使用微量的生物规格的纳米分光光度计核酸和蛋白的浓度测定

Published 2/17/2011
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Biology
 

Summary

这种沟通的BioSpec纳米的紫外 - 可见分光光度计双链DNA和蛋白质定量的准确性和可重复性的数据。即使与超小卷(1〜2 L),重现性优良,自动擦拭功能,同时可以提高吞吐量和更精确的结果最小结转结果。

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Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699, doi:10.3791/2699 (2011).

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Abstract

在过去三十年,拥有先进的核酸定量程序明显。越来越多,分子生物学家需要小批量的分析,他们的实验中核酸样品一致。 BioSpec纳米不准确的,非重复性的结果,在当前的DNA定量方法所固有的,通过专门的光学和一个敏感的PDA检测器的问题提供了一个潜在的解决方案。 BioSpec - nano还具有自动化功能,例如,安装,测量和清洁仪器,从而省去繁琐,重复和不一致的光纤元素和手工清洗的位置。

在这项研究中,DNA和蛋白质,以及测量的可重复性和准确性的量化数据呈现。自动样品接触和快速扫描可以在三秒钟内测量,造成出色的吞吐量。使用该软件的内置功能进行数据分析。用于计算DNA浓度的计算公式为:

样品的浓度= DF(OD260 - OD320)·农协(1)

凡DF =样品稀释倍数和农协=核酸浓度的因素。

按照选定1待测核酸浓度的因素。

可以表示为μg/ mL的蛋白浓度结果或进入E280和分子量值分别为痣/大号。当在e280Calc选项卡中输入的酪氨酸,色氨酸和半胱氨酸(二硫键)的残留值,消光系数的计算值作为E280 = 5500 ×(Trp残基)+ 1490 ×(Tyr残基)+ 125 ×(半胱氨酸二硫键) 。 E280的价值是用浓度计算软件。

BioSpec纳米除核酸和蛋白质浓度测定,可用于许多其他分析超微量分光光度计,或用5毫米光程细胞作为一个标准的分光光度计。

Protocol

1。 DNA定量的程序

  1. 打开仪器。
  2. BioSpec纳米软件从PC桌面上打开。
  3. 点击简单核酸双链DNA标签(图1)。
  4. 该软件将建立与仪器的通信和运行初始化序列。这验证,该仪器是按规范进行。
  5. 选择0.7或0.2毫米的光程滑块。这种选择的光程,所有的计算都基于所选择的路径长度。
  6. BioSpec纳米软件,请点击设置Autowiping设置下一步。选择1或2。
  7. 加入2μL(0.7毫米)H 2 O或底座上的缓冲区。
  8. 点击空白的空白测量或F6。每次选择一个新的光程是要记录一个空白。
  9. 加入2μL的样品基座上。
  10. 单击“开始在软件或按下仪器上的启动按钮。上面的窗口移动,使样品液滴的接触。氙弧灯可以观察到。
  11. 同一样品重复3次,以确定可重复性。
  12. 所有的数据记录保存。芽文件。
  13. 要保存为PDF或CSV文件。,单击“保存PDF / CSV或F9键。结果也可以保存为。csv文件,使用适当的选择“保存”选项卡。

2。蛋白质定量议定书“

  1. 选择蛋白定量选项卡(图2)。
  2. 输入消光系数E280,如果知道的话。
  3. 如果不知道E280计算使用e280Calc。
  4. 选择0.7或0.2毫米的光程滑块。
  5. 点击安装Autowiping设置。选择2个或以上。
  6. 移取3μL(0.2毫米)H 2 O或底座上的缓冲。
  7. 点击空白的空白测量或F6。
  8. 移取3μL蛋白质样品基座。
  9. 单击“开始在软件或按下仪器上的启动按钮。
  10. 同一样品重复3次,以确定可重复性。
  11. 记录所有的数据将被保存为。芽文件
  12. 要保存为PDF或CSV文件。,单击“保存PDF / CSV或F9键。

3。代表性的成果:

1。 DNA定量结果

图3显示了一个典型的双链DNA样本的测量数据。也显示浓度和OD 260/280比值计算。图4包含DNA定量的测试结果的重复性。在图3和图4显示了结果的数据是非常明显低的相对标准偏差为0.26%重复性。

注1:

DNA定量不准确,可能会出现缓冲液成分的存在,这可能在紫外区的吸收。也有必要使用一个同质的样品溶液。由于吸管样本量只有1-2微升,准确卷小心吹打没有出台任何气泡是必需的。

2。蛋白质定量结果

图5表示蛋白质BSA浓度的分析。 μg/ mL的蛋白浓度是基于E280价值。图6显示了可重复性的分析。 BioSpec纳米措施浓度精确 - 不仅对DNA也为蛋白质,这是显而易见的,相对标准偏差为0.51%的。

注2:蛋白质浓度的影响因素

精确的蛋白浓度测定是可行的,当有不稳定的最低pH值,缓冲液,温度,或添加剂造成的影​​响。大多数纯化的蛋白质经过加工的各个步骤,因此它是可能的,该蛋白可能包含表面活性剂或其他添加剂,可能会干扰与液滴的形成。对于这样的样品,用5毫米光程的石英细胞是强烈建议。

图1
图1双链DNA定量的分析物的选择窗口。

图2
图2分析物非标记的蛋白质定量选择窗口。

图3
DNA定量有代表性的数据图3。

图4
图4。重复性DNA定量数据

图5
蛋白质定量的有代表性的数据图5

“图6”/> 图6。蛋白质定量的重复性数据

Discussion

BioSpec -纳米经过精心设计,以解决目前在DNA定量方法的固有问题,如不一致的结果和繁琐的手工劳动,。每次测量只需3秒,让经验丰富的分子生物学家分析多个样品约3-6分钟。独特的雨刮器功能,不仅提高了测量的吞吐量,同时也消除了手工清洗基座的需要,造成测量之间可以忽略不计结转。此外,测试使用的DNA样本包含1000纳克/μL仅2湿巾,表示结转小于2纳克/μL。

一个5毫米的光程细胞的可用性提供了一个选项分析稀核酸和蛋白样品,并扩展其他应用程序使用此仪器。

Disclosures

Suja Sukumaran,博士是谁在这篇文章中精选仪器日本岛津公司的雇员。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioSpec-nano Shimadzu Corporation
Calf Thymus DNA Sigma-Aldrich
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich

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References

  1. Aisubel, F. Short Protocols in Molecular Biology. 4th edition, WILEY. (1999).
  2. Pace, C. N. How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science. 4, 2411-2423 Forthcoming.

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5 Comments

  1. COULD YOU PLEASE TELL ME HOW TO MEASURE MOLAR ABSORPTION CŒFFICIENT OF PARTICULAR COMPOUND?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 20, 2011 - 5:53 AM
  2. COULD YOU PLEASE TELL ME HOW TO MEASURE MOLAR ABSORPTION CŒFFICIENT OF PARTICULAR COMPOUND?

    CAN I GET SOFTWARE OF SCHIMADZU UV-1800 SPECTROPHOTMETER FOR MY PC?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 20, 2011 - 5:55 AM
  3. We would be happy to help you with your question(s). Can you e-mail me your full contact info so I can direct you to the appropriate Shimadzu office? Kevin, kgmclaughlin@shimadzu.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    July 20, 2011 - 9:21 AM
  4. can u please tell me what is the price of the Shimadzu UV spectrophotometer?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2011 - 11:00 AM
  5. Dear Israr: Happy to help. Please send me your full contact information so I can have the appropriate person from Shimadzu contact you. Regards, Kevin, kgmclaughlin@shimadzu.com

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 10, 2011 - 12:52 PM

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