Multiplex PCR y Blot Línea ensayo de hibridación reversa (MPCR / RLB)

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Summary

Un método de bajo costo, de alto rendimiento para la detección simultánea de hasta 43 blancos moleculares se describe. Las solicitudes de MPCR / RLB son la tipificación de microorganismos y la detección de múltiples patógenos de muestras clínicas.

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O'Sullivan, M. V. N., Zhou, F., Sintchenko, V., Kong, F., Gilbert, G. L. Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB). J. Vis. Exp. (54), e2781, doi:10.3791/2781 (2011).

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Abstract

Multiplex PCR / ensayo de línea inversa Blot hibridación permite la detección de hasta 43 blancos moleculares en 43 muestras con un multiplex PCR seguida de hibridación de la sonda en una membrana de nylon, que es re-utilizable. Las sondas son 5 'amina modificado para permitir la fijación de la membrana. Los iniciadores son 5 'con biotina modificado que permite la detección de hibridación productos PCR utilizando estreptavidina-peroxidasa y un sustrato quimioluminiscente a través de la película fotosensible. Con una configuración de baja y los costos de consumo, esta técnica es de bajo costo (alrededor de 2 dólares EE.UU. por ejemplo), de alto rendimiento (las membranas múltiples pueden ser procesadas al mismo tiempo) y tiene un tiempo de respuesta corto (aproximadamente 10 horas).

La técnica puede ser utilizada en un número de maneras. Múltiples sondas pueden ser diseñados para detectar variaciones de secuencia dentro de un solo producto amplificado, o varios productos se pueden amplificar de forma simultánea, con una (o más) sondas utilizadas para la detección posterior. Una combinación de ambos enfoques también se puede utilizar dentro de un único ensayo. La posibilidad de incluir múltiples sondas para una secuencia de un solo objetivo hace que el ensayo muy específico.

Las aplicaciones publicadas de MPCR / RLB incluyen la detección de resistencia a los antibióticos 1,2 genes, la tipificación de Staphylococcus aureus resistente a meticilina 3-5 y Salmonella sp 6, serotipificación molecular del Streptococcus pneumoniae 7,8, Streptococcus agalactiae 9 y 10,11 enterovirus, la identificación de Mycobacterium sp 12, la detección de las verrugas genitales y del tracto respiratorio 13-15 16 y otros 17 agentes patógenos y la detección e identificación de mollicutes 18. Sin embargo, la versatilidad de la técnica significa que las aplicaciones son prácticamente ilimitadas, y no se limita al análisis molecular de los microorganismos.

Los cinco pasos de MPCR / RLB son un manual) y el diseño de la sonda, b) la extracción de ADN y la amplificación por PCR c) Preparación de la membrana, d) La hibridación y detección, y e) La regeneración de la membrana.

Protocol

Debe prestarse especial atención a la imprimación y diseño de la sonda. Todas las secuencias disponibles de los objetivos de interés a partir de bases de datos como GenBank deben ser utilizados para identificar áreas de conservación que son objetivos adecuados. Cuando un gran número de objetivos se ampliaron en un ensayo de MPCR individuales, cada secuencia amplificada debe ser de longitud similar, y no debe exceder de 300 pares de bases para evitar la competencia. Una aplicación alternativa del método consiste en amplificar un objetivo a más largo usando cebos contra regiones conservadas y el uso de sondas múltiples para identificar la secuencia de variación dentro de la amplificación. En este caso, la amplificación de PCR puede ser mayor. Temperaturas primer recocido a todos debe ser similar, con las condiciones de PCR ajustarse en consecuencia. Cebadores que forman la estructura secundaria fuerte o dímero imprimación debe ser evitado. El Sigma Aldrich ADN calculadora ( http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp ) puede ser utilizado para predecir con fiabilidad estas características.

Sondas de ADN deben ser diseñados para tener recocido temperaturas cercanas a 60 ° C. Para maximizar la especificidad, dos sondas para cada objetivo de interés pueden ser incluidos en el ensayo, se hibridan con la cadena de ADN hacia delante adyacente al sitio de unión del cebador inverso, y el otro a la cadena inversa adyacente al sitio de unión del cebador hacia delante. En este caso, tanto adelante y atrás deben ser modificados con biotina. Si sólo hay una sonda por objetivo amplificado se está utilizando, entonces sólo una imprimación tiene que ser modificado biotina.

En el diseño de cebadores y sondas para el ensayo de MPCR / RLB es altamente recomendable que use métodos in silico para predecir los productos de PCR y la hibridación de la sonda que se correlaciona con los resultados in vitro. Lo ideal sería que esto se hace con los aislamientos para los cuales la secuencia del genoma completo está disponible. Software como FastPCR (disponible en http://primerdigital.com/fastpcr.html) se puede utilizar para este propósito. Señal de la sonda débil o ausente puede predecir en el análisis in silico indica desajustes de pares de bases que resulta de la temperatura de la sonda de baja de recocido.

Técnicas de extracción de ADN puede variar en función de las muestras sometidas a prueba y las condiciones de PCR se depende de diseño de la cartilla. Los lectores deben consultar publicaciones sobre ensayos individuales para obtener más información acerca de la extracción de ADN y reactivos PCR y las condiciones de 1.19.

Cada ensayo se ejecuta con los controles adecuados para proporcionar al menos una señal negativa de la sonda positiva y una de cada sonda en la membrana, así como un ADN sin control. Además, es conveniente incluir una sonda en la parte superior de la membrana que se espera que sea positivo para todas las muestras (por ejemplo: una especie o una sonda específica del género en el caso de un microorganismo). Esto sirve como una sonda de control positivo, sino que también permite una fácil orientación de los resultados.

1. Preparación de la membrana

  1. Prepare las siguientes soluciones:
    • 100 ml de NaHCO3 0,5 M (pH 8,4)
    • 100 ml de NaHCO3 0,5 M
    • 20 ml 16% EDAC
    • 250 ml NaOH 0,1 M
    • 250 ml 2xSSPE
    • 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - lugar en el baño de agua a 60 ° C
    • 250 ml de 20 mM EDTA.
  2. Pre-caliente el horno a 60 ° C.
  3. Limpie el Miniblotter Immunetics con etanol al 70%.
  4. Diluir las sondas de oligonucleótidos en 0,5 M NaHCO 3 a una concentración final de 2 pmol / l, y un volumen de 200 l.
  5. Cortar una membrana de nylon BiodyneC de 15x15 cm. Con un lápiz y una regla, la regla de un espacio de 0,5 cm en la parte superior de la membrana y escribe los detalles aquí.
  6. Membrana que sella en una bolsa de plástico con 20 ml recién hecho 16% de solución de EDAC y el rock a temperatura ambiente durante 10 minutos.
  7. Lavar la membrana en agua desionizada durante 30 segundos.
  8. Coloque la membrana en miniblotter con canales que cruzan la membrana (paralela a la línea de lápiz). Poner amortiguador de la ayuda en su lugar y papel secante cerca. Aspirado de líquido de los canales.
  9. Llenar las calles 1 y 45 con 150 l 0,5 M NaHCO 3. Use 150 ml de cada solución de la sonda para llenar los carriles 2-44 en secuencia, teniendo cuidado de evitar las burbujas de aire. Si una burbuja de aire aparece en el canal, manteniendo la pipeta en el lugar, rápidamente aspirar la solución para que la burbuja de aire para flotar en la parte superior de la pipeta y vuelva a intentarlo. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  10. Aspirar las soluciones de la sonda, retirar la membrana y lavar con 250 ml de NaOH 0,1 M a temperatura ambiente durante 9 minutos.
  11. Lavar la membrana en 250 ml 2xSSPE durante 30 segundos.
  12. Lavar la membrana en 250 ml previamente calentada 2xSSPE/0.1% SDS en el horno a 60 ° C durante 5 minutos.
  13. Si no se utilizan para la hibridación de inmediato, lavar la membrana en 240 ml de EDTA 20 mM a temperatura ambiente durante 20 minutos (reservar 10 ml restantes), y sellar la membrana en una bolsa de plástico con el resto de 10 ml de EDTA 20 mM y el almacenamientoe en el refrigerador a 4 ° C.
  14. Lavar con miniblotter Pyroneg detergente y cepillo. Enjuagar y dejar secar.

2. Hibridación y detección

  1. Prepare las siguientes soluciones:
    • 250 ml 2xSSPE/0.1% SDS - almacenar en un baño de agua a 60 ° C.
    • 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - almacenar en un baño de agua a 60 ° C
    • 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS - tienda en el horno a 42 ° C
    • 500 ml 2xSSPE - mantener a temperatura ambiente
    • 500 ml SDS al 1% - tienda en un baño de agua a 60 ° C inicialmente (para el paso 3)
    • 250 ml de 20 mM EDTA - almacenar a temperatura ambiente (para el paso 3).
  2. A su vez en un horno a 60 ° C y un horno a 42 ° C. Hierva el agua en un vaso grande en una placa.
  3. Limpie Miniblotter con etanol al 70% Immunetics.
  4. Alícuota de 10 ml de 2xSSPE/0.1% SDS en un recipiente pequeño. Añadir 20 l de cada producto de PCR de 150 l 2xSSPE/0.1% SDS en tubos numerados.
  5. Hervir los productos de PCR durante 10 minutos a 100 ° C con los titulares de espuma de poliestireno. Coloque sobre hielo inmediatamente a por lo menos 5 minutos.
  6. Lavar la membrana en 240 ml restantes 2xSSPE/0.1% SDS a 60 º C horno durante 5 minutos.
  7. Coloque la membrana en miniblotter con cojín de apoyo. Orientar así los canales corren en forma vertical (perpendicular a la línea de lápiz).
  8. Aspiración el exceso de líquido de los canales miniblotter.
  9. Agregar el resto 150 l 2xSSPE/0.1% SDS a los canales de primera y la última. Añadir hervida productos de PCR para los canales restantes (2-44) en la secuencia, teniendo cuidado de evitar las burbujas de aire.
  10. Lugar miniblotter plana en estufa a 60 º C durante 1 hora para permitir la hibridación tenga lugar.
  11. Líquido aspirado de cada canal y luego quitar la membrana de miniblotter.
  12. Lavar dos veces en 250 ml precalentado 2xSSPE/0.5% SDS en estufa a 60 º C durante 10 minutos.
  13. Humedezca la malla de nylon de separación con 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C y la utilizan para enrollar la membrana.
  14. Coloque la membrana enrollada en un tubo de rodillo, y se despliegan para garantizar la membrana se apoya en la superficie interior. Añadir 3 l de estreptavidina-peroxidasa (Roche Applied Science) a 15 ml 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C y añadir al tubo del rodillo. Tornillo de tapa firmemente y se incuba en el horno de rodillos a 42 ° C durante 60 minutos. Asegúrese de que la dirección del rodillo es tal que la membrana no se cierra. Compruebe periódicamente que no haya fugas.
  15. Lave miniblotter en Pyroneg agua y detergente, enjuague y deje secar.
  16. Quitar la membrana de tubo del rodillo. Lavar dos veces en el resto de 2xSSPE/0.5% SDS a 42 ° C durante 10 minutos.
  17. Lavar dos veces en 2xSSPE a temperatura ambiente durante 5 min.
  18. Encienda el horno a 80 ° C y el lugar 500 ml SDS al 1% en el horno a precalentar.
  19. Constituyen el 15 por Amersham ml solución de detección ECL (7,5 ml de la solución A y 7,5 ml de solución B). Deseche 2xSSPE y añadir solución de detección. Roca suavemente con la mano durante 2 minutos asegurar una cobertura completa de la membrana con la solución. Desechar la solución de quimioluminiscencia.
  20. Corta dos hojas de plástico transparente para encajar cartucho de la exposición. Coloque la membrana entre las dos hojas y el lugar en el cartucho de la exposición.
  21. Proceder a la cámara oscura. Bajo la luz roja, añadir la película de detección ECL a los cartuchos y exponer durante 5 minutos. Oreja de perro en la esquina inferior derecha de la película después de la retirada para permitir la orientación correcta cuando se visualiza.
  22. Desarrollar la película con revelador automático o baños químicos según las instrucciones del fabricante.
  23. Repetir la exposición con tiempos de exposición más largos o más cortos si es necesario.

3. La regeneración de la membrana

  1. Lavar la membrana en 250 ml de SDS al 1% a 80 ° C durante 30 minutos dos veces.
  2. Lavar la membrana en 240 ml de EDTA 20 mM a temperatura ambiente durante 15 minutos.
  3. Sello de la membrana en una bolsa de plástico con 10 ml de 20 mM EDTA y refrigerar a 4 ° C para una futura reutilización.

4. Los resultados representativos:

Los resultados se ven mejor mediante la colocación de la película sobre una cuadrícula impresa, o bien escanear la imagen e importar en software como BioNumerics (Matemáticas Aplicadas, Sint-Martens-Latem, Bélgica). Cada resultado de la sonda debe ser interpretado con referencia a las sondas de control positivo y negativo. Los resultados son los mejores calificados como negativos, débiles o positivo. Los resultados positivos son en donde la señal es tan fuerte como o más fuerte que la sonda de control positivo. Los resultados negativos son en donde la señal está ausente o es igual a la del control negativo (en el caso de la señal de fondo). Los resultados son débiles, donde la señal es más débil que la sonda de control positivo, pero más fuerte que el control negativo. Débiles resultados puede ser el resultado de mutaciones puntuales que conducen a la sonda de unión débil, o por falta de señales específicas de la formación de dímeros de imprimación. El uso de dos sondas por objetivo de interés puede mejorar la especificidad, donde un resultado débil única forma segura se puede interpretar como no específico de la señal. Si sigue habiendo dudas, una sola reacción de PCR compleja se puede realizar con base de gel de detección y la secuencia de cualquier amplificadorlified producto para determinar si el resultado es altamente positivo. Un resultado representativo se muestra en la figura 2.

Figura 1
Figura 1. Los principios MPCR / RLB (P1) Paso 1.9. Amina sondas modificadas están obligados covalentemente a una membrana de nylon. (P2) Paso 2,10. Biotina modificado los productos de PCR se hibridan con las sondas. (P3) Paso 2,14. Estreptavidina, marcada con peroxidasa, se incubó con la membrana y se une a la biotina. (P4) Pasos 2.19-2.21. Peroxidasa cataliza la reacción de los reactivos de detección ECL, la producción de luz a la que la película sensible a la luz se expone. La membrana se lava para su reutilización.

Figura 2
Figura 2. Representante MPCR / RLB resultado. Las muestras 1 a 6 representan los controles positivos - entre ellos hay al menos una señal de la sonda positiva para cada una de las 43 sondas. Cada secuencia de destino (A través de U) se detecta con dos sondas diferentes para maximizar la especificidad. Sondas de A1 y A2 representan especies sondas específicas que se espera que sea positivo para cada muestra y ayudar con la orientación de la película. Sonda A1 se repite en la parte inferior de la membrana. Muestras 7 y 8 son los controles negativos. Tenga en cuenta que las sondas Q1, Q2, T1 y T2 tienen la señal en los controles negativos, indicando una unión no específica probable de cebos o producto de imprimación dímero. Re-diseño de estas sondas o cebadores se requeriría. Sondas C1, D1 y mostrar F1 cruzando la membrana probablemente debido a la absorción de algunos no específica del conjugado estreptavidina-peroxidasa o sustrato quimioluminiscente, sin embargo, esto es fácil de distinguir de los verdaderos señales de la sonda positiva. D1 y D2 tienen sondas de señal relativamente débil en comparación con otras sondas, esto puede ser debido a las grandes amplicones que conduce a la amplificación menos eficiente. Sonda J2 es negativo es varias muestras (1, 3, 4, 6, 39), donde la sonda J1 es positivo. Esto probablemente representa una mutación en el sitio de unión J2 para estas muestras.

Discussion

El método MPCR / RLB permite la detección simultánea de un gran número de amplicones de PCR. Debido a la alta sensibilidad de la sonda quimioluminiscente la detección basada en una sola reacción de PCR multiplex con un gran número de pares de iniciadores se pueden utilizar para ampliar la plantilla de ADN.

Si no hay señales de la sonda se obtienen con una o más muestras, la realización de la electroforesis en gel con cualquier resto de producto de PCR puede ayudar a distinguir si el problema es con la amplificación por PCR o hibridación de la sonda. Donde todas las señales de la sonda en la membrana son débiles o inexistentes, pero la electroforesis en gel indica el éxito de amplificación de PCR, las posibilidades incluyen problemas con el etiquetado de la membrana, la regeneración incorrecta de la membrana después de su uso anterior, las temperaturas incorrectas durante la incubación, la hibridación o estreptavidina, o defectuoso estreptavidina peroxidasa o reactivo de detección.

Si las muestras de control indican que las sondas individuo puede estar produciendo falsas señales negativas, solo con gel de PCR basada en la detección y posterior secuenciación se puede realizar para verificar la amplificación del producto de PCR y en busca de variación de la secuencia en el sitio de la sonda vinculante. Señal de la sonda débil o ausente puede ser debido al gran tamaño de amplificación: si es posible todos los amplicones debe ser de similar longitud y menos de 300 pb. Estructuras secundarias del ADN de los amplicones también se puede producir vinculante sonda pobres, y puede ser necesario re-diseño de los cebadores. Cartilla individual o concentraciones de la sonda también se puede variar para optimizar la potencia de la señal.

Señales de falsos positivos debido a la sonda de la unión de los primers no amplificados o un producto de imprimación dímero puede ser investigado por realizar un solo PCR con gel basado en la detección y posterior secuenciación. Si esto ocurre, el rediseño de las sondas pueden ser necesarios. Las mutaciones puntuales en los sitios de unión de la sonda puede dar lugar a señales débiles o ausentes. Permitiendo dos sondas para cada producto amplificado lo hace fácil de detectar. Esta característica puede ser explotada con imprimación y cuidado diseño de la sonda para detectar pequeñas variaciones en la secuencia de ADN diana.

En resumen, si bien hay muchos métodos de detección de los productos siguientes multiplex PCR reacciones disponibles, MPCR / RLB tiene la ventaja de ser de alto rendimiento y de bajo costo con una baja configuración de los costos. La flexibilidad del método permite su uso en una amplia gama de aplicaciones.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Mateo O'Sullivan y Zhou Fei son los destinatarios de Salud Nacional de Australia y el Consejo de Investigación Médica de Postgrado Becas de Investigación Médica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5’ amine C6 modified oligonucleotide probes Sigma-Aldrich
NaHCO3 Sigma-Aldrich S-8875 0.5 M solution made up to pH 8.4
NaOH Sigma-Aldrich S5881 0.1M solution
20xSSPE buffer Amresco 0810-4L
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L-4390 Make up 10% stock solution, do not autoclave, should be kept for 1 week maximum before use
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E9884 Make up 0.5 M solution adjusted to pH 8.0 and autoclave
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDAC) Sigma-Aldrich E7750 Make up a 20 ml 16% solution just prior to use using 3.2 g EDAC and 18 ml Millipore water
BiodyneC 0.45 μm nylon Membrane 20x20 cm Pall Corporation 74480C
Deionised, purified water
Liquid Pyroneg detergent Johnson Diversey HH12291
Streptavidin-peroxidase conjugate Roche Group 11 089 153 001
Amersham ECL detection reagents GE Healthcare RPN2105
Amersham ECL detection reagents GE Healthcare RPN2105
OHP Transparency film Corporate Express EXP 504 OHP
Amersham hyperfilm ECL high performance chemiluminescent film 18x24 cm GE Healthcare 28906837
Ice
Table 1. Consumables used in the mPCR/RLB assay.
Hybaid Shake’n’Stack Ovens (2) rolling bottle and nylon separating mesh Thermo Fisher Scientific, Inc. HBSNSRS220 Method can be performed with a single oven as long as there is facility for maintaining solutions at 42°C and 60°C prior to use
The Belly Dancer rocking platform Stovall Life Sciences, IBI Sciences Euro BDbo
Miniblotter Immunetics MN100-45
Water bath
Suction
Hot plate
Exposure cartridge Sigma-Aldrich Z36,009-0
X-ray film developer Can also use developer, fixer and water in trays in dark room instead of automated developer. Lumino-imager may also be used instead of Xray film
Table 2. Equipment required for the mPCR/RLB assay.

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References

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