Scale-Up von Mammalian Cell Culture mit einem New Mehrschichtige Flask

Biology
 

Summary

Zellen spielen eine instrumentale und wachsende Rolle in der Forschung und der Entdeckung und Entwicklung neuer Therapeutika. Mit diesem steigenden Bedarf an größeren Anzahl von Zellen brauchen wir effizientere und effektivere Wege für den Anbau und die Ernte Anlage abhängigen Zellen. Eine mehrschichtige Kolben mit den richtigen Features können diesem Zweck dienen.

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Abraham, E. J., Slater, K. A., Sanyal, S., Linehan, K., Flaherty, P. M., Qian, S. Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask. J. Vis. Exp. (58), e3418, doi:10.3791/3418 (2011).

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Abstract

Eine wachsende Zahl von Zell-basierte Anwendungen erfordern eine große Anzahl von Zellen. Verwendung von Single Layer T-Flaschen, die ausreichend sind während der kleinen Erweiterung kann schwerfällig, umständlich und zeitaufwendig, wenn eine große Anzahl von Zellen notwendig sind. Um diesen Bedarf, die Leistung eines neuen mehrschichtigen Zellkulturgefäß eine einfache Skala Erleichterung der Gründung von Zellen aus einschichtigen T-Flaschen werden diskutiert. Die Kolben getestet werden in 3 - und 5-Schicht-Format und damit Kultur und vollständige Wiederherstellung der drei-bis fünfmal die Anzahl der Zellen im Vergleich zur T-175 Flaschen. Ein wesentliches Merkmal der BD Multi-Flask ist eine Mischung / Equilibrierung Port, schneller ermöglicht in-vessel Mischen sowie eine gleichmäßige Verteilung von Zellen und Reagenzien innerhalb und zwischen den Schichten der einzelnen Schiffe und konsequent zu produzieren Zellen, die in einer Umgebung, die kultiviert werden können ist kongruent zu T-175 Flaschen.

Das Design dieser Multi-Flaschen ermöglicht auch convenient Pipette Zugang zur Zugabe von Reagenzien und Zellen direkt in den Kolben sowie eine effiziente Rückgewinnung von wertvollen Zellen und Reagenzien und reduziert das Risiko der Kontamination durch Gießen. Für Anwendungen, bei denen Gießen über Pipettieren bevorzugt wird, kann das Design für minimal residual Flüssigkeitsretention, um Verschwendung von wertvollen Zellen und Reagenzien zu reduzieren.

Protocol

1. Protokoll zum Multi-Flaschen für die Zellkultur Einsatz

  1. Vorbereitung der Schiffe und das Hinzufügen von Zellsuspension
    1. Bereiten Sie das Zellwachstum Medium, wie gebraucht.
    2. Line up Multi-Flask vertikal auf die Seite mit der Kappe nach oben auf die Arbeitsfläche (sterile Laminarströmungshaube).
      1. Diese Kolben sind in 3 und 5-Schicht-Formate und verwenden ein ähnliches Work-Flow-Muster als T-175 Kolben.
    3. Lösen und entfernen Sie caps. Fügen Sie benötigte Menge an vorgewärmten Medium in Kolben mit einem 50 oder 100 mL Pipette oder durch Ausgießen.
      1. Pipetten sind, die ≤ 10 ml kann der Boden des Gefäßes zu erreichen, wenn Multi-Flaschen vertikal mit Kappe nach oben gelegt werden. Pipetten ≥ 10 ml in das Gefäß sofort erreichen vergangenen Logo auf der Multi-Flask, wodurch eine komfortable Portal größere Mengen an Medien Schiff hinzuzufügen.
    4. Zur Vermeidung von Blasenbildung des Mediums erlauben Flüssigkeitsstrom zu flow entlang der Innenwand des Multi-Flask Deckel (logo-Seite).
    5. Add Zellsuspension aus einer konzentrierten Zelle Lager in Wachstumsmedium durch die obere Schicht mit einem 10-ml-Pipette und Kappe Flaschen.

      Tipps:

      - Transport Multi-Flaschen auf einem Wagen zum Inkubator Ort und führen verbleibenden Schritte.
      - Die Zelle Aussaatdichte variiert je nach Zelltyp, mittel-und Kultur Dauer benötigen. Beginnen Sie mit der Aussaatdichte und Medien Lautstärke auf, dass im Standard-T-175 Flaschen verwendet und vermehren sich durch 3 oder 5 in Abhängigkeit von der Multi-Flask-Format verwendet.

  2. Mischen der Zellen
    1. Mix Position: Halten Sie den Multi-Flask aufrecht mit dem Logo nach Ihnen und wiederum gegen einen 45 °-Winkel im Uhrzeigersinn mit Mix-Anschluss nach oben ein.
    2. Halten unter dem gleichen Winkel, sanft kippen Multi-Flask von vorne nach hinten (Hals von Ihnen weg), bis die Flüssigkeit in der oberen Schicht fließt vollständig downwards durch den Mix-Port. Pivot auf Mix-Port-Seite.
    3. Ebenso sanft Rock Multi-Flask von hinten nach vorne (Hals nach dir) bis mittleren Abflüsse in vollem Umfang von der unteren Schicht nach oben hin durch den Mix-Port. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.2 und 1.2.3 ein weiteres Mal, um die ordnungsgemäße Durchmischung sicherzustellen.
    4. Bringen Sie Multi-Flask zurück zur Mix-Position (Schritt 1.2.1) und fahren bis 1,3 Schritt
    5. Alternativ können Zellsuspension extern aus dem Multi-Kolben hergestellt werden und Zellsuspension kann das Schiff mit einer Pipette oder durch vorsichtiges Gießen aufgenommen werden.
      1. Mix-Port ermöglicht in-vessel Mischen von Zellen mit Medien und beseitigt die Notwendigkeit, große Mengen von Zellsuspensionen extern zu machen.
      2. Es ermöglicht auch Medien Ausgleich über die Schichten des Multi-Flask
  3. Äquilibrierung von Flüssigkeit
    1. Nach dem Mischen / Zugabe der Zellsuspension, um Platz Multi-Flask senkrecht auf einer ebenen Arbeitsfläche auszugleichen Flüssigkeitsvolumen Gleichunglly in allen Schichten.
  4. Partition Flüssigkeit in jeder Schicht
    1. Halten Sie den Multi-Flasche mit dem Logo nach Ihnen und einem 45 ° Winkel zu partitionieren die Flüssigkeit in jeder der Schichten im Uhrzeigersinn drehen.

      Tipp:

      - Für beste Ergebnisse ist es wichtig, eine ebene Arbeitsfläche für Steps 1,3-1,4 verwenden

  5. Transport
    1. Sobald Medien mit Zellsuspension wird partitioniert, Transport Multi-Flask gleichzeitig Winkel von 45 ° (im Uhrzeigersinn) wie in Schritt 1.4.1 mit den Medien vom Mix-Port in Inkubator. Diese Position eignet sich auch bei der Entfernung von Flaschen aus Inkubator für die Wiedergabe auf einem Mikroskop.
  6. Platzieren Multi-Flask auf Inkubator Regal
    1. Halten Multi-Flask im Winkel von 45 ° (im Uhrzeigersinn, weg von Mix-Port), drehen Sie ihn leicht nach unten waagerecht auf dem Inkubator Oberfläche (unter Verwendung der Ecke weg von der Mix-Port alsPivot). Lay Multi-Kolben mit Logo nach oben zeigt.
      1. Falcon Multi-Flask Design ermöglicht Schiffen gestapelt werden und hält sie an ihrem Platz durch ein robustes Stacking Rippe.
  7. Verteilung von Zellen und Reagenzien
    1. Nach der Platzierung Multi-Flask flach auf Arbeitsfläche, sanft hin und her Rock-und Seiten-und her, um Zellen gleichmäßig zu verteilen auf Kultur Oberflächen dabei nicht um Flüssigkeit aus jeder Schicht zu verschütten. Stack-Flaschen.
      1. Dieser Kolben wird von optisch klaren Material und Zellen auf der letzten Schicht kann leicht an einem Mikroskop betrachtet werden.
  8. Medien Austausch
    1. Saugen Sie beim Kippen der Multi-Flask auf der linken Seite (mix-Port-Seite) mit dem Logo zu Ihnen zeigt.
    2. Dann kippen, die Multi-Flask nach rechts, weiterhin alle restlichen Medien absaugen.
    3. Fügen Sie entsprechende Menge an Medien und führen Sie die Schritte 1,3-1,7

2.Ernten von Zellen aus Multi-Flaschen

  1. Um Zellen, line up Multi-Flaschen senkrecht distanzieren und bringen jeden in die Position (Schritt 1.2.1) Mix. Vorsichtig auf den Kopf Flaschen mit dem Hals nach oben ein, um damit Medien auf die oberste Schicht der Multi-Flask abtropfen lassen.
  2. Legen Sie eine 5 oder 10 mL Absaugen Spitze durch den Hals, bis Sie Flüssigkeitsstand in der Nähe des Mix-Anschluss zu erreichen. Saugen Sie erschöpft Medium.
  3. Add Dissoziation Reagenz / Waschpuffer und bringen zu positionieren, wie in Schritt 1.2.1 Mix, dann gehen Sie und folgen Sie den Schritten von 1,3 bis 1,7. Neutralisieren mit Wachstumsmedium / Neutralisationsmittel und gießen Zellsuspension in ein Aufnahmerohr oder Invertzucker Kolben, so dass Zellen ablaufen die obere Schicht des Schiffes und sammeln Zellen mit Hilfe einer 10 ml Pipette.

    Tipp: Um Rückgewinnung von Zellen oder Reagenzien zu verbessern, bringen Multi-Flask zu positionieren (Schritt 1.2.1) mischen, kehren mit dem Hals in Richtung Bediener komplette Entwässerung von Medien aus al erlauben l Schichten auf die oberste Schicht. Dann kippen Multi-Flask zu 45 °-Winkel (weg von der Mix-Port) im Uhrzeigersinn drehen, während der Multi-Flask bleibt invertiert. Mit einer Pipette (1-10 mL), um alle verbleibenden Reagenzien sammeln.

3. Empf. Arbeitsvolumen in Falcon Multi-Flaschen

Nährmedien

3-Schicht: 75-150 ml pro Multi-Flask
5-Schicht: 125-250 ml pro Multi-Flask

Dissoziation Agent

3-Layer: ≥ 15 ml pro Multi-Flask
5-Schicht: ≥ 25 ml pro Multi-Flask

Tipp: Beginnen Sie mit mittlerer Lautstärke in Standard-T-175 Flaschen verwendet und vermehren sich durch 3 oder 5 mal in Abhängigkeit von der Multi-Flask-Format ausgewertet, so dass mL pro Flächeneinheit gleich bleibt.

4. Repräsentative Ergebnisse:

1. Design von Falcon Multi-Flask

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. Abbildung 1: Multi-Flask Zellkulturgefäße werden in einem 3 - und 5-Schicht-stapelbar Format für Scale-up von Zellen bieten 525 und 875 cm 2 Wachstum Oberfläche, bzw.. Pipette Zugang erleichtert Hinzufügen und Entfernen von Zellen und Reagenzien in-und außerhalb des Schiffes. Anwesenheit von Mix-Anschluss erlaubt eine schnelle in-vessel Misch-und Ausgleichsbecken von Medien in allen Schichten der Multi-Flask.

. 2 Cell Yield mit Multi-Flask:

Diese Schiffe sind im 3-Schicht-und 5-Schicht-Formate, die bis 3 entsprechen und 5-mal die Fläche des T-175 Flaschen zur Verfügung. Dementsprechend ≥ 3 und 5-mal (130 ± 6,8 x 10 6 und 218 ± 23,6 x 10 6 Zellen, bzw.) die Anzahl der BHK-21 (baby hamster kidney) Zellen wurden gezüchtet und erholte sich von Multi-Flask im Vergleich zu T-175 Flaschen (43,2 ± 3,5 x 10 6 Zellen; Abb.2a). Zell-Ertrag pro unit Oberfläche wurde in 3 entspricht - und 5-Schicht-Multi-Flaschen und T-175 Flaschen für BHK-21, LNCaP (menschlichen Prostata-Adenokarzinom-Zelllinie), Hep-G2 (human Hepatokarzinom Zelllinie), EcoPack 2-293 (human Nieren-Zelllinie) für einen Zeitraum von 48-96h (Abb.2b) in Nährmedien (35 ml pro Schicht), wie Zelle Anbieter (ATCC, Sigma und / oder Clontech) empfohlen kultiviert. Die Zellen wurden auf einem automatischen Vi-CELL-Zähler (1) aufgezählt.

2A
Abbildung 2A: Drei bis fünf mal die Anzahl der BHK-21 Zellen wurden gezüchtet und von 3 erholt - und 5-Schicht-Multi-Flaschen im Vergleich zu T-175 Flaschen. Erwartete Rendite wurde mit meinen Zellausbeute von der Steuerung T-175 Flaschen von drei und fünf Mal für die 3 multipliziert - und 5-Schicht-Multi-Flaschen bzw. (n = 4 Flaschen / Format).

2B
2B: Cell Ertrag pro cm 2 wurde in 3 entspricht - und 5-Schicht-Multi-Flaschen und T-175 Flaschen für BHK-21, LNCaP, HepG2 und EcoPack2-293-Zellen. Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert von 4 bis 6 Flaschen. BHK-21-Zellen (11.000 Zellen/cm2) wurden für 72 Stunden, LNCaP-Zellen (20.000 Zellen/cm2) und EcoPack2-293-Zellen (~ 35.000 Zellen/cm2) kultiviert wurden für 96 Stunden und HepG2-Zellen (25.000 Zellen / cm 2 kultiviert ) wurden 48 Stunden vor der Ernte kultiviert.

3. Medienverteiler unter Schichten von Multi-Flask

Zellkulturmedium (DMEM; Invitrogen) wurde auf 5-Schicht-Multi-Flaschen (250 mL/5-layer Schiff) zugegeben und partitioniert in Schichten nach oben beschriebenen Protokoll. Medien Verteilung wurde durch Bohren von Löchern in jeder Schicht und Medien aus einzelnen Schichten gepumpt gemessen. Gewicht von Flüssigkeit aus jeder Schicht wieder erwies sich als relativ einheitlich von Schicht zu Schicht, wie in Abb. 3 dargestellt. Sie sind wie folgt: 510,8 ± 0,73, 50,3 ± 0,58, 50,21 ± 0,13, 49,88 ± 0,35, 49,45 ± 0,37 (gm).

Abbildung 3
Abbildung 3. Uniform Medien Verteilung in jeder der fünf Schichten eines 5-Schicht-Multi-Flask. Zellkulturmedium wurde Multi-Flaschen (250 ml/5-layer Schiff), äquilibriert und partitioniert werden, um einzelne Schichten aufgenommen. Die Medien wurde durch die Löcher in einzelne Schichten und Flüssigkeit Gewicht gebohrt gepumpt wurde aus jeder Schicht (n = 6 Flaschen) aufgenommen.

4. Zellverteilung zwischen Lagen von Multi-Flask

Die Zellen können hinzugefügt und gemischt werden innerhalb des Multi-Flask. Wir simulierten Verteilung der Zellen zwischen den Schichten des Multi-Flask mit Perlen (10 um; Polysciences Inc.) eine ähnliche Größe wie Zellen. Bead Suspension wurde in Multi-Flask Schiff mit einer 10 ml Pipette durch die obere Schicht zugegeben und vermischt mit den Medien in das Schiff als described in das Protokoll über. Bead Verteilung wurde durch Bohren von Löchern in jeder Schicht und Flüssigkeit mit Bead-Suspension erfolgte aus einzelnen Schichten gepumpt gemessen. Bead-Konzentration aus jeder Schicht wieder auf einem Coulter Counter abgelesen und notiert. Hier findest du entsprechende inter-layer bead-Distributionen im 3-Schicht Multi-Flaschen (Abb. 4a). Der Mix-Anschluss ermöglicht die homogene Verteilung der Zellen und Reagenzien zwischen Multi-Flask Schichten.

Abbildung 4A
Abbildung 4A: Bead Verteilung in jeder der drei Schichten eines 3-Schicht-Multi-Flask. Eine Suspension von Perlen (3,6 x10 6 / ml) wurde auf Medium in Multi-Flaschen verzichtet hinzugefügt (Bead-Suspension: media Volumen beträgt 1:10, vol: vol) und gemischt, gefolgt von Gleichgewichts-und-Trennung mit Hilfe des Protokolls beschrieben. Bead-Konzentration aus jeder Schicht (Medium, durch Löcher auf jeder Schicht gebohrt gepumpt wird) wieder auf einem Coulter Count lesener und aufgezeichnet. Hier findest du entsprechende inter-layer bead-Distributionen in 3 - Schicht Multi-Flaschen (n = 5 Flaschen)

Hier findest du repräsentative Bilder von Ecopack 2-293 Färbungsmuster von Zellen gezüchtet, um> 80% Konfluenz auf 3-Schicht-Multi-Flaschen in ergänzt das Wachstum Medien. Zellmonoschichten wurden fixiert und mit Kristallviolett gefärbt und Multi-Flask Schichten wurden dann abgeschnitten und Bilder gescannt (2). Beachten Sie, Zelle Musterung war homogen auf alle Schichten der Multi-Flask (Abb.4b). Ähnliche Ergebnisse wurden mit verschiedenen Zelltypen untersucht (Daten nicht gezeigt).

4B
4B: Diese Abbildung zeigt homogene Zellwachstum zwischen den Schichten des Multi-Flaschen. Ecopack-2-293 Zellen gezüchtet, um> 80% Konfluenz in 3-Schicht-Multi-Flaschen und T-175 wurden fixiert und mit Kristallviolett gefärbt. Multi-Flask Schiffe wurden geschnitten und jedes gefärbte Schicht wurde durchsucht.

5 Air Supply in Multi-Flask.:

Analyse verbracht Medien mit BioProfile FLEX-Analysator (3,4) (Nova Biomedical) aus EcoPack2-293-Zellen für 96 Stunden kultiviert zeigten keinen Unterschied in der Sättigung der Zellen in 5-Schicht-Multi-Flaschen vs T-175 Flaschen (81,03 gestiegen ± 1,9 vs 83,4 ± 5,8% Umgebungstemperatur O 2).

Abbildung 5
Abbildung 5: Air-Sättigung (% Umgebungstemperatur O 2) von verbrauchten Medien waren in pre-mixed media aus 5-Schicht-Multi-Flaschen vs T-175 Flaschen. EcoPack2-293-Zellen wurden in einer Dichte von 35.000 Zellen / cm 2 ausgesät und kultiviert für 96 Stunden vor der Media-Analyse (n = 3 Flaschen).

Discussion

Die aktuelle Studie zeigt die Steigerung der Produktivität, dass die Multi-Flask Design Forschern bietet. Zwar ist es wichtig, dass die oben genannten Schritte für eine optimale Leistung skizzierte bei der Verwendung von Multi-Flaschen folgen, gibt es nur wenige kritische Schritte in diesem Protokoll, das als wichtigste sind. Dazu gehören (i) Mischen von Zellen und Reagenzien mit dem Mix-Port innerhalb des Gefäßes (ii) den Transport von Multi-Kolben bei 45 °-Winkel nach Partitionierung Flüssigkeit in jeder der Schichten (iii) zur Multi-Flask flachen post Aufteilung in Uhrzeigersinn Inkubator.

Der richtige Einsatz von Multi-Flask führt zur Produktion eines homogenen Zellpopulation innerhalb jedes Schiff, das in einer Umgebung, die kongruent zu T-175 Flaschen (5) ist kultiviert wird. Diese Schiffe verfügen über 3 und 5 mal mehr Zellen in einem ähnlichen Abmessungen wie der T-175 Kolben. Die 3 und 5-Schicht-Schiff bietet 525 und 875cm 2 von Wachstum-, respektive und bieten sowohl Platz als auch Arbeits-savings für die Nutzer. Tissue Culture Oberflächenbehandlung ist vergleichbar mit Standard-Flaschen so dass Scale-up, ohne die Notwendigkeit einer erneuten Optimierung der bestehenden Kultur Bedingungen oder Kompromisse bei der Qualität, Homogenität oder die Leistung der Zellen (6, 7). Dies bietet auch für die Vergleichbarkeit mit den zuvor gesammelten Daten. Diese Schiffe können auch mit Reagenzien wie Kollagen beschichtet werden, Fibronectin, Poly-D-Lysin an einen spezialisierten Substrat für den Anbau, Wachstum und Differenzierung von bestimmten Zelltypen wie Leberzellen 8, kertainocytes 9, Stammzellen in serum-freiem Medium gezüchtet bieten Formulierungen. Coating-Lösungen können mit minimal residual Flüssigkeitsretention entfernt werden, um Verschwendung von wertvollen Reagenzien sowie eine effektive Entfernung der Beschichtung Lösung vor der Kultivierung von Zellen zu reduzieren. Die empfohlene optimale Datenträger zur Kultivierung von Zellen in Multi-Kolben Bereich von 0,142 bis 0,287 ml / cm 2, die mit 25-50 ml pro Schicht zu übersetzen. Im Gegensatz zu anderen vielschichtigen Kolben, tseinem Produkt bietet eine Mischung-Port in das Gefäß, das eine schnelle in-vessel Mischen sowie eine gleichmäßige Verteilung von Zellen und Reagenzien innerhalb und zwischen den Schichten der einzelnen Schiffe ermöglicht. Diverse Zelllinien, primären Kulturen und Stammzellen wurden bis effizient skaliert mit Multi-Flaschen. Diese Schiffe sind besonders vorteilhaft für Anwendungen, die eine große Zahl von Zellen, wie im High-Throughput-Screening, zur Herstellung von Impfstoffen, viraler Vektor Transfektionen und Zelltherapie zu verlangen.

Einsparungen in Zeit, Raum, Arbeit und verringert das Abfallaufkommen sind der Schlüssel Gewinne der Multi-Flask im Vergleich zu herkömmlichen Kulturen in einschichtigen Behältern. Wir können Kultur etwa das Dreifache der Zahl der Zellen ab 5 geerntet, T-175 Flaschen im gleichen Raum mit 3, 5-Schicht-Multi-Flaschen. Dieser Vorteil in platzsparender ist nicht nur auf T-175 beschränkt, sondern kann auch auf andere Schiffe ausgedehnt werden: ein Standard Rollflasche Apparat, der in gemeinsamen Labor Inkubatoren Häusern passt ~ 4 roller Flaschen (2200 ml), die jeweils 850cm 2-Oberfläche zur Verfügung stellt. In der gleichen Gegend, kann ~ 20, 5-Schicht-Multi-Flaschen untergebracht wodurch fünfmal das Wachstum Oberfläche zur Kultivierung von Zellen sein. Darüber hinaus mit einem Anstieg in der "Go-Green" Bewusstsein ist Optionen, um das Abfallaufkommen zu reduzieren höchst wünschenswert. In dieser Hinsicht gibt es einen 38% (5, T-175 Flaschen wiegen ~ 640g, während einer, 5-Schicht-Multi-Flask wiegt ~ 400g) Rückgang des Abfallaufkommens mit Multi-Flaschen im Vergleich zu T-175 Flaschen und diese Vorteile führen in Abfällen Lager-und Entsorgungskosten und führen zu wirtschaftlichen Einsparungen für den Benutzer zu verringern.

Disclosures

Alle Autoren sind Mitarbeiter von Becton Dickinson, Biosciences Segment, Discovery Labware Unit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-layer Tissue Culture-treated 525cm2 BD Biosciences 353143
5-layer Tissue Culture-treated 875cm2 BD Biosciences 353144
100ml pipette BD Biosciences 357600
10 ml pipette BD Biosciences 357551
5 ml aspirating pipette BD Biosciences 357501
50 ml Polypropylene conical tube BD Biosciences 352070
T-175 flask Tissue Culture-treated BD Biosciences 353028
Gram Crystal Violet BD Biosciences 212525
DMEM Invitrogen 11885
GMEM Sigma-Aldrich G5154
RPMI-1640 ATCC 30-2001
MEM ATCC 30-2003
Trypsin-EDTA Lonza Inc. CC-5012
Fetal Bovine serum Invitrogen 16000-044
Tryptose Phosphate Broth Sigma-Aldrich T8159
BHK-21 cells Sigma-Aldrich 85011433
Hep-G2, LnCAP ATCC
Ecopack 2-293 Clontech Laboratories
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polystyrene Bead Polysciences, Inc. 24628-20
Bio-Profile Flex Analyzer Nova BioMedical

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szabo, S. E., Monroe, S. L., Fiorino, S., Bitzan, J., Loper, K. Evaluation of an automated instrument for viability and concentration mesurements of cryopreserved hematopoietic cells. Lab. Hematol. 10, 109-109 (2004).
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Comments

2 Comments

  1. The video did not display. Sound was fine.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 1, 2012 - 4:53 PM
  2. The video and sound did not run.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 20, 2012 - 8:30 AM

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