and primer sequences.
    1. L3 adaptor and Rclip RT primer has ²²0;same²²1; sequences, not ²²0;complementary²²1; sequences. Are they O.K.? In my understanding, L3 and TR primers should have ²²0;complementary sequences.
    ². P3 Solexa 3²17; 11 nt sequence (TCTTCCGATCT) looks ²²0;extra²²1;. Both of P5 and P3 have the same sequence, which is complementary to Rclip RT primer or L3 adaptor. I think only P5 should have this sequence.

    Thank you for your help.

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 3:04 AM
  45. Hi,

    Thank you for wonderful protocol !

    I would like to confirm about adaptor and primer sequences.
    1. L3 adaptor and Rclip RT primer has ²²0;same²²1; sequences, not ²²0;complementary²²1; sequences. Are they O.K.? In my understanding, L3 and TR primers should have ²²0;complementary sequences.
    ². P3 Solexa 3²17; 11 nt sequence (TCTTCCGATCT) looks ²²0;extra²²1;. Both of P5 and P3 have the same sequence, which is complementary to Rclip RT primer or L3 adaptor. I think only P5 should have this sequence.

    Thank you for your help.

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 3:04 AM
  46. Hi Lisa,

    it is correct that the ends of P3 and P5 primers are the same. This is because of Illumina's primer design for their high throughput sequencing platform. When you look at the 3' end of the Rclip primers (after the Bamhi cleavage site) you can see that they are actually complementary to the 3'end of the L3 adapter.

    Cheers,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    December 18, 2012 - 10:05 AM
  47. I got it !!!
    Thank you :)

    Best,
    Lisa

    Reply
    Posted by: Risa K.
    December 18, 2012 - 1:11 PM
  48. Hi
    Thanks for the protocol. I have one question that has been bothering me, though. Both the RNA ligase and PNK buffers will expose the antibody column to relatively high dithiothreitol (DTT) concentrations (10 mM and 5 mM respectively). Why dŒsn't this destroy the column by reducing the disulphide bonds holding the heavy and light antibody chains together? Have you ever tried to improve the immunoprecipitation step by attempting to minimize the DTT concentration as much as possible or is this not an issue. Any assistance would be greatly appreciated. Thanks - Greg

    Reply
    Posted by: Greg C.
    February 3, 2013 - 2:13 PM
  49. Hi Greg, we haven't seen an effect of the DTT in the buffers on the IP efficiency, it seems that the concentration is not high enough to reduce the IgG - however, it is worth testing this the first time you do IP, since it is plausible that this will vary dependent on the source of your buffers (company used for PNK and ligase), or antibodies.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2013 - 2:45 AM
  50. Hi Jernej,
    Thanks for the reply. The antibody I am using is definitely sensitive to the level of DTT found in the PNK buffer and I need to limit the over-all exposure of the column to DTT as much as possible. As a result, rather than using PNK as the 3' phosphatase, I would like to use an alkaline phosphatase. I noticed that in your ²010 NSMB paper you are using Shrimp Alkaline Phosphatase and in your ²009 Methods paper you use FAST AP. Did you find that the Shrimp phosphatase is significantly better ?

    Thanks again - Greg

    Reply
    Posted by: Greg C.
    February 8, 2013 - 3:52 PM
  51. Hi Greg, we don't have any evidence to suggest that one is better than the other for the on-bead reaction. At the time we were using SAP in the lab generally since it can be heat-inactivated, so therefore we also used it for on-bead (even though here you can't heat-inactivate it on beads). So you can go ahead with either one.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2013 - 5:29 AM
  52. I should also add that even though we didn't compare FAST AP and SAP, we did compare SAP with PNK, and we had a lot better results with PNK. It seems that SAP is not efficient as a 3' phosphatase. So it may be better for you to determine the minimal DTT amount in the buffer that is compatible with your antibody, and then continue using it with PNK and ligase. If you use fresh DTT, 1mM is likely to be sufficient both for PNK and RNA ligase.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 9, 2013 - 5:39 AM
  53. Thanks, I really appreciate the advice.
    -Greg

    Posted by: Greg C.
    February 9, 2013 - 9:03 AM
  54. Hi, thanks for the awesome video. I have two questions related to the reagents:
    1. What concentration is the PEG400? (it only says 4 ul in the protocol).
    ². Under "Reverse transcription", step 6, what is the pH of the TE buffer you use? Is it pH 8?
    Thank you very much for your help. -QT

    Reply
    Posted by: Qiumin T.
    February 7, 2013 - 1:22 PM
  55. Hi QT,
    (1) we are using PEG400 from Sigma (²0²398). It is a viscous liquid.
    (²) Yes, the it is pH 8
    Cheers, Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 7, 2013 - 4:56 PM
  56. Thank you so much Julian. I have another question. Could you recommend a protocol for doing iCLIP with mouse brain tissue? Do you know whether the tissue prep steps from this protocol ( http://ago.rockefeller.edu/Ago_HITS_CLIP_Protocol_June_²009.pdf) will work well for iCLIP as well?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 13, 2013 - 5:52 PM
  57. This protocol should be fine. We also recently published a bookchapter about the iCLIP protocol which contains information on tissue samples and lots of other useful info and background:
    http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.100²/97835²764458².ch10/summary

    Reply
    Posted by: Julian K.
    February 14, 2013 - 5:19 AM
  58. The pre-publication version of the book chapter is available here: http://www².mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/jule/publications/Konig_wiley.pdf.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 19, 2013 - 1:54 PM
  59. I enjoyed reading about your updated iCLIP protocol in the book Tag-based Next Generation Sequencing from Wiley. I would be grateful for more details about the amount and activity of the 3²-P that you use to radioalabel the RNA. In both the book chapter and the JoVE article I see only volumes, not activities.

    In the figure for step 9, the radiolabel on the 5' end of the RNA is missing, but shouldn't it still be there? At what point in the protocol can we be reasonably sure that we are dealing with unlabeled material?

    Also, have you ever explored non-radioactive approaches to labeling, or is the sensitivity of these methods too low for the purposes of this protocol?

    Thanks!

    John

    Reply
    Posted by: John S.
    June 17, 2013 - 9:23 AM
  60. Dear John,

    with the current protocol most of the radioactivity is gone after the gel purification of the cDNA. You can increase this effect by treating the samples with RNAse after the reverse transcription (The radioactive RNA fragments then running much faster then the cDNAs in the gel). We are currently working on a protocol where we fragment the RNA by alkaline hydrolysis, which will be available soon (We want to avoid using too much RNAse at our desks).

    In addition you should always measure your samples with a Geiger counter. If your final PCRs are still hot, then you should decrease the fraction of beads that go into the labeling reaction.

    Best wishes,
    Julian

    Reply
    Posted by: Julian K.
    June 19, 2013 - 11:52 AM
  61. Hi,
    I have a question which relies on your experience with the data generated with CLIP:
    because of the UV irradiation the protein crosslinks to the RNA which even after proteinase K treatment presents an obstruction to the reverse transcriptase which therefore either skips or adds random nucleotide(s). So my question is that how long the deletions/insertions can be? Is it only one nucleotide or can also be 20?

    Thank you very much!!!

    Reply
    Posted by: Zsofia I.
    August 8, 2013 - 12:06 PM
  62. We see that >80% of cDNAs truncate at the crosslink site, and the mutations are quite rare in the remaining sequences. All we know about crosslink-induced mutations has been published here: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22863408.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 8, 2013 - 12:15 PM
  63. Thanks for your protocol. I have a question about the IgG background signal in the p32 labeled Western Blot. I used mouse IgG1 isotype as a control. I did not crosslink the IgG to the beads, so IgG1 stays around 50 and 25 KDa region. I do observe some radioactivity band around 50 kDa. Do you notice this in your experiments as well? Since it is close to my protein region, can you give me some suggestions to avoid this?

    Sincerely,
    Mei

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 9, 2013 - 1:42 PM
  64. We don't get a signal in control IP. Most likely this is an RBP that non-specifically binds under your conditions. It is important to wash with high-salt buffer, and rotate the tubes for ±5min during these washes. Also, diluting the lysate before IP may help. Standard IP optimisations, basically.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2013 - 2:24 PM
  65. Hi,
    Thank you for wonderful protocol.
    Usually how much RNA concentration one should get after Isolation from membrane? I would appreciate your reply.

    Reply
    Posted by: Bhagya B.
    August 13, 2013 - 5:29 AM
  66. Hi,
    Thank you for wonderful protocol.
    Usually how much RNA concentration one should get after Isolation from membrane? I would appreciate your reply.

    Reply
    Posted by: Bhagya B.
    August 13, 2013 - 5:57 AM
  67. Hi,
    I have 2 more questions. In this protocol you did not remove 5' phosphate of the RNA, can you still label the 5' side with P32 by PNK later? Another question, is it possible to just p32 label the RNA, cut the band, extract, degrade the protein and add 3' linker for RT later?

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 21, 2013 - 2:06 PM
  68. Normal PNK has phosphatase activity, so it can replace the 5' phosphate. The original CLIP protocol from Ule et al, Science 2003 added 3' linker after RNA extraction, but as explained in Ule et al, Methods 2005., the efficiency and purity of the protocol increases if linker is ligated on beads.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 21, 2013 - 2:15 PM
  69. Thanks for this amazing protocol and your rapid and very helpful exchange here in this site.

    Reply
    Posted by: Xuemei Z.
    August 21, 2013 - 2:26 PM
  70. Hello, thank you for this wonderful protocol.
    I have a question:
    -I get positive Radioactive signal at the right size of positive CTRL used in this protocol in the NOT UV samples, it looks exactly as I was using high RNAse condition. why?
    I am phosphorylating the protein? is it possible?
    thank you

    Reply
    Posted by: jessica c.
    February 27, 2016 - 8:45 PM
  71. Hi Jessica, you are right, if you see signal in the non-UV control, this means that the protein is getting phosphorylated in some other way. If it has a kinase domain it may even phosphorylate itself. Or maybe some kinase is getting co-purified? You could check for this by omitting PNK from the phosphorylation reaction.

    Reply
    Posted by: Jernej U.
    March 16, 2016 - 11:07 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics