Electrolítico de la vena cava inferior del modelo (EIM) de la Trombosis Venosa

Medicine
 

Summary

La inducción electrolítica de activación endotelial en la superficie interna de la vena cava inferior resultados en la formación de un trombo venoso tipo debido a la activación endotelial y parcial de la estasis sanguínea, dos componentes de la tríada de Virchow.

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Diaz, J. A., Wrobleski, S. K., Hawley, A. E., Lucchesi, B. R., Wakefield, T. W., Myers, Jr., D. D. Electrolytic Inferior Vena Cava Model (EIM) of Venous Thrombosis. J. Vis. Exp. (53), e2737, doi:10.3791/2737 (2011).

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Abstract

Los modelos animales juegan un papel vital en la trombosis venosa profunda (TVP) de investigación para estudiar la formación de trombos resolución del trombo y para probar potenciales compuestos terapéuticos (1). Nuevos compuestos para ser utilizados en el tratamiento y prevención de la TVP se están desarrollando actualmente. La entrega de compuestos con potencial terapéutico para un antagonista de la vena trombosada afectados ha sido problemático. En el contexto de las aplicaciones terapéuticas, un modelo que utiliza parcial estasis y constantemente genera trombos dentro de una vena principal ha sido creado recientemente. El electrolítico de vena cava inferior del modelo (EIM) es el modelo de ratón de la trombosis venosa profunda, que permite la formación de trombos en la presencia de flujo continuo de sangre. Este modelo permite a los agentes terapéuticos para estar en contacto con el trombo de una forma dinámica, y es más sensible que otros modelos de trombosis venosa profunda (1). Además, este modelo de trombosis simula situaciones clínicas de la formación de trombos y es ideal para estudiar la activación de las células endoteliales venosas, la migración de leucocitos, la trombogénesis venosa, y para probar las aplicaciones terapéuticas (1). El modelo de EIM es técnicamente simple, fácilmente reproducible, consistente crea tamaños de trombos y permite una amplia muestra (es decir, los trombos y pared de la vena) que se requiere para fines de análisis.

Protocol

1. Procedimientos de ratón anestesia

  1. Los animales son extraídas de su jaula y se colocan en una cámara de inducción de la anestesia antes de la operación para la inducción de gas en el 2% de isoflurano y oxígeno al 100%, con un caudal de 0,5 litros por minuto (vaporizador controlada).
  2. Los ratones son sedados en la cámara de inducción de la anestesia, se retiran de la cámara y la parte ventral del abdomen se afeita con una maquinilla eléctrica, o mantenerse dentro de la cámara si es una crema depilatoria el cabello se utiliza (1 min).
  3. Si bien todavía bajo sedación, se pesan, los ojos están lubricados con ungüento oftálmico estéril y, a continuación, coloca en recumbancy dorsal en un dispositivo de calentamiento de agua caliente que circula bajo anestesia general con un cono de la nariz con isoflurano y oxígeno. En este punto, la tasa de oxígeno se reduce a 0,2 litros por minuto.
  4. El abdomen se rocía con una solución de clorhexidina (diacetato de clorhexidina es rápidamente bacterialcidal y persistente) y se limpió con una gasa estéril tres veces o hasta que el sitio quirúrgico está limpio.

2. Ratón Micro-quirúrgicos y procedimientos de recuperación

  1. Una incisión de línea media ventral (2 cm) se realiza con unas tijeras iris a través de la piel y la pared abdominal exponer el abdomen. Una solución salina estéril 2x2 empapado en una gasa se utiliza para reflejar los intestinos al lado izquierdo del animal. Una inmovilización del ratón se pone en la visualización lugar en que se de la vena cava inferior (VCI).
  2. En este punto, el isoflurano se reduce a un nivel de mantenimiento del 2% y la tasa de oxígeno se mantiene en 0,2 litros por minuto para el resto de la intervención quirúrgica.
  3. Disección roma se facilita con un hisopo aplicador estéril y extra pinzas delicadas medio del iris curva de tejidos. Se debe tener cuidado en la manipulación de los tejidos del ratón para que son extremadamente frágiles.
  4. Todas las ramas laterales IVC, a partir de las venas renales hasta la bifurcación ilíaca, se ligan con sutura de prolene 7-0 no reactivo. Ramas de nuevo quedó patente.
  5. En el modelo electrolítico IVC (EIM), un 25G aguja de acero inoxidable, unido a un cable de cobre recubierto de plata (KY-30-1-GRN, Electrospec, Dover, Nueva Jersey) se inserta en la vena cava inferior expuestos caudal, (Figura 1) y se coloca contra la pared anterior (ánodo).
  6. Otro cable se implanta subcutáneamente completando el circuito (cátodo).
  7. Una corriente de 250 μAmps más de 15 minutos se aplicó mediante un estimulador Grass S48 onda cuadrada y una unidad de corriente constante (Tecnologías de la hierba, un Astro-Med, Inc., West Warwick, RI). Los resultados directos actuales en la formación de productos tóxicos de la electrólisis que erosionan la superficie endotelial de la vena cava inferior la promoción de un ambiente trombogénico y posterior formación de trombos.
  8. Después de 15 minutos, se retira la aguja y un hisopo de algodón se realiza con suavidad en contacto con el área para prevenir el sangrado
  9. En los animales sham, se coloca la aguja en la vena cava inferior y luego se retira, sin la aplicación de la corriente.
  10. El sitio de la laparotomía se cierra en forma de dos capas. Nuestro laboratorio utiliza Vicryl 5-0, una sutura sintética, en un patrón continuo para cerrar la pared abdominal. Pegamento pegamento de la piel se utiliza para cerrar la piel. No hay puntos de sutura externos para su eliminación.
  11. Ratones después se recuperan en una jaula de ratones individuales, observado de cerca después de la operación (45 minutos a 2 horas), bajo una lámpara de calentamiento (distancia min 24 pulgadas de distancia de la jaula), y luego regresaron a sus viviendas originales. Medicamentos para el dolor y agentes anti-inflamatorios no se puede utilizar si no interfiere con el objetivo de este estudio. Justificación científica para suspender medicamentos para el dolor, veterinarios, y la aprobación ICUCA se necesitan. Nuestro laboratorio ha descubierto que la buprenorfina ,0.05-0 0,1 mg / kg vía subcutánea es un analgésico excelente pre-y post-operatorios para los ratones. Además, la lidocaína en 4mg/kg (0,4 ml / kg de una solución al 1%) puede ser infundida en el sitio de la incisión, cuando analgésicos sistémicos pueden confundir los resultados experimentales.
  12. Por lo general no la experiencia post-operatorio efectos adversos debido a la trombosis venosa profunda. Sin embargo, los efectos adversos post-operatorio efectos pueden incluir la muerte espontánea de anestesia, la pérdida quirúrgica de sangre, y la parálisis parcial debido a un traumatismo del nervio. Los animales que son de lenta recuperación se puede alimentar la nutria o gel húmedo comida colocados en el suelo de la jaula para facilitar la recuperación del animal. Los animales con cortar las complicaciones postoperatorias deberían ser sacrificados evitando la eutanasia.
  13. En el punto en el tiempo asignado, la eutanasia se lleva a cabo humanamente de acuerdo con las recomendaciones establecidas por la American Veterinary Medical Association Directrices sobre la eutanasia para los roedores.

3. Resultados representante

La EIM es un modelo que se forma un trombo en la presencia de flujo continuo de sangre. Las siguientes figuras muestran los parámetros investigados en este nuevo modelo.

Figura 1
Figura 1 definesthe área anatómica en donde un 25G de acero inoxidableaguja, conectada a un cable de cobre recubierto de plata (KY-30-1-GRN, Electrospec, Dover, Nueva Jersey) se inserta. Tenga en cuenta que un nodo linfático es casi presente y ayuda como punto de referencia para encontrar el caudal IVC.

Figura 2
Figura 2: El peso del trombo 2 días después de la EIM en las diferentes cepas. Como era de esperar, el peso del trombo fue menor en el PAI-1 ratones KO y mayor en los ratones de hipercoagulabilidad Delta CT (CT ^).

Figura 3
Figura 3: P-selectina soluble, un fabricante de trombosis venosa profunda, se midió en diferentes cepas. Los niveles más bajos se encontraron en el PAI-1, mientras que los ratones KO los niveles más altos se encontraron en ratones de hipercoagulabilidad delta CT.

Figura 4
Figura 4 Correlación entre el peso del trombo y P-selectina soluble se encuentra en las diferentes cepas. Es de destacar que en el grupo que generó el menor tamaño del trombo, la P-selectina soluble detectada fue la más baja (PAI-1 ratones KO). En el grupo que generó el mayor tamaño del trombo, la P-selectina soluble detectada fue la más alta (hipercoagulabilidad CT delta).

Figura 5
Figura 5: Con el fin de demostrar la presencia de flujo de la sangre, la ecografía se realizó en ratones sometidos a la EIM. Figura 5 se muestra la ecografía realizada en un ratón de 2 días después de la EIM. A continuación, la muestra fue la cosecha. Tenga en cuenta que la forma del trombo sugieren la formación de trombos en la presencia de flujo

Discussion

El ratón es una excelente herramienta de investigación para experimentos in vivo. Por lo tanto, el desarrollo de modelos de ratón que imitan las enfermedades o estados patológicos son necesarios. Varios modelos de ratón trombosis venosa se han utilizado para estudiar la TVP, incluyendo: fotoquímica (2), la estasis (3-4) y el trauma mecánico (5-6). Sin embargo, ninguno de estos modelos utilizan un estímulo endotelial interno para generar un trombo en la presencia de flujo continuo de sangre. La EIM, utilizando estímulos electrolítico en el IVC, promueve la trombogénesis venosa por activación endotelial en la presencia de flujo sanguíneo (1). Técnicamente es simple, fácilmente reproducible y tiene una alta tasa de supervivencia (99%). A pesar del hecho de que una corriente eléctrica se utiliza para crear la electrólisis, no se genera calor (1). El modelo simula EIM TVP clínica, y por lo tanto sirve como una herramienta valiosa para el estudio de los mecanismos intrínsecos de la formación de trombos y la resolución. El modelo de EIM es también útil para la promoción de nuevos enfoques terapéuticos contra la enfermedad trombosis.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Apoyado por el NIH 1P01HL089407-01A1 (Lawrence, PI), Animal núcleo A, NIH 1 K01-01A2 HL080962 (Myers, PI).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen ABCD1234

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References

  1. Diaz, J. A., Hawley, A. E., Alvarado, C. M. Thrombogenesis with continuous blood flow in the inferior vena cava. A novel mouse model. Thromb Haemost. 104, 366-375 (2010).
  2. Eitzman, D. T., Westrick, R. J., Nabel, E. G. Plasminogen activator inhibitor-1 and vitronectin promote vascular thrombosis in mice. Blood. 95, 577-580 (2000).
  3. Myers, D., Farris, D., Hawley, A. Selectins influence thrombosis in a mouse model of experimental deep venous thrombosis. J Surg Res. 108, 212-221 (2002).
  4. Myers, D. D., Hawley, A. E., Farris, D. M. P-selectin and leukocyte microparticles are associated with venous thrombogenesis. J Vasc Surg. 38, 1075-1089 (2003).
  5. Pierangeli, S. S., Barker, J. H., Stikovac, D. Effect of human IgG antiphospholipid antibodies on an in vivo thrombosis model in mice. Thromb Haemost. 71, 670-674 (1994).
  6. Pierangeli, S. S., Liu, X. W., Barker, J. H. Induction of thrombosis in a mouse model by IgG, IgM and IgA immunoglobulins from patients with the antiphospholipid syndrome. Thromb Haemost. 74, 1361-1367 (1995).

Comments

2 Comments

  1. "After 15 minutes, the needle is removed and a cotton swab is held gently in contact with the area to prevent bleeding. "
    How about bleeding in the PAI mice group?

    In sham animals, the needle is placed into the IVC and then removed, without application of the current.
    How many minutes keep the needle in IVC?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 3:19 PM
  2. No bleeding was observed in PAI-1 KO mice.
    In order to mimic the experimental group, a needle was placed within the IVC for 15 minutes, without current administration in shams.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 4, 2011 - 3:48 PM

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