Revealing Neurale Circuit Topografie in Multi-Color

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Wij bieden een praktische gids voor het leveren van tracers

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Reeber, S. L., Gebre, S. A., Filatova, N., Sillitoe, R. V. Revealing Neural Circuit Topography in Multi-Color. J. Vis. Exp. (57), e3371, doi:10.3791/3371 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Neurale circuits worden georganiseerd in functionele topografische kaarten. Om de complexe schakeling architectuur te visualiseren we een aanpak ontwikkeld om op betrouwbare wijze het etiket van de wereldwijde patronen van meerdere topografische projecties. Het cerebellum is een ideaal model om de ordelijke rangschikking van neurale circuits te bestuderen. Zo heeft de organisatie van de compartimenteel spinocerebellaire bemoste vezels bewezen een onmisbaar systeem voor het bestuderen van bemoste vezels patronen worden. We hebben onlangs aangetoond dat tarwekiem agglutinine (WGA) geconjugeerd aan Alexa 555 en 488 kan worden gebruikt voor het opsporen van spinocerebellaire bemoste vezels projecties in het ontwikkelen en volwassen muizen (Reeber et al.. 2011). We vonden drie belangrijke eigenschappen die de WGA-Alexa tracers wenselijk tools te maken voor de etikettering neurale projecties. De eerste, Alexa fluoroforen zijn intens en de helderheid zorgt voor wholemount imaging direct na tracing. Ten tweede, WGA-Alexa tracers label het gehele traject van het ontwikkelen en volwassen neurale projections. Derde, WGA-Alexa tracers snel vervoerd in zowel de retrograde en anterograde richtingen. Hier beschrijven we in detail hoe de tracers en andere benodigde gereedschappen, hoe u de chirurgie voor spinocerebellaire tracing presteren en de beste manier om de afbeelding getraceerd projecties in drie dimensies te bereiden. Kortom, we bieden een stap-voor-stap tracing protocol dat nuttig zal zijn voor het ontcijferen van de organisatie en de connectiviteit van de functionele kaarten niet alleen in de kleine hersenen, maar ook in de cortex, de hersenstam en het ruggenmerg.

Protocol

1. Het leveren van tracers in vivo met behulp van steriele chirurgie (secties +1,1-+1,16)

Tijdens de gehele procedure adviseren wij dat de standaard steriele chirurgische technieken worden gebruikt. Dit omvat het gebruik van steriele handschoenen, schort, en gelaatsmasker. Gereedschap moet ofwel worden geautoclaveerd vóór gebruik of grondig gereinigd met water en vervolgens ethanol. Tijdens de operatie, en in het bijzonder tussen dieren, schone tissue fragmenten uit de tools en droog steriliseren instrumenten met een hete kraal sterilisator (Steri 250 Cat. # 18000-45, Fijn Science Tools). Daarnaast is het essentieel dat u uw werk ruimte, dat je gebieden die voor dierlijke voorbereiding (scheren etc), de operatie, en een herstel gebied waar het dier gemakkelijk kan worden gecontroleerd, verwarmd, en voorzien van pijnstillers als dat nodig hebben. De sleutel tot succesvolle operaties overleven is om het risico van infectie te verminderen en een agressieve post-operatieve zorg strategie te handhaven. Raadpleeg de tabel waar je kunt find alle benodigde apparatuur en reagentia voor dit protocol.

  1. Verdoven volwassen muizen met vers bereide Avertin (2,2,2-tribroomethanol, Sigma, St. Louis MO;. Cat # T48402) via een intraperitoneale (ip) injectie met een dosis van 0.2ml/10grams lichaamsgewicht. Andere anesthetica, zoals isofluraan of ketamine / xylazine zijn even effectief, maar zorgen ervoor dat uw laboratorium van de vereiste institutionele en federale goedkeuring voor gebruik is. Als u gebruik maakt van pups (P0 - P10) kunt u verdoven ze op gemalen ijs gedurende 10-15 minuten. Zorg ervoor dat de huid van elke pup niet in direct contact met het ijs (bijvoorbeeld door ze te plaatsen in de vingers van latex handschoenen) als het koude water zal al snel leiden tot een dodelijk niveau van onderkoeling. Bevestigen dat het dier onder een aanvaardbaar vlakte van anesthesie door het uitvoeren van een teen knijpen met een tang of vingers om de dieren 'achterpoten. Als er een pedaal reflex, wacht tot het dier niet reageert op deze stimulans als een indicatie van een dieperevlakte van anesthesie.
  2. Zodra het dier volledig verdoofd leg het met de dorsale zijde naar boven op een steriel gaasje met de kop van u af en de staart naar u toe. Scheren van de vacht met tondeuses te geven om jezelf een duidelijke chirurgische veld dat is breed genoeg om de toegang tot het centrale zenuwstelsel te krijgen. Veeg de geschoren regio met twee sets van alcohol doekjes, dan is 70% alcohol / betadine, en dan nog eens schoon met alcohol doekjes. Gebruik een binnen naar buiten cirkelvormig patroon bij het schoonmaken van het chirurgische gebied. U kunt ervoor kiezen om uw chirurgische veld duidelijk af te bakenen door het snijden van een klein gaatje in een steriel gaasje en het plaatsen van de opening over je geschoren en schone chirurgische site. Hoewel het handhaven van de steriele chirurgische veld kan lastig zijn bij het werken op kleine dieren, daarbij zal helpen het risico op infectie.
  3. Til de huid met behulp van pincet en maak een incisie met een schaar op de middenlijn direct boven de onderste thoracale-bovenste lumbale rEgion. De lagere thoracale regio bovenste lumbale regio kan worden geïdentificeerd door het uitvoeren van uw vinger langs de wervels te voelen voor een bult in de wervelkolom (afb. 1).
  4. Snijd de fascia en oppervlakkige spinale spieren. Indien nodig, stop het bloeden door verbranden van de bloedvaten (Fine Science Tools, Foster City, CA;. Cat # 18000-00). In pups, het toepassen van lichte druk rond de incisie met wattenstaafjes is voldoende om het bloeden te stoppen.
  5. Voer een dorsale laminectomie door het verwijderen van de doornuitsteeksels van een of twee segmenten van de lagere thoracale - bovenste lumbale ruggenmerg na het snijden van de lamina aan beide zijden van de wervelkolom, halverwege tussen de articulaire proces en de dorsale processus spinosus (fig. 2) . Wees voorzichtig dat u de schade aan het ruggenmerg met de schaar en altijd de kleine botfragmenten als ze konden het ruggenmerg vaneenscheuren te verwijderen. Merk op dat de wervelkolom in de vroege postnatale pups niet volledig verbeend is, wat betekent dat de botten heel zijnzacht en kan zeer gemakkelijk worden gesneden. Wees daarom voorzichtig te snijden te diep zoals u wellicht de schade aan het ruggenmerg.
  6. Als u liever niet een dorsale laminectomie uit te voeren bij volwassen muizen, hebben we ontdekt dat je de zachte weefsel tussen de wervels segmenten gesneden om een ​​klein gebied van het ruggenmerg bloot zonder te snijden elk bot. Hoewel beide methoden effectief zijn routes van binnenkomst in het ruggenmerg, kan het vermijden van een dorsale laminectomie ervoor te zorgen dat het ruggenmerg onbeschadigd blijft.
  7. Vul een glas getrokken elektrode (borosilicaatglas haarvaten; Cat # 300056, Harvard Apparatus, Holliston, MA;. Tweetraps Glass Micropipet Puller van Narishige Model 001-PC-10) met uw tracer met behulp van een micrometer injectiespuit (0,2 ml; Gilmont Instruments Cat . # GS-1100) of een gelijkwaardige levering apparaat.
  8. Draai het glas micro-elektrode op zijn plaats op een micromanipulator en plaats de elektrode 0.1-0.5mm in de onderste thoracale-bovenste lumbale regio van het ruggenmerg halverwege tussen het midden van delijn en de laterale rand van het ruggenmerg. Het dier kan worden gehouden in een stereotaxische apparaat voor nauwkeurige identificatie van loci injectie en voor het stabiliseren van het dier (Small Animal stereotaxische Instrument Model 940-A en de elektrode Manipulator Model 960 uit Kopf Instrumentation). Als alternatief wordt als je verdoving regime kan worden afgestemd op een constante vliegtuig zonder noemenswaardige bewegingen als gevolg van diepe ademhaling te bereiken, voorzichtig taping het dier af te volstaan.
  9. Onder druk injecteren in het ruggenmerg gedurende 3-5 minuten ongeveer 0.5μl van een 2% oplossing van WGA-Alexa 488 (tarwekiemen agglutinine, Alexa Fluor 488 conjugaat;. Cat # W11261, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 555 (tarwekiemen agglutinine, Alexa Fluor 555 conjugaat;. Cat # W32464, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA-Alexa 350 (tarwekiemen agglutinine, Alexa Fluor 350 conjugaat;. Cat # W11263, Invitrogen, Carlsbad, CA), WGA- HRP (tarwekiemen agglutinine mierikswortelperoxidase, Sigma, St. Louis, MO Cat # L7017) of 0.5μl van 10%BDA (gebiotinyleerde dextraan amine;. Cat # D1956, Invitrogen, Carlsbad, CA) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, Sigma, St. Louis, MO, Cat # P4417). Het injecteren van deze volumes van de tracers resulteert in het labelen van een groot aantal vezels. Kleinere volumes zal moeten worden geïnjecteerd voor het richten van kleinere kernen (of sub-regio's van de afzonderlijke kernen) en elke onderzoeker moet empirisch vast te stellen het ideale volume te leveren. Iontoforese moet worden overwogen voor een nauwkeurige nanoliter levering voor nauwkeurige injecties. We meestal vullen allemaal tracer-oplossingen met 0,5% Fast Green (Sigma, St. Louis, MO, Cat # F7252) om de injectie ter plekke visualiseren tijdens de operatie.
  10. Wij voegen 1μl van maïsolie (Sigma, St. Louis, MO, Cat # C8267) aan elke 10μl van BDA-oplossing voor het injecteren om het mengsel te voorkomen dat het vasthouden aan de wanden van de getrokken pipetten. Als je problemen hebt het uitwerpen van de tracer uit de pipet, langzaam terugtrekken van de tip om een ​​zakje in het weefsel vervolgens probeer het opnieuw injecteren.Het is niet ongebruikelijk dat de micro-elektrode tip om verstoppen. In de meeste gevallen de zak helpt ook een reservoir van waaruit de omliggende neuronen kan de tracer absorberen. Vergeet niet om altijd traag uitwerpen van de tracer tot massale beschadiging van het weefsel in de buurt van uw naald te voorkomen.
  11. Sluit de huid met wond clips en weefsel lijm. Als alternatief kunt u gebruik maken hechtingen om de wond te sluiten.
  12. Merk op dat de praktijk van de chirurgische procedure, althans tot op dit punt, kan worden voltooid in minder dan 20 minuten.
  13. Plaats het dier in een recovery kamer (Vetcare kamermodel 9.16.0 Cat. # 340508 van Harvard Apparatus) op een verwarmingselement (Heating Pad Cat. # 341241 van Harvard Apparatus) om onderkoeling en versnellen het herstel te voorkomen. Als alternatief kunt u gebruik maken van een van de vele merken en modellen van verwarming kamers. Toezicht op de ademhaling en controleer op tekenen dat het dier probeert te bewegen. De meeste dieren zijn meestal reageren binnen 10-15 minuten na de operatie.
  14. WGA-Alexa 555, WGA-Alexa 488, en de WGA-HRP snel vervoerd in neuronen en we hebben gemerkt dat zowel in vroege postnatale en volwassen muizen de Alexa conjugaat tracers robuust label lange vezels stukken binnen 24 uur (Reeber et al.. 2011) . WGA-Alexa 350 is ook snel getransporteerd, hoewel in vergelijking met de andere Alexa kleurstoffen de zichtbaarheid is sterk afhankelijk van de kwaliteit en de gevoeligheid van het filter sets (data niet meer getoond;. Reeber et al., 2011) BDA vereist meestal langere overlevingsduur volledig te traceren neurale projecties en dus voor een volledige kaart brengen van spinocerebellaire projecties dieren zal moeten worden opgeofferd na ongeveer 11 dagen.

2. Detectie van anterogradely getraceerd bemoste vezels

  1. Na de respectievelijke periodes overleven verdoven van de muizen met Avertin (of uw favoriete narcose).
  2. Zodra er geen reflexen het bloed moet door het hart worden doorgespoeld door perfuseren met 0,1 M PBS (pH7.2). Dan, fix het weefsel door perfuseren het dier met 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. In aanvulling op de regio's zul je te analyseren, is het altijd noodzakelijk om weefsel te verkrijgen van de injectieplaats voor de retrospectieve analyse van hoe groot de injectie was, een indicatie van de mate van weefselschade veroorzaakt door de elektrode, en voor het identificeren van mogelijke etikettering in vezels van de passage (Fig. 3, zie Mesulam, 1982;. Reeber et al. 2011).
  3. Postfix de brAins van doorbloed muizen voor 24-48 uur in 4% PFA en vervolgens cryoprotect ze in een gebufferde sucrose oplossingen verdund in PBS (15% voor ~ 2 uur of tot het weefsel zinkt naar de bodem van de container en dan 30% 's nachts of totdat de weefsel wastafels). Het weefsel wordt vervolgens verwijderd uit het sucrose, zachtjes gedept droog met keukenpapier en vervolgens ondergedompeld in een tissue mal met OCT (Optimal Cutting Temperatuur; Sakura Finetech USA Inc, CA). Het weefsel wordt vervolgens ingevroren met behulp van een temperatuur van -80 ° C vriezer en opgeslagen bij dezelfde temperatuur totdat het klaar om te worden gesneden.
  4. De Alexa fluoroforen zijn zichtbaar direct na de etikettering en vereisen geen extra kleuring. Dus na perfusie de WGA-Alexa getraceerd weefsel kan worden gesneden en gemonteerd voor imaging of direct afgebeeld in 4% PFA als een wholemount voorbereiding. We vonden dat de beeldvorming van de weefsels in 4% PFA gaf de beste brekingsindex voor de beeldvorming van de topografie van getraceerd projecties in wholemounts. Voor de secties, knippen seriële 40μm dik CoronAl secties over een cryostaat en verzamelen ze als vrij zwevende delen in PBS. Gezien de giftigheid van PFA, zorgen voor een passend masker wordt gedragen tijdens de perfusie en beeldvorming, houd de ruimte goed geventileerd, en wanneer niet in gebruik onmiddellijk een PFA-of PFA-gefixeerd weefsel terug te keren naar verzegelde containers. Het is ideaal als uw microscoop is gelegen in een geschikte zuurkast.
  5. WGA-HRP gelabelde vezels kunnen worden onthuld met behulp van tetramethylbenzidine (TMB) als een chromogeen. We zullen hier niet beschrijven de HRP kleuringsprotocol omdat het eerder in detail beschreven (Vogel-en Prittie 1994;. Sillitoe et al., 2010)
  6. Voor BDA label vezels incubeer vrij zwevende weefsel secties voor 2 uur in Streptavidine-Cy3 (Cat. # 434315, Invitrogen, Carlsbad, CA) of streptavidine-Alexa Fluor 488 of 555 (Cat. # S11223 voor 488 en Cat. # S21381 voor 555, Invitrogen, Carlsbad, CA), was in PBS en vervolgens monteren met fluor-GEL. Voor DAB, incubeer weefselcoupes overnachting in ABC reactiebuffer (Cat. # PK-4000, VEctor Laboratories, Inc Burlingame, CA), spoel 3 keer in PBS en dan reageren gedurende 5-10 minuten in DAB (0.5mg/ml, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA), aangevuld met 10μl van 30% H 2 O 2 voor elke 50 ml DAB-oplossing.

3. Immunohistochemie

  1. Immunohistochemie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (Sillitoe et al.. 2008). In het kort, incubeer weefselcoupes in 0,1 M PBS dat 10% NGS (NGS, Sigma, St. Louis MO), 0,1% Tween-20 en primaire antilichamen (zie hieronder) voor 16-18 uur bij kamertemperatuur. Was de weefselcoupes drie keer in PBS en ze dan incuberen in secundaire antilichamen (zie hieronder) voor een maximum van 2 uur bij kamertemperatuur. Spoel opnieuw het weefsel en onthullen de immunoreactiviteit zoals hieronder beschreven.
  2. Voor het bepalen van de relatie tussen Purkinje cellen en bemoste vezels hebben we co-gelabeld vrij zwevende weefselcoupes met behulp van conventionele methoden van dubbele vlekken. We gebruikten WGA-Alexa 555voor het opsporen en Alexa 488 geconjugeerd ezel anti-muis secundaire antilichamen (Invitrogen / Molecular Probes Inc, Carlsbad, CA) te ZebrinII (; Kind gift van dr. Richard Hawkes, Universiteit van Calgary, Calgary, Canada 1:250) te detecteren. ZebrinII is een muis monoklonaal antilichaam en werd direct uit gebruikte hybridoma kweekmedium. De fluorofoor geconjugeerde secundaire antilichamen werden gebruikt in een verdunning van 1:1500. Na het kleuren van de weefselcoupes werden gemonteerd op geladen glazen dia's en vervolgens afgedekt met een fluor-GEL in Tris buffer (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) of met Vectashield hardset montage medium met DAPI (Cat. # H-1200, Vector Laboratories, Burlingame , CA) voor triple kleur fluorescentie beeldvorming.
  3. We testten de specificiteit van de secundaire antilichamen door het verwerken van het weefsel secties in de afwezigheid van primaire antilichamen. Er geen signaal werd gedetecteerd in een dergelijke controle-experimenten, wat aangeeft dat de kleuring zagen we niet was te wijten aan niet-specifieke signalen van eAlexa e-geconjugeerde antilichamen (gegevens niet getoond).

4. Microscopie en data-analyse

  1. We vangen microfoto's van coupes met behulp van Leica DFC360 FX (fluorescentie) en DFC490 (DAB en TMB gereageerd weefsel) camera's gemonteerd op een Leica DM5500 microscoop.
  2. We verwerven en analyseren van de beelden van weefselcoupes met behulp van Leica Application Suite en Leica Application Suite FX software pakketten.
  3. Microfoto van wholemounts zijn gemaakt met een Leica DFC3000 FX camera gemonteerd op een Leica MZ16 FA stereomicroscoop draait Leica Application Suite FX software.
  4. Zowel van onze microscopen zijn uitgerust met een Leica CY3 (model # 11600231) en FITC (model # 11513880) filters, en de DM5500 met een extra A4 DAPI / UV-filter (model # 11504162).
  5. Beelden worden verworven na het optimaliseren voor onder / over-exposure als bepaald met behulp van de Leica-software. Wij importeren alle ruwe data in Adobe Photoshop CS4 en indien nodig we juiste het hele veld van elke afbeelding voor scherpte, helderheid, contrast of uitsluitend op het niveau. Andere foto's te bewerken software kan worden gebruikt als voorkeur.
  6. De hier gepresenteerde schema's werden getekend in Adobe Illustrator CS4.
  7. Alexa 555 en CY3 bevlekt neuronen, die worden gedetecteerd als rood het gebruik van onze filters, waren pseudo-kleur magenta in de foto's gepresenteerd in de hele manuscript.

Dieren

Alle dierlijke studies werden uitgevoerd in het kader van een goedgekeurd IACUC dier-protocol volgens de institutionele richtlijnen van Albert Einstein College of Medicine. Mannelijke en vrouwelijke outbred Zwitserse Webster (Taconic, Albany, NY) of ingeteelde C57BL6J (JAX, Bar Harbor, ME) muizen werden gehouden in onze kolonie en wordt gebruikt voor alle onderzoeken. Uur op de dag een vaginale plug werd ontdekt werd beschouwd als embryonale dag 0,5.

5. Representatieve resultaten:

Spinocerebellaire afferente banen te beëindigen in parasagittal bands in de kleine hersenen (fig. 3; Voogd et al. 1969;. Grishkat en Eisenman 1995, Vogel-en Prittie 1994; Vig et al. 2005;. Apps en Hawkes 2009; Sillitoe et al. 2010;.. Reeber et al. 2011). We geïnjecteerd WGA-Alexa tracers in de onderste thoracale-boven-lumbale ruggenmerg aan te tonen: 1) dat deze tracers kunnen worden gebruikt om consequent etiket specifieke subsets van terminals in het cerebellum (fig. 3; Reeber et al. 2011), 2). dat de WGA-Alexa tracers zijn intens helder en kan worden gebruikt om de algemene patroon van de bemoste vezels topografie in hele cerebella (afb. 3.; Reeber et al. 2011) te visualiseren, 3) dat de WGA-Alexa 488 en 555 kan gebruikt worden in combinatie voor het opsporen van meerdere stukken in hetzelfde dier (afb. 4), en 4) dat de WGA-Alexa tracers zijn compatibel met immunohistochemische kleuring (fig. 5). In recent werk hebben we laten zien dat de WGA-Alexa tracers label terminals in het cerebellum vanaf 6 uur na het leveren van de tracer in het ruggenmerg en zijn een uitstekende keuze voor het opsporen van de Architekture van de ontwikkeling van trajecten (Reeber et al.., 2011).

Figuur 1
Figuur 1. Instellen van apparatuur voor het leveren van tracers in vivo. A. Een beeld van onze chirurgisch gebied. B. De onderste thoracale-bovenste lumbale regio kan worden geïdentificeerd door het uitvoeren van je vingers langs de wervels te voelen voor een bult in de wervelkolom. De dorsale laminectomie moet grofweg worden uitgevoerd in het midden van de "bult", die wordt aangegeven door de gele pijl.

Figuur 2
Figuur 2 Illustratie van een lagere thoracale -... De bovenste lumbale wervel segment voor en na de dorsale laminectomie A. Schematische voorstelling van een intacte wervel segment van de lagere-thoracale-hout de bovenste regio van de muis wervelkolom B. Een dorsal laminectomie wordt uitgevoerd door het verwijderen van de doornuitsteeksels van een of twee vertebrale segmenten, na het snijden van de lamina halverwege tussen de articulaire proces en de dorsale processus spinosus.

Figuur 3
Figuur 3. WGA-Alexa tracers zijn intens helder en kan worden gebruikt om afferente projectie topografie met een hoge resolutie te visualiseren. A. Het schema illustreert de oorsprong en de beëindiging van het WGA-Alexa 555 gelabeld spinocerebellaire neuronen. B. Afbeelding van een injectieplaats na het leveren van WGA-Alexa 555 in de onderste thoracale bovenste lumbale regio van de volwassen ruggenmerg. C. Wholemount beeld van de anterior melkklieren na een injectie van WGA-Alexa 555 in de onderste thoracale-boven-lumbale regio van het ruggenmerg. D. WGA-Alexa 555 anterograde tracing van de spinocerebellaire darmkanaal onthult bands van bemoste vezels zoals te zien op een coRonal weefsel sectie. De melkklieren worden gedefinieerd door de Romeinse cijfers en de cijfers label bemoste vezels bands aan beide zijden van de middellijn (geldt voor alle afbeeldingen). Schaal bars: B, C 500 micrometer, 500 micrometer D, 200 pm.

Figuur 4
Figuur 4. WGA-Alexa tracers zijn efficiënt voor het labelen van meerdere zenuwbanen in hetzelfde dier. A. Wholemount schema van de muis cerebellum een samenvatting van de algemene patroon van de spinocerebellaire bemoste vezels bands. WGA-Alexa 555 werd geïnjecteerd in de rechterkant van de lumbale ruggenmerg en de WGA-Alexa 488 in hetzelfde segment aan de linkerkant. B. Zoals te zien op een coronale weefselsectie dwars door de achterste melkklieren, zowel WGA-Alexa tracers werden getransporteerd naar de kleine hersenen en succesvol bestempeld verschillende subsets van de terminals (zie ook Reeber et al.. 2011). Afkortingen: molcular laag (ml); Purkinje cell layer (PCL), granulaat cellaag (GCL), witte stof (wm). Schaal bars: B, 100 urn.

Figuur 5
Figuur 5. WGA-Alexa tracers kunnen worden gebruikt in combinatie met immunohistochemie en histologie voor triple etikettering van neuronen en projecties. A. WGA-Alexa 555 is gestort in bemoste vezels terminals in lobulus III. B. ZebrinII vlekken onthult een scala van Purkinje cell strepen in lobulus III. C. DAPI kleuring van neuronale en gliale kernen. D. samengevoegde afbeelding van panelen A, B , en C tonen triple etikettering van afferente bands, Purkinje cel strepen, en algemene cytoarchitecture. EH. Hoge vergroting beelden van de boxed regio's getoond in panelen AD. Purkinje cell strepen zijn genummerd zoals eerder beschreven (beoordeeldin (Apps en Hawkes 2009)). Afkortingen: moleculaire laag (ml); Purkinje cell layer (PCL), granulaat cellaag (GCL). Schaal bars: D, 500 micrometer (voor AC), H 500 micrometer (voor EG).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We hebben de chirurgische en technische details die nodig zijn voor een succesvolle axonale en dendriet traceren met behulp van een nieuwe tl-gebaseerde aanpak voor snel etikettering van neurale projecties in het ontwikkelen en volwassen muizen. Met behulp van WGA-Alexa laten we zien hoe tracers en markers kan gebruikt worden voor het analyseren van patronen circuit topografie met een hoge resolutie en in drie dimensies.

Veel tracers zijn beschikbaar voor het traceren van neuronale circuits waaronder Cholera toxine subunit B, Biocytin, Neurobiotin, Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (Phal), fluororuby, fluoremerald en fluorogold. Daarnaast hebben recente genetische en virale op basis van tracers aangetoond dat moleculair verschillende neuronale subsets topografisch zijn verbonden met hun doelen met grote precisie. Merk op dat, hoewel sommige neurale tracers worden voornamelijk vervoerd in ofwel de anterograde of retrograde richting (bijv. BDA 10.000 MW ten opzichte van 3000 MW), tracer moleculen vaak vervoerd in beiderichtingen. In onze studies, introduceren we WGA-Alexa op basis van tracers als betrouwbare neuroanatomische tools voor analyse van topografische projectie patronen. We laten zien dat WGA-Alexa helder fluoresceert, snel vervoerd, en is veelzijdig genoeg om te worden gecombineerd met immunohistochemische markers waaronder die voor de kleine hersenen sagittale compartimenten (afb. 3).

Wij hebben gevonden een aantal beperkingen van het gebruik van WGA-Alexa in vergelijking met andere beschikbare neuroanatomische tracers. In tegenstelling tot de BDA (Wu et al.. 1999), hebben we eerder laten zien dat WGA-Alexa (en WGA-HRP) niet de gehele morfologie van complexe terminal eindes (Reeber et al.. 2011) laten zien. Maar we beter de waarde van de anatomische informatie verkregen uit opgespoord terminals door het koppelen van WGA-Alexa tracing met immunohistochemische kleuring voor vesiculaire glutamaat transporter 2 (VGLUT2) en cocaïne en amfetamine gereguleerd transcript peptide (CART) immunohistochemie (Reeber et al., 2011;. Reeber en Sillitoe, 2011). Eenandere tekortkoming van de WGA-Alexa is dat het signaal degradeert relatief snel op weefselcoupes, ondanks het feit dat gemonteerd in de media dat het fluorescerende signaal te beschermen. Daarom hebben we meestal het imago van de weefsel onmiddellijk na het uitsnijden, hoewel beeldvorming binnen 2 dagen na het snijden nog steeds mogelijk maakt gelabeld vezels en terminals met succes worden afgebeeld. Er is een tendens voor de WGA-Alexa signaal om de intensiteit te verliezen tijdens immunokleuring van het weefsel secties. Met minder en kortere wast tijdens de vlekken kan minimaliseren dit probleem. Een andere aanbeveling is om altijd monteren en imago een set van de getraceerd weefselcoupes op de dag van het snijden voor een referentie set te vergelijken met aangrenzende secties die zullen worden verwerkt voor immunohistochemie. In onze handen OCT (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance, CA) ingebed weefsel blokken bewaard bij -80 ° C na perfusie en cryoprotection kan worden opgeslagen voor langere tijd, zonder enig verlies van tracer intensiteit.

Onze approach voor het traceren van vezels kunnen gemakkelijk worden aangepast voor het opsporen van neurale kaarten in corticale, hersenstam, ruggenmerg en paden. We zijn momenteel het verkennen van de mogelijkheid gebruik te maken WGA-Alexa tracers voor in vivo beeldvorming van circuit-vorming in genetisch gemodificeerde dieren en voor het bestuderen van de dynamica van circuit vorming na selectieve kanaal laesies en farmacologische manipulaties. Sinds de snelle transport van de WGA-Alexa tracers zorgt voor de korte termijn analyse onze aanpak is het potentieel voor het openbaren van de dynamische veranderingen die optreden tijdens de structurele plasticiteit van topografische circuits.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de nieuwe onderzoeker start-up gelden van Albert Einstein College of Medicine van de Yeshiva University aan RVS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bead sterilizer Fine Science Tools Model Steri 250 Cat. # 18000-45
Cauterizer Fine Science Tools Cat. # 18000-00
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus Cat. # 300056
Dual stage Glass Micropipette Puller Narishige International Model 001-PC-10
Micrometer syringe Gilmont Instruments Cat. # GS-1100
Small Animal Stereotaxic Instrument Kopf Instruments Model 940-A
Electrode Manipulator Kopf Instruments Model 960
Vetcare chamber Harvard Apparatus Cat. # 340508
Heating Pad Harvard Apparatus Cat. # 341241
Leica DFC360 FX camera Leica Microsystems DFC360 FX
Leica DFC490 camera Leica Microsystems DFC490
Leica DM5500 microscope Leica Microsystems DM5500
Leica DFC3000 FX camera Leica Microsystems DFC3000 FX
Leica MZ16 FA microscope Leica Microsystems MZ16 FA
CY3 Filter Leica Microsystems Model # 11600231
FITC Filter Leica Microsystems Model # 11513880
A4 DAPI/UV filter Leica Microsystems Model # 11504162
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen Cat. #W11261
Wheat germ agglutinin, Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen Cat. #W32464

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Apps, R., Hawkes, R. Cerebellar cortical organization: a one-map hypothesis. Nat. Rev. Neurosci. 10, 670-681 (2009).
  2. Grishkat, H. L., Eisenman, L. M. Development of the spinocerebellar projection in the prenatal mouse. J. Comp. Neurol. 363, 93-108 (1995).
  3. Mesulam, M. Tracing neural connections with horseradish peroxidase. Wiley. New York. (1982).
  4. Reeber, S. L., Sillitoe, R. V. Patterned expression of a cocaine- and amphetamine regulated transcript (CART) peptide reveals complex circuit topography in the rodent cerebellar cortex. Journal of Comparative Neurology. (2011).
  5. Reeber, S. L., Gebre, S. A., Sillitoe, R. V. Fluorescence mapping of afferent topography in three dimensions. Brain. Struct. Funct. (2011).
  6. Sillitoe, R. V., Stephen, D., Lao, Z., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes determine the organization of Purkinje cell sagittal stripe gene expression in the adult cerebellum. J. Neurosci. 28, 12150-12162 (2008).
  7. Sillitoe, R. V., Vogel, M. W., Joyner, A. L. Engrailed homeobox genes regulate establishment of the cerebellar afferent circuit map. J. Neurosci. 30, 10015-10024 (2010).
  8. Vig, J., Goldowitz, D., Steindler, D. A., Eisenman, L. M. Compartmentation of the reeler cerebellum: segregation and overlap of spinocerebellar and secondary vestibulocerebellar fibers and their target cells. Neuroscience. 130, 735-744 (2005).
  9. Vogel, M. W., Prittie, J. Topographic spinocerebellar mossy fiber projections are maintained in the lurcher mutant. J. Comp. Neurol. 343, 341-351 (1994).
  10. Voogd, J., Broere, G., van Rossum, J. The medio-lateral distribution of the spinocerebellar projection in the anterior lobe and the simple lobule in the cat and a comparison with some other afferent fibre systems. Psychiatr. Neurol. Neurochir. 72, 137-151 (1969).
  11. Wu, H. S., Sugihara, I., Shinoda, Y. Projection patterns of single mossy fibers originating from the lateral reticular nucleus in the rat cerebellar cortex and nuclei. J. Comp. Neurol. 411, 97-118 (1999).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics