Avslöja Neural Circuit Topografi i flera färger

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi erbjuder en praktisk guide för att leverera spårämnen

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Reeber, S. L., Gebre, S. A., Filatova, N., Sillitoe, R. V. Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color. J. Vis. Exp. (57), e3371, doi:10.3791/3371 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Nervbanor är organiserade i funktionella topografiska kartor. För att visualisera komplexa kretsar arkitektur vi utvecklat en metod att på ett tillförlitligt märka globala mönstring av flera topografiska prognoser. Lillhjärnan är en idealisk modell för att studera ordentlig ordning på neurala kretsar. Till exempel har kompartment organisation Spinocerebellar mossiga fibrer visat sig vara ett oumbärligt för att studera mossiga fiber mönstring. Vi visade nyligen att vetegroddar agglutinin (WGA) konjugerat till Alexa 555 och 488 kan användas för att spåra Spinocerebellar mossiga fiber projektioner för att utveckla och möss vuxen (Reeber et al. 2011). Vi har hittat tre stora egenskaper som gör att WGA-Alexa spårämnen önskvärt verktyg för märkning neurala prognoser. Först Alexa fluoroforer är intensiva och deras ljusstyrka tillåter wholemount bildbehandling direkt efter spårning. För det andra, etikett WGA-Alexa spårämnen hela banan för att utveckla och vuxna neurala projections. Tredje WGA-Alexa spårämnen snabbt transporteras i både retrograd och anterograd riktningar. Här beskriver vi i detalj hur man förbereder de spårämnen och andra verktyg som krävs, hur man utför kirurgi för Spinocerebellar spåra och hur man bäst bild spåras prognoser i tre dimensioner. Sammanfattningsvis ger vi en steg-för-steg spåra protokoll som kommer att vara användbart för att dechiffrera organisation och anslutning av funktionella kartor inte bara i lillhjärnan, men också i hjärnbarken, hjärnstammen och ryggmärgen.

Protocol

1. Leverera spårämnen in vivo med hjälp av sterila kirurgi (§ § 1,1 till 1,16)

Under hela förfarandet rekommenderar vi att standarden sterila kirurgiska metoder användas. Detta inkluderar att använda sterila handskar, klänning och ansiktsskydd. Verktyg bör antingen vara autoklaveras före användning eller rengöras grundligt med vatten och sedan etanol. Under operationen, och särskilt mellan djur, rent vävnad fragment av de verktyg och torka sterilisera instrument med en varm pärla autoklav (Steri 250 Cat. # 18.000-45, Fine Science Tools). Dessutom är det viktigt att du organiserar din arbetsplats så att du har områden avsedda för djur-förberedelser (rakning etc.), kirurgi, och en återhämtning område där djuret lätt kan övervakas, uppvärmd och försedd med analgetika vid behov. Nyckeln till framgångsrik överlevnad operationer är att minska risken för infektion och upprätthålla en aggressiv postoperativ vård strategi. Se tabell där du kan find all nödvändig utrustning och reagenser för detta protokoll.

  1. Bedöva vuxna möss med nylagade Avertin (2,2,2-Tribromoethanol, Sigma, St Louis MO;. Cat # T48402) via en intraperitoneal (ip) injektion med en dos av 0.2ml/10grams kroppsvikt. Andra anestetika såsom isofluran eller ketamin / xylazin är lika effektiv, men se till att ditt laboratorium har den institutionella och federala godkännande innan användning. Om du använder valpar (P0 - P10) kan du söva dem på krossad is i 10-15 minuter. Se till att huden varje ungarna inte är i direkt kontakt med isen (till exempel genom att placera dem i fingrarna av latex) som kallt vatten kommer snabbt att leda till en dödlig nivå av hypotermi. Kontrollera att djuret är under en acceptabel slätt av anestesi genom att utföra en tå nypa med pincett eller fingrar på djurens hind tassar. Om det finns en pedal reflex, vänta tills djuret inte svarar på denna stimulans som en indikation på ett djupareren av anestesi.
  2. När djuret är helt sövda lägg den med ryggsidan upp på en steril kompress med huvudet vänd bort från dig och svansen vänd mot dig. Raka pälsen med hårklippningsmaskiner för att ge dig själv en klar kirurgiska området som är tillräckligt bred för att få tillgång till det centrala nervsystemet. Torka av rakade området med två uppsättningar spritkompresser, då 70% alkohol / Betadine och rengör sedan en gång med alkohol våtservetter. Använd ett insidan till utsidan cirkelmönster vid rengöring av operationsområdet. Du kan välja att tydligt avgränsa din kirurgiska området genom att klippa ett litet hål i en steril kompress och placera öppningen över din rakade och rena operationsområdet. Även underhåll av sterila kirurgiska området kan vara knepigt när du använder på små djur, detta kommer att bidra till att minska risken för infektion.
  3. Lyft huden med pincett och gör ett snitt med en sax vid mittlinjen direkt ovanför nedre bröst-övre ländryggen region. Den lägre bröstkorg region övre ländryggen kan identifieras genom att köra fingret längs ryggraden för att känna efter en puckel i ryggraden (bild 1).
  4. Skär fascia och ytliga spinal muskler. Om det behövs, stoppa blödningar genom etsande blodkärlen (Fine Science Tools, Foster City, CA;. Cat # 18.000-00). På ungar, ett lätt tryck runt såret med tops är tillräckligt för att stoppa blödning.
  5. Utför en dorsal laminektomi genom att ta bort ryggkotornas processer av en eller två delar av nedre bröst - övre ländryggen ryggmärgen efter kapning lamina på båda sidor av ryggraden, mitt emellan artikulära processen och rygg ryggkotornas processen (Fig. 2) . Var försiktig så du inte skadar ryggmärgen med din sax och alltid ta bort de små benfragment som de skulle kunna slita sönder ryggmärgen. Observera att ryggraden i tidig postnatal valparna inte är helt förbenad, vilket innebär att benen är mycketmjuka och kan klippas mycket lätt. Var därför noga med att inte skära för djupt eftersom du kan skada ryggmärgen.
  6. Om du föredrar att inte utföra en rygg laminektomi hos vuxna möss, har vi funnit att du kan klippa den mjuka vävnaden mellan vertebrala segment för att avslöja en liten region i ryggmärgen utan att skära något ben. Även om båda metoderna är effektiva vägar för inträde i ryggmärgen, kan undvika en dorsal laminektomi se till att ryggmärgen är oskadade.
  7. Fyll en drog glaselektrod (borosilikatglas kapillärer, Cat # 300.056, Harvard Apparatur, Holliston, MA,. Tvåstegs Glas Mikropipett Puller från Narishige Modell 001-PC-10) med spårgas med hjälp av en mikrometer spruta (0,2; Gilmont Instrument Katt . # GS-1100) eller motsvarande leverans apparat.
  8. Dra glaset mikroelektrod på plats på en mikromanipulator och sätt elektroden 0.1-0.5mm i nedre bröst-övre ländryggen i ryggmärgen halvvägs mellan mitten avlinje och den laterala kanten av ryggmärgen. Djuret kan hållas i en stereotaxic apparater för korrekt identifiering av injektion lokus och för att stabilisera djur (Small Animal Stereotaxic modell av mätinstrumentet 940-A och elektrod Manipulator modell 960 från Kopf Instrumentation). Alternativt kommer om din narkos regim kan skräddarsys för att uppnå en stadig plan utan större rörelser på grund av djupa andetag, försiktigt tejpa djuret räcka.
  9. Trycket injicera i ryggmärgen under 3-5 minuter ungefär 0.5μl av en 2% lösning av WGA-Alexa 488 (vetegroddar agglutinin, Alexa Fluor 488 konjugat,. Cat # W11261, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 555 (vetegroddar agglutinin, Alexa Fluor 555 konjugat;. Cat # W32464, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 350 (vetegroddar agglutinin, Alexa Fluor 350 konjugat;. Cat # W11263, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA- HRP (vetegroddar agglutinin pepparrotsperoxidas, Sigma, St Louis, MO Cat # L7017) eller 0.5μl 10%BDA (biotinylerad dextran amin;. Cat # D1956, Invitrogen, Carlsbad, CA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, Sigma, St Louis, MO, Cat # P4417). Injektion av dessa volymer av spårämnen resulterar i märkningen ett stort antal fibrer. Mindre volymer måste injiceras för att rikta mindre kärnor (eller delregioner av individuella kärnor) och varje utredare bör empiriskt bestämma den ideala volymen att leverera. Jontofores bör övervägas för noggrann metod i nanoliter leverans för exakt injektioner. Vi kompletterar typiskt alla spårämne lösningar med 0,5% Snabb Green (Sigma, St Louis, MO, Cat # F7252) att visualisera injektionen plats under operationen.
  10. Vi lägger 1μl av majsolja (Sigma, St Louis, MO, Cat # C8267) till varje 10μl av BDA lösning innan injektion för att förhindra att blandningen fastnar på väggarna i drog pipetter. Om du har problem med att mata ut spårämne ur pipetten, långsamt dra tillbaka spetsen för att skapa en liten ficka i vävnaden sedan försöka injicera igen.Det är inte ovanligt att mikroelektrod tips till täppa. I de flesta fall fickan hjälper också till att skapa en reservoar från vilken den omgivande nervceller kan absorbera spårämnen. Kom ihåg att alltid mata ut spårämne långsamt för att undvika stora vävnadsskador i närheten av din nål.
  11. Stäng försiktigt huden med såret klipp och vävnad lim. Alternativt kan du använda suturer för att stänga såret.
  12. Notera att med praktiken det kirurgiska ingreppet, åtminstone fram till denna punkt, kan genomföras på mindre än 20 minuter.
  13. Placera djuret i en återhämtning kammare (Vetcare kammare modell 9.16.0 Cat. # 340.508 från Harvard Apparater) på en värmedyna (värmekudden Cat. # 341.241 från Harvard Apparatus) för att undvika hypotermi och påskynda återhämtningen. Alternativt kan du använda ett av många märken och modeller av värme kammare. Övervaka andning och kontrollera om tecken på att djuret försöker flytta. De flesta djur svarar vanligtvis inom 10-15 minuter efter operationen.
  14. WGA-Alexa 555, WGA-Alexa 488, och WGA-HRP snabbt transporteras i nervceller och vi har funnit att i både tidiga postnatala och vuxna möss Alexa konjugatet spårämnen kraftigt etiketten långfibrig kontrakt inom 24 timmar (Reeber et al. 2011) . WGA-Alexa 350 är också snabbt transporteras, även jämfört med de andra Alexa färgämnen dess synlighet är starkt beroende av kvaliteten och filtrets känslighet set (data visas ej,. Reeber et al 2011) BDA kräver oftast längre överlevnadstid att helt spåra neurala prognoser och därmed för fullständig kartläggning av Spinocerebellar prognoser djur måste offras efter ca 11 dagar.

2. Upptäckt av anterogradely spåras mossiga fibrer

  1. Efter respektive överlevnad perioder Bedöva möss med Avertin (eller önskad bedövningsmedel).
  2. När det inte finns några reflexer blod skall spolas genom hjärtat av perfusing med 0,1 miljoner PBS (pH7.2). Sedan fixa vävnad genom perfusing djuret med 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Förutom de områden du kommer att analysera, är det alltid nödvändigt att skaffa vävnad från injektionsstället retrospektiv analys av hur stort injektionen var en indikation på omfattningen av vävnadsskada orsakad av elektroden, och för att identifiera eventuell märkning i fibrer av passagen (bild 3, se Mesulam, 1982;. Reeber et al 2011).
  3. Postfix BRains från perfusion möss i 24-48 timmar hos 4% PFA och sedan cryoprotect dem i buffrad sackaros lösningar som spätts i PBS (15% för ~ 2 timmar eller tills vävnaden sjunker till botten av behållaren och därefter 30% över natten eller tills vävnad sjunker). Vävnaden är då bort från sackaros, försiktigt dabbed torra med hushållspapper och därefter ned i en vävnad mögel innehåller oktober (Optimal Cutting Temperatur, Sakura Finetech USA Inc, CA). Vävnaden är då fryses med hjälp av en -80 ° C frys och lagras vid samma temperatur tills den är färdig att skäras.
  4. Den Alexa fluoroforer är synliga direkt efter märkning och inte kräver ytterligare färgning. Därför, efter perfusion WGA-Alexa spåras vävnad kan skäras och monteras för avbildning eller direkt avbildas på 4% PFA som ett wholemount beredning. Vi fann att avbildning av vävnad i 4% PFA gav bäst brytningsindex för avbildning topografi spåras projektioner i wholemounts. För sektioner, skär seriell 40μm tjock Coronal avsnitt om en kryostat och samla dem som fritt flytande sektioner i PBS. Med tanke på toxicitet av PFA, se till att en lämplig ansiktsmask bärs under perfusion och bildhantering, hålla området väl ventilerat, och när den inte används omedelbart returnera PFA eller PFA-fixerat till slutna behållare. Det är idealiskt om din mikroskop är belägen i ett lämpligt dragskåp.
  5. WGA-HRP märkt fibrer kan avslöjas med hjälp av tetrametylbensidin (TMB) som en kromogen. Vi kommer inte att beskriva HRP färgningsprotokollet här eftersom det tidigare har beskrivits i detalj (Vogel och Prittie 1994;. Sillitoe et al 2010)
  6. För BDA märkt fibrer inkubera fritt flytande vävnadssnitt i 2 timmar i Streptavidin-CY3 (kat. # 434.315, Invitrogen, Carlsbad, CA) eller Streptavidin-Alexa Fluor 488 eller 555 (kat. # S11223 för 488 och Cat. # S21381 för 555, Invitrogen, Carlsbad, CA), tvätta i PBS och sedan montera med fluoro-GEL. För DAB, inkubera vävnadssnitt natten i ABC reaktion buffert (Kat. # PK-4000, VEctor Laboratories, Inc. Burlingame, Kalifornien), skölj tre gånger i PBS och sedan reagera i 5-10 minuter i DAB (0.5mg/ml, Vector Laboratories Inc., San Francisco) kompletterat med 10μl av 30% H 2 O 2 för varje 50 ml DAB-lösning.

3. Immunohistokemi

  1. Immunohistokemi genomfördes enligt tidigare beskrivning (Sillitoe et al. 2008). Kortfattat, inkubera vävnadssnitt i 0,1 miljoner PBS innehållande 10% NGS (NGS, Sigma, St Louis MO), 0,1% Tween-20 och primära antikroppar (se nedan) för 16-18 timmar i rumstemperatur. Tvätta vävnadssnitt tre gånger i PBS och inkubera dem i sekundära antikroppar (se nedan) för högst 2 timmar i rumstemperatur. Skölj vävnaden igen och avslöja immunreaktivitet som beskrivs nedan.
  2. För att bestämma relationen mellan Purkinje celler och mossiga fibrer samarbetar vi märkt flytande vävnadssnitt med hjälp av konventionella metoder för dubbla färgning. Vi använde WGA-Alexa 555för att spåra och Alexa 488 konjugerat åsna anti-mus sekundära antikroppar (Invitrogen / molekylära sonder Inc., Carlsbad, CA) för att upptäcka ZebrinII (1:250; Kind gåva från Dr Richard Hawkes, University of Calgary, Calgary, Kanada). ZebrinII är en monoklonal antikropp och användes direkt från använt Hybridomteknik odlingsmedium. Den fluoroforen konjugerade sekundära antikroppar har använts vid spädning 1:1500. Efter färgning av vävnadssnitt monterades på uppladdade glasskivor och sedan coverslipped med fluoro-gel i Tris-buffert (elektronmikroskopi vetenskaper, Hatfield, PA) eller med Vectashield hardset monteringsmedium med DAPI (Kat. # H-1200, Vector Laboratories, Burlingame , CA) för triple färg fluorescens avbildning.
  3. Vi testade det speciella med sekundära antikroppar genom bearbetning av vävnadssnitt i frånvaro av primära antikroppar. Ingen signal upptäcktes i en sådan kontroll experiment, vilket indikerar att färgningen vi såg var inte på grund av ospecifik signaler från the Alexa-konjugerade antikroppar (data visas inte).

4. Mikroskopi och dataanalys

  1. Vi fångar mikrofotografier av vävnadssnitt med hjälp av Leica DFC360 FX (fluorescens) och DFC490 (DAB och TMB reagerade vävnadssnitt) kameror monterade på en Leica DM5500 mikroskop.
  2. Vi förvärvar och analysera bilder av vävnadssnitt med Leica Application Suite och Leica Application Suite FX programvara.
  3. Mikrofotografier av wholemounts har tagits med en Leica DFC3000 FX kamera monterad på en Leica MZ16 FA stereomikroskop kör Leica Application Suite FX programvara.
  4. Båda våra mikroskop är utrustade med Leica CY3 (modell # 11.600.231) och FITC (modell # 11.513.880) filter, och DM5500 med ytterligare ett A4-DAPI / UV-filter (modell # 11.504.162).
  5. Bilderna som förvärvats efter att optimera för under / över-exponering som bestäms med hjälp av Leica. Vi importerar alla rådata till Adobe Photoshop CS4 och vid behov we rätt hela området för varje bild skärpa, ljusstyrka, kontrast eller nivåer bara. Andra fotoredigering mjukvaran kan användas som föredras.
  6. De scheman som presenteras här drogs i Adobe Illustrator CS4.
  7. Alexa 555 och CY3 färgade nervceller, som uppdagas som röda använder våra filter, var pseudo-färgade magenta i bilderna presenteras hela manuskriptet.

Djur

Alla djurstudier utförda vid en godkänd IACUC djur protokoll enlighet med de institutionella riktlinjerna vid Albert Einstein College of Medicine. Manliga och kvinnliga utavlat schweiziska Webster (Taconic, Albany, NY) eller inavlade C57BL6J (JAX, Bar Harbor, ME) möss bibehölls i vår koloni och används för alla studier. Middagstid samma dag en vaginal plugg upptäcktes ansågs embryonala dag 0,5.

5. Representativa resultat:

Spinocerebellar afferenter säga till parasagittal band i lillhjärnan (Fig. 3; Voogd et al 1969;. Grishkat och Eisenman 1995, Vogel och Prittie 1994; Vig et al 2005;. Apps och Hawkes 2009; Sillitoe et al 2010;.. Reeber et al 2011). Vi injicerade WGA-Alexa spårämnen i nedre bröst-övre ländryggen ryggmärgen att visa: 1) att dessa spårämnen kan användas för att konsekvent märkning specifika delmängder av terminaler i lillhjärnan (Fig. 3; Reeber et al 2011), 2). att WGA-Alexa spårämnen intensivt ljus och kan användas för att visualisera det övergripande mönstret av mossiga fiber topografi helt cerebella (Fig. 3;. Reeber et al 2011), 3) att WGA-Alexa 488 och 555 kan användas i kombination för att spåra flera skrifter i samma djur (bild 4), och 4) att WGA-Alexa spårämnen är kompatibla med immunhistokemisk färgning (bild 5). Under senare arbetar vi visade att WGA-Alexa spårämnen etikett terminaler i lillhjärnan så tidigt som 6 timmar efter att leverera spårämne in i ryggmärgen och är ett utmärkt val för att spåra architecture för att utveckla vägar (Reeber et al. 2011).

Figur 1
Figur 1. Inställning av utrustning för att leverera spårämnen in vivo. A. En bild av vår kirurgiska området. B. Den undre bröst-övre ländryggen kan identifieras genom att köra fingrarna längs ryggraden för att känna efter en puckel i ryggraden. Den dorsala laminektomi bör utföras ungefär i mitten av den "puckel", vilket indikeras av den gula pilen.

Figur 2
Figur 2 Illustration av en lägre bröstkorg -... Övre ländkotsfrakturer segmentet före och efter rygg laminektomi A. Schematisk bild av ett intakt vertebrala segment från det nedre thorax-övre bråte regionen av musen ryggraden B. En dorsal laminektomi sker genom att ta bort ryggkotornas processer av en eller två kotfrakturer segment, efter kapning i lamina mitt emellan artikulära processen och rygg ryggkotornas processen.

Figur 3
Figur 3. WGA-Alexa spårämnen intensivt ljus och kan användas för att visualisera afferenta projektion topografi med hög upplösning. A. schematiska illustrerar ursprung och uppsägning av WGA-Alexa 555 märkt Spinocerebellar nervceller. B. Bild av en injektionsstället efter att ha levererat WGA-Alexa 555 i nedre bröst övre ländryggen av den vuxna ryggmärgen. C. Wholemount bild av främre lobules efter en injektion av WGA-Alexa 555 i nedre bröst-övre ländryggen i ryggmärgen. D. WGA-Alexa 555 anterograd spårande av Spinocerebellar tarmkanalen avslöjar band av mossiga fibrer som kan ses på ett samarbeteRonal vävnad avsnitt. Den lobules definieras av romerska siffror och siffrorna etiketten mossiga band fiber på båda sidor om mittlinjen (gäller alla bilder). Skala barer: B, 500 ìm C, 500 ìm D, 200 ìm.

Figur 4
Figur 4. WGA-Alexa spårämnen är effektiva för märkning av flera nervbanor i samma djur. A. Wholemount schematiska av musen lillhjärnan sammanfattar det övergripande mönstret av Spinocerebellar mossiga fiber band. WGA-Alexa 555 var injiceras i höger sida av ländryggen ryggmärgen och WGA-Alexa 488 i samma segment på vänster sida. Som ses på en koronalt vävnad avsnitt skär genom den bakre lobules B., var både WGA-Alexa spårämnen transporteras till lillhjärnan och framgångsrikt märkt distinkta delmängder av terminaler (se även Reeber et al. 2011). Förkortningar: molecular lager (ml), Purkinje cellager (PCL), granulat cellager (GCL), vit substans (WM). Skala barer: B, 100 ìm.

Figur 5
Figur 5. WGA-Alexa spårämnen kan användas i kombination med immunohistokemi och histologi för triple märkning av nervceller och prognoser. A. WGA-Alexa 555 deponeras i mossiga fiber terminaler i lob III. B. ZebrinII färgning avslöjar en rad Purkinje cell ränder i lob III.. C. DAPI färgning av neuronala och gliaceller kärnorna D. Sammanslagen bild av panelerna A, B , och C visar tredubbla märkning av afferenta band, Purkinje ränder cell och allmänna cytoarchitecture. EH. Hög förstoring bilder på boxed regioner som visas i paneler AD. Purkinje cell ränder är numrerade enligt tidigare beskrivning (Senastei (Apps och Hawkes 2009)). Förkortningar: molekylära lagret (ml), Purkinje cellager (PCL), granulat cellager (GCL). Skala barer: D, 500 ìm (för AC), H, 500 ìm (för t.ex.).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi har beskrivit de kirurgiska och tekniska uppgifter som krävs för en lyckad axonal och Dendrite spåra med hjälp av en ny fluorescerande metod för att snabbt märkning neurala prognoser för att utveckla och möss vuxen. Använda WGA-Alexa visar vi hur spårämnen och markörer kan användas för att analysera mönstrade krets topografi med hög upplösning och i tre dimensioner.

Många spårämnen finns för att spåra neuronala kretsar, inklusive koleratoxin subenhet B, Biocytin, Neurobiotin, Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHAL), fluororuby, fluoremerald och fluorogold. Dessutom har de senaste genetiska och virus baserat spårämnen visat att molekylärt olika neuronala delmängder topografiskt är anslutna till sina mål med stor precision. Observera att även om vissa neurala spårämnen är främst transporteras i antingen anterograd eller retrograd riktning (t.ex. BDA 10.000 MW jämfört med 3000 MW), är spårämne molekyler transporteras ofta i båderiktningar. I våra studier, presenterar vi WGA-Alexa baserade spårämnen som pålitliga neuroanatomiska verktyg för analys av topografiska projektion mönster. Vi visar att WGA-Alexa fluorescerar starkt, transporteras snabbt och är mångsidig nog att paras ihop med immunhistokemiska markörer bland annat för cerebellär sagittal fack (bild 3).

Vi har funnit flera begränsningar med att använda WGA-Alexa i jämförelse med andra tillgängliga neuroanatomiska spårämnen. I motsats till BDA (Wu et al. 1999) visade vi tidigare att WGA-Alexa (och WGA-HRP) inte avslöjar hela morfologi av komplexa terminal ändelser (Reeber et al. 2011). Däremot förbättrade vi värdet av den anatomiska information som erhålls från spåras terminaler genom att para ihop WGA-Alexa spårning med immunhistokemisk färgning för vesikulär glutamat transportör 2 (VGLUT2) och kokain och amfetamin regleras avskrift peptid (CART) immunohistokemi (Reeber et al 2011;. Reeber och Sillitoe, 2011). Enandra bristen i WGA-Alexa är att signalen bryts relativt snabbt på vävnadssnitt, trots att monteras i media som skyddar fluorescerande signal. Därför har vi vanligtvis bild vävnaden omedelbart efter styckning, även om bildbehandling inom 2 dagar av skärande fortfarande tillåter märkt fibrer och terminaler för att framgångsrikt avbildas. Det finns en tendens till att WGA-Alexa signalen att gå ner i intensitet under immunfärgning av vävnadssnitt. Med färre och kortare tvättar vid färgning kan minimera detta problem. En annan rekommendation är att alltid montera och bild en uppsättning av den spårade vävnadssnitt på dagen för styckning för en referens som att jämföra med intilliggande sektioner som kommer att behandlas för immunohistokemi. I våra händer oktober (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, Kalifornien) inbäddad vävnad block förvaras vid -80 ° C efter perfusion och cryoprotection kan lagras under längre perioder utan någon förlust av spårämne intensitet.

Vår approach att spåra fibrer kan enkelt anpassas för att spåra neurala kartor i kortikalt, hjärnstammen och ryggmärgen vägar. Vi undersöker för närvarande möjligheten att använda WGA-Alexa spårämnen för in vivo-avbildning av kretsen bildas i genetiskt modifierade djur och för att studera dynamiken i kretsen bildas efter selektiv tarmkanalen skador och farmakologiska manipulationer. Sedan snabb transport av WGA-Alexa spårämnen möjliggör kortsiktiga analysen vår strategi har potential för att avslöja de dynamiska förändringar som sker under strukturell plasticitet av topografiska kretsar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av nya utredare start medel från Albert Einstein College of Medicine i Yeshiva University till RVS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bead sterilizer Fine Science Tools Model Steri 250 Cat. # 18000-45
Cauterizer Fine Science Tools Cat. # 18000-00
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus Cat. # 300056
Dual stage Glass Micropipette Puller Narishige International Model 001-PC-10
Micrometer syringe Gilmont Instruments Cat. # GS-1100
Small Animal Stereotaxic Instrument Kopf Instruments Model 940-A
Electrode Manipulator Kopf Instruments Model 960
Vetcare chamber Harvard Apparatus Cat. # 340508
Heating Pad Harvard Apparatus Cat. # 341241
Leica DFC360 FX camera Leica Microsystems DFC360 FX
Leica DFC490 camera Leica Microsystems DFC490
Leica DM5500 microscope Leica Microsystems DM5500
Leica DFC3000 FX camera Leica Microsystems DFC3000 FX
Leica MZ16 FA microscope Leica Microsystems MZ16 FA
CY3 Filter Leica Microsystems Model # 11600231
FITC Filter Leica Microsystems Model # 11513880
A4 DAPI/UV filter Leica Microsystems Model # 11504162
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Cat. #W11261
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen Cat. #W32464

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
  2. Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
  3. Mesulam, M. Tracing neural connections with horseradish peroxidase. Wiley. New York. (1982).
  4. Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. Journal of Comparative Neurology. (2011).
  5. Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain. Struct. Funct. (2011).
  6. Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum. J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).
  7. Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map. J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).
  8. Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells. Neuroscience. 130, 735-744 (2005).
  9. Vogel, M. W., Prittie, J. Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant. J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).
  10. Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems. Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).
  11. Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei. J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics