Utilização de Nanoestruturas Cristal plasmônicos e Fotônica para Manipulação de Micro-e Nanopartículas melhorada

Bioengineering

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Summary

Pinças plasmonic e nanoestruturas de cristal fotônico são mostradas para produzir melhorias útil no controle da eficiência e orientação dos opticamente prendendo micro e nano-partículas.

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Simmons, C. S., Knouf, E. C., Tewari, M., Lin, L. Y. Utilization of Plasmonic and Photonic Crystal Nanostructures for Enhanced Micro- and Nanoparticle Manipulation. J. Vis. Exp. (55), e3390, doi:10.3791/3390 (2011).

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Abstract

Um método para manipular a posição ea orientação das partículas submicrométricas nondestructively seria uma ferramenta incrivelmente útil para a pesquisa biológica básica. Talvez a força mais usado física para conseguir a manipulação de pequenas partículas não-invasiva tem sido dieletroforese (DEP) 1. Entretanto, DEP por conta própria não tem a versatilidade e precisão que são desejados quando da manipulação de células, uma vez que é tradicionalmente feito com eletrodos estacionários. Pinças ópticas, que utilizam um gradiente de campo três dimensional eletromagnética de exercer forças em pequenas partículas, tal versatilidade e precisão desejada. 2 No entanto, uma grande desvantagem desta abordagem é a intensidade da radiação de alta necessário para alcançar a força necessária para prender uma partícula que pode danificar as amostras biológicas 3 A solução que permite captura e classificação com menor intensidade ópticos são optoeletrônicos pinças (OET), mas OET têm limitações com a manipulação fina de pequenas partículas;.. sendo a tecnologia DEP baseada também coloca restrições sobre a propriedade da solução 4 , 5

Este artigo de vídeo irá descrever dois métodos que reduzem a intensidade da radiação necessária para a manipulação óptica de células vivas e também descrevem um método para o controle de orientação. O primeiro método é uma pinça plasmonic que usar um random nanopartículas de ouro array (AUNP) como substrato para a amostra como mostrado na Figura 1. A matriz AUNP converte os fótons incidentes em plasmons de superfície localizada (LSP) que consistem em momentos de dipolo ressonante que irradiam e gerar um campo de radiação modelado com um grande declive na solução celular. Trabalho inicial na superfície prendendo melhor plasmon por Righini et al e nossa modelagem própria têm mostrado os campos gerados pelo substrato plasmonic reduzir a intensidade inicial exigido, aumentando o campo gradiente que armadilhas a partícula. 6,7,8 A abordagem plasmonic permite multa controle de orientação de partículas elipsoidais e células com baixa intensidade óptica por causa da conversão de energia mais eficiente óptica em energia mecânica e um campo de radiação de dipolo-dependente. Estes campos são mostrados na figura 2 e as intensidades baixa armadilhas estão detalhados nas figuras 4 e 5. Os principais problemas com pinças plasmonic são de que o LSP de gerar uma quantidade considerável de calor e as armadilhas é de apenas duas dimensões. Esse calor gera fluxos convectivos e termoforese que pode ser poderoso o suficiente para expelir partículas submicrométricas da armadilha. 9,10 A segunda abordagem que iremos descrever está utilizando nanoestruturas dielétricas periódicas para dispersão de luz incidente de forma muito eficiente em modos de difração, como mostrado na figura 6 11. Idealmente, faria esta estrutura de um material dielétrico para evitar os problemas de aquecimento mesmo experientes com a pinça plasmonic mas em nossa abordagem de alumínio revestido grade de difração é utilizado como uma nanoestrutura dielétrica periódica unidimensional. Embora não seja um semicondutor, não experiência aquecimento significativo e efetivamente preso partículas pequenas armadilhas com intensidades baixa, como mostrado na figura 7. Alinhamento das partículas com o substrato ralar conceitualmente valida a proposição de que um cristal fotônico 2-D pode permitir que a rotação precisa de partículas não esféricas mícron de tamanho. 10 A eficiência destas armadilhas ópticas são aumentadas devido aos campos melhorada produzida pelo nanoestruturas descrito no este papel.

Protocol

1. Aleatória Au Fabricação Matriz Nanoparticle 8,10,12,14

  1. A matriz de nanopartículas Au é formada por primeiro criar um modelo que é feito de uma camada densa de forma aleatória adsorvido esferas de látex com diâmetro médio de 454 nm. Isto é conseguido através de evaporação de ouro primeiro em uma lamela de vidro com uma espessura de 20 nm usando o cromo como a camada de adesão.
  2. A monocamada esfera de poliestireno é então auto-montados, expondo o substrato revestidas de ouro a uma mistura de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida cloridrato (EDC), látex suspensão esfera e água desionizada.
  3. O processo de adsorção é permitido para durar cerca de uma hora e as esferas não-absorvidos são lavados com uma quantidade abundante de água.
  4. A monocamada formada é permitido secar ao ar.
  5. Finalmente, outro 20 nm de ouro é evaporado sobre a monocamada esfera de látex para formar a matriz de nanopartículas de ouro aleatória.
  6. Se um SEM está disponível, a matriz AUNP pode ser visto sob a SEM para se parecer com a Figura 1 e um diagrama do processo é mostrado na figura 8.

2. Preparação de amostras biológicas 9,11

  1. Preparação de amostras para núcleos opticamente captura do mouse célula é mostrado agora.
  2. Núcleos de células 3T3 rato marcado com corante laranja de acridina foram obtidos a partir do grupo Tewari no Fred Hutchinson Cancer Research Center.
  3. 10% albumina sérica bovina (BSA) em tampão fosfato salino (PBS) é adicionado ao núcleo das células do mouse em uma concentração de aproximadamente 1: 10 (BSA: núcleos de células de rato). A BSA ajuda a prevenir os núcleos de degola ao substrato.
  4. Misture a solução utilizando sonicação.
  5. 5 uL da nossa solução é depositada sobre a lamela matriz de alumínio ralar. É melhor para realizar esta etapa com a grade de alumínio no palco microscópio para que você não tem que transportar a amostra após a solução é depositado.
  6. Duas pilhas de dois 1 "por um" lamínulas são utilizados para apoiar uma lamela quinta através da qual a amostra é visto.
  7. Posição da amostra sob o microscópio para visualização.

3. Método para Trapping

  1. As pinças ópticas são construídas através do envio de 35 mW a laser de hélio neon através de uma Zeiss Axio Imager.D1M equipado com um 17 GFP conjunto de filtros que é modificada para permitir a 633 nm a radiação laser para alcançar a amostra.
  2. A Zeiss LD CE Epiplan - Neofluar 50x objetivo é utilizado para a imagem do núcleo das células que são cerca de 5 mícrons de diâmetro.
  3. Após a amostra é colocada no âmbito do objectivo, o foco do microscópio sobre a matriz de nanopartículas de ouro ou grade de difração.
  4. Traduzir microscópio verticalmente até foco é conseguido sobre os núcleos que você deseja armadilha.
  5. Posição à vista armadilha do laser sobre a partícula de partícula e deve então manter sua posição na área do laser, mesmo quando a fase é traduzido.

4. Resultados representativos:

O aleatório ouro procedimentos variedade de nanopartículas devem depositar uma monocamada de AUNP do que pode ser visto sob um SEM para parecer com a Figura 1. A força de armadilhas criadas por esses pinças plasmonic pode ser 10-20 vezes a força gerada pela norma pinças ópticas. As intensidades mínimas requeridas pela pinça plasmonic para alcançar o confinamento de partículas são mostrados para as partículas de diversos tamanhos na Figura 4. 9,10 A grade de difração obtidos alinhamento e prendendo com 20 vezes maior do que a eficiência de armadilhas nanopontos ouro e poderia conseguir captura com tão pouco como 17 uW um / 2 (Figura 7) 11.

Figura 1
Figura 1 10 (a) micrografia MEV das nanopartículas auto-montagem de ouro. O diâmetro das nanopartículas de ouro individual é de cerca de 450 nm. (B) imagem NSOM do substrato plasmonic onde a distribuição das nanopartículas é esparsa, mostrando a radiação de campo próximo. O comprimento de onda do laser de excitação é 633 nm. (C) exibir uma ampliação alta da área marcada com o quadrado vermelho em (b). (D) eficiência de espectro de espalhamento do substrato plasmonic, mostrando o pico de 624 nm. (E) o espectro de eficiência de absorção do substrato plasmonic, mostrando o pico em 668 nm.

Figura 2
Figura 2 13 (a) Au nanoesferas distribuídos aleatoriamente em um domínio 2D 1 x 1 2 mM. Cada ponto azul representam o centro da nanosphere (a = 60 nm). Distribuições de campo de espalhamento em aviões de observação que são paralelas à matriz nanosphere aleatórios são mostrados em (b) - (e). A matriz de nanoesferas é uniformemente iluminado por uma onda plana no comprimento de onda de 540 nm. O índice de refração do meio envolvente é 1,33. A polarization direção dos pontos de ondas planas ao longo do eixo X (horizontal no (a)). A magnitude do campo elétrico incidente é assumido como sendo um no cálculo. A separação entre o plano de observação ea matriz nanosphere é definido como h. b) h = a. c) h = 2. d) h = λ. e) h = 2λ.

Figura 3
Figura 3 9 esquemática da configuração do microscópio de fluorescência personalizado que inclui um filtro de excitação contornado e um divisor de feixe dicróico substituído. Esta é a configuração utilizada para a captura simultânea e imagens de fluorescência.

Figura 4
Figura 4 10 A intensidade do laser mínimo para manter a armadilha em função da vazão de fluido envolvente utilizando armadilhas plasmonic. Todas as intensidades ópticas são medidos no plano da amostra sob a objetiva do microscópio. (A) - (f) mostram os resultados da medição de esferas de poliestireno único com diâmetro de 7,3, 6,3 (não-esférico), 5,0, 3,9, 2,5 e 1,1 mM, respectivamente. As inserções mostram as imagens correspondentes microscópicas de partículas. As barras de escala em todas as imagens representam 5 mm de comprimento.

Figura 5
Figura 5 10 A inclinação da linha equipada com origem na figura. 4 versus tamanho de partícula para capturar plasmonic. As barras de erro mostram os desvios-padrão dos ajustes linear. A inclinação da linha ajustada (razão entre o limiar de intensidade óptica ea taxa de fluxo) na fig. 4 tem uma relação aproximadamente linear com o tamanho da partícula, como mostrado na figura, indicando a vantagem de captura plasmonic especialmente para partículas menores.

Figura 6
Figura 6 11 (a) Desenho esquemático das armadilhas ópticas melhorada utilizando 1-D nanoestruturas periódicas. O feixe incidente é difratado pela nanoestrutura periódicas em campo distante. (B) distribuição A intensidade de luz com duas polarizações ortogonais nanoestrutura em campo distante. (B) A distribuição da intensidade da luz com duas polarizações ortogonais na superfície de uma grade de alumínio com um período de 417 nm obtido por meio de simulações FDTD. A distribuição é normalizada com a intensidade sobre uma superfície plana de alumínio. (C) e (d) potencial Trapping de partículas diretamente acima da superfície grating contra localização da partícula para (c) de poliestireno de 350 nm de contas e (d) um poliestireno 1 mícron talão. Os círculos brancos ilustrar o tamanho das partículas. Inserções mostram o potencial de captura acima de uma superfície de alumínio plano para o tamanho de partícula mesma comparação. Os valores são normalizados para cada tamanho de partícula. Para todas as figuras de simulação FDTD o campo de visão é de 10 x 8 2 mM.

Figura 7
Figura 7 11 (a) eficiência de retenção e intensidade armadilhas mínima medida para esferas de poliestireno de vários tamanhos, com feixe de polarização perpendicular às linhas de grade. O encarte mostra a armadilha de assimetria na eficiência armadilhas para traduzir um 3,87 perpendicular poliestireno hum talão e paralelo às regras da grade. A linha sólida (grande assimetria) é obtido com incide perpendicularmente luz polarizada para a grade ea linha traço (pequena assimetria) é obtido com paralelos incidente luz polarizada para a grade. A unidade está em (pN [mM mW / 2] -1). (B) - (d) demonstração Trapping de um fluorescentes 590 nm de poliestireno talão. O círculo vermelho indica a posição do ponto do laser como a luz do laser era demasiado fraca para ser visto. No início, a partícula é preso dentro do local de maior poder, como o poder é reduzido o movimento browniano das partículas supera a força de armadilhas, permitindo que a partícula de escapar. (E) - (g) demonstração Trapping de um fluorescentes núcleo da célula de câncer de ovário. A intensidade mínima necessária para iniciar captura foi de 16 μW / M 2 obtido usando uma lente objetiva de 20x.

Figura 8
Figura 8 procedimento de Fabricação 14 das nanopartículas tampa em forma de ouro: a evaporação) da camada de Cr e Au fina na lamela de vidro. b) A exposição à suspensão esfera de poliestireno e adsorção de esferas por 1 hora. c) Remoção de esferas não-adsorvidos poliestireno e secagem da superfície. d evaporação) da outra camada de Au no topo das esferas modelo. e) Esquema da matriz de nanopartículas tampa em forma de Au, Au, onde só cobre o lado superior das esferas modelo.

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Discussion

A importância destes métodos de captura é que eles diminuem a intensidade óptica necessária para a captura sustentada de algum lugar na ordem de 10 3 μW M / 2 para algum lugar na ordem de 10 μW / M 2. 10,11 As limitações destas técnicas são de que a matriz de nanopartículas de ouro apresenta problemas de aquecimento que deve ser superado. Para superar este problema, uma estrutura de cristal fotônico 2D que é composto de um material dielétrico pode ser usado. Tal estrutura poderia, teoricamente, produzir armadilhas em baixas intensidades ópticas e controle de micro e nano-partículas de rotação e posição de forma precisa, controlando a polarização de entrada. Os resultados ralar nas figuras 6 e 7 mostram que isso é verdade para o caso 1D. O próximo passo seria a criação de um cristal fotônico 2D e demonstrar um cristal fotônico série pinças que facilitaria muito as aplicações de pesquisa biológica.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Gostaríamos também de agradecer a Xiaoyu Miao e Ben Wilson para o desenvolvimento de mais um dos métodos descritos dentro. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (DBI 0.454.324) e do Instituto Nacional de Saúde (R21 EB005183) e pelo PHS NRSA T32 GM07270 de NIGMS a ECK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material Name Company Catalog Number Comment
Axio Imager Microscope (D1M) Carl Zeiss, Inc. D1M Zeiss Axio Imager.D1M
Microscope Objective (50x/0.55) Carl Zeiss, Inc. LD EC Epiplan - NEOFLUAR 50x/0.55 HD DIC
Zeiss Microscope Camera (AxioCam MRc) Carl Zeiss, Inc.
Helium Neon Laser (35 mW) Research Electro-Optics
Continuously Variable Attenuator Thorlabs Inc. NDC-100C-4M For adjusting microscope intensity
Zeiss Filter Set #17 Carl Zeiss, Inc. 488017-9901-000 Filter Set #17
Microscope Slides, 0.5 mm thickness VWR international
3T3 mouse cell nuclei Fred Hutchinson Cancer Research Center Store as cold as possible
Acridine Orange dye Fred Hutchinson Cancer Research Center
Bovine Serum Albumin, 1 to 10 ration in PBS Fred Hutchinson Cancer Research Center
454 nm polystyrene latex spheres Polysciences, Inc.
carbodiimide hydrochloride (EDC) - 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) G-Biosciences BC25-1
gold (for deposition)
Reflective ruled diffraction grating Edmund Scientific
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) Invitrogen 14190-144

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References

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