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Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

Biology

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Summary

Hemos desarrollado una técnica para probar interacciones proteína-proteína en las plantas. Una proteína amarilla fluorescente (YFP) se divide en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés a través del sistema de puerta de enlace, lo que permite la expresión de proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación.

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Tian, G., Lu, Q., Zhang, L., Kohalmi, S. E., Cui, Y. Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System. J. Vis. Exp. (55), e3473, doi:10.3791/3473 (2011).

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Abstract

Hemos desarrollado una técnica BiFC para probar la interacción entre dos proteínas in vivo. Esto se logra mediante la división de una proteína amarilla fluorescente (YFP) en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés. Estas construcciones se pueden co-transformado en Nicotiana benthamiana a través de la transformación mediada por Agrobacterium, permitiendo la expresión de tránsito de las proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación 1-7. Para probar y validar las interacciones proteína-proteína, BiFC se puede utilizar junto con la levadura de dos híbridos (Y2H) ensayo. Esto puede detectar interacciones directas e indirectas que se puede contemplar en el Y2H. La tecnología Gateway es una plataforma universal que permite a los investigadores para llevar a los genes de interés (GOI) como la expresión en muchos sistemas de análisis funcional como sea posible 8,9. Tanto la orientación y el marco de lectura se puede mantener sin el uso de enzimas de restricción o la ligadura de expresión para hacer listas para clones. Como resultado, se pueden eliminar todos los pasos de la secuencia de nuevo para asegurar resultados consistentes a lo largo de los experimentos. Hemos creado una serie de vectores Gateway compatible BiFC y Y2H que proporcionar a los investigadores y fácil de utilizar herramientas para llevar a cabo ensayos tanto BiFC y Y2H 10. Aquí se demuestra la facilidad de uso de nuestro sistema BiFC para probar interacciones proteína-proteína en N. benthamiana plantas.

Protocol

1. Preparación de cultivo de Agrobacterium

  1. Cepa de Agrobacterium GV3101 previamente transformada con Gateway compatible BiFC vector pEarleyGate201-YC y pEarleyGate202 YN-, cada uno con una construcción de fusión de Gobierno de la India.
  2. Inocular un 5 ml YEB (5 g L -1 extracto de carne, 1 g L -1 extracto de levadura, 5 g L -1 de peptona, 5 g L -1 de sacarosa, 2 mM MgSO 4, pH 7,2) la cultura de la proteína de fusión BiFC construye Agrobacterium transformado con el selección del antibiótico adecuado. Cultive hasta el día en 28 ° C con agitación a 200 rpm.
  3. Retire 1 ml de la cultura en un tubo de centrífuga estéril de 1,5 ml.
  4. Precipitar las células a 1.000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, eliminar el sobrenadante.
  5. Lavar el sedimento mediante la adición de 1 ml de los medios de infiltración (5 g L-1 D-glucosa, 50 mM MES (Sigma), 2 mM Na 3 PO 4, 0,1 mM acetosiringona) 11. Resuspender pellet con la pipeta, las células de pellets de nuevo a 1.000 g durante 10 minutos.
  6. Repita el paso de lavado dos veces más.
  7. Resuspender el precipitado en 0,5 ml de medio de infiltración.
  8. Medir la absorbancia a 600 nm y ajustar el final de OD 600 a 1,0 a 1,2.
  9. Alícuota de una cantidad igual de suspensión de Agrobacterium de cada construcción en un tubo de 1.5 ml nuevo, vortex durante 10 segundos. Para una sola infiltración, 100 L de cada construcción es más que suficiente.
  10. La mezcla de Agrobacterium está listo para la infiltración.

2. Infiltración

  1. Plantas de N. benthamiana se cultivan a 21 ° C, con 16 horas de luz y 8 h oscuridad ciclos. Cinco de las plantas de seis semanas de edad, se debe utilizar para la infiltración.
  2. Retire las plantas de la sala de crecimiento y de lugar en la luz blanca durante 1 h antes infiltratring que permite que los estomas se abra completamente.
  3. Elaboración de mezcla Agrobacterium resuspendió en un 1 ml de deslizamiento punta de la jeringa de tuberculina sin aguja.
  4. Coloque la punta de la jeringa contra la parte inferior de la hoja y suavemente el émbolo, mientras que apoyan directamente la parte superior de la hoja con un dedo. El líquido se difunden a través de la hoja, ya que llena los espacios de aire mesophyllar.
  5. Etiqueta de la zona infiltrada con un marcador para la identificación futura.
  6. Cuando la infiltración con diferentes construcciones, asegúrese de que cambie sus guantes o limpiar con etanol al 70% entre las infiltraciones. Si es posible, deje un espacio nervio central entre las diferentes muestras para evitar la contaminación cruzada.
  7. Colocar las plantas en un armario de crecimiento bajo condiciones normales de crecimiento.

3. Observación de la señal de YFP reconstituido

  1. Al consumo de un segmento 5mm x 5mm de tejido de las hojas dentro de la zona infiltrada
  2. Montaje de la muestra, en el agua, en un portaobjetos de vidrio, cubrir la muestra con un cubreobjeto y examinar las interacciones con un microscopio confocal o de fluorescencia.
  3. Expresión deben ser controlados cada 24 horas desde el momento de la infiltración de hasta 5 días después de la sobre-expresión / la trata puede dar lugar a proteínas de fusión fluorescentes mostrando diferentes lugares durante un transcurso de tiempo.

4. Los resultados representativos:

Un ejemplo de interacción proteína-proteína a prueba mediante un ensayo BiFC se muestra en la Figura 1. AtTHP1 AtSAC3A y se cree que son los componentes de la Arabidopsis homólogo de la levadura-2 TREX complejo. Pueden interactuar con un AtNUP1 nuclearporin y facilitar la exportación del ARNm 10. AtTHP1 y AtSAC3A fueron clonados en pEarlyGate201-YC mientras AtNUP1 fue clonado en pEarlyGate202-SN. Las construcciones se transformaron posteriormente en GV3101. Las tres construcciones fueron emparejados con tres combinaciones posibles (AtTHP1 + AtNUP1; AtTHP1 + AtSAC3A; AtNUP1 AtSAC3A +) para la infiltración. La reconstitución de la señal YFP se observó bajo un LCSM 48 horas después de la infiltración. Las señales se han observado en las células epidérmicas y localizadas en la periferia nuclear o plasma nuclear, lo cual es consistente con la localización subcelular de estas proteínas. Los controles negativos no mostraron ninguna señal de YFP.

Figura 1
Figura 1. Arabidopsis TREX-2 componentes de exportación de ARNm complejo interactúan unos con otros. N. benthamiana hojas, co-transformadas con construcciones de Gobierno de la India fusionado a pEarleyGate201-YC y pEarleyGate202-SN (como se indica), se obtuvieron imágenes de 48 a 72 h después de la infiltración, utilizando un microscopio Leica TCS SP2 confocol. Las imágenes se muestran como YFP fusión confocal y brillantes imágenes de campo de la epidermis N. benthamiana hoja de células

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Discussion

BiFC ensayo es una herramienta poderosa para el estudio de las interacciones proteína. A diferencia de la tradicional prueba de Y2H, BiFC no sólo permite la visualización de las interacciones proteína-proteína, sino que también proporciona más información sobre el complejo de proteínas, tales como localización subcelular. Además, es posible detectar interacciones directas e indirectas, siempre y cuando las dos proteínas candidatas pueden acercarse lo suficiente por un tercer socio. Como cualquier tecnología, BiFC tiene sus limitaciones. Debido a la necesidad de oxígeno molecular para la formación de fluoróforo, BiFC no se puede utilizar en anaerobios estrictos, que no pueden sobrevivir en presencia de oxígeno. Esto limita el uso de BiFC a los organismos aeróbicos 6. La formación de complejos fluoróforo es irreversible. Esto evita que las proteínas de la interacción con otras personas y puede alterar la asociación y la disociación de los complejos de proteínas en el equilibrio dinámico 6. Sin embargo, esta irreversibilidad también nos permite visualizar las interacciones débiles o de tránsito. Fragmentos de la proteína fluorescente tienen una capacidad limitada para asociar independiente de las proteínas a las que se fusionan. Se debe proporcionar los controles necesarios y numerosos para distinguir entre las interacciones proteína verdadera y falsos positivos-6. Además, como la reconstitución fluoróforo puede ocurrir a una distancia de 7nm o más, la complementación de fluorescencia puede indicar una interacción directa o indirecta. Es necesario utilizar otros métodos como Y2H o Co-inmunoprecipitación para poner a prueba la relación de interacción exacta 7.

Con el fin de generar datos fiables, los controles adecuados se debe utilizar para la interpretación de los resultados. Los vectores vacíos no deben ser directamente utilizados como controles, ya que contienen el fragmento de puerta de entrada típica entre attr1 attR2 y cassettes. Por lo tanto, estos vectores vacíos no son realmente "vacío". Para superar este problema, por lo general utilizan un par de proteínas no relacionadas fusionado a los vectores como control. Otro problema potencial es la auto-fluorescencia de las células vegetales, especialmente de plantas viejas o estresado. Investigadores inexpertos deben mirar primero en una muestra de la zona uninfiltrated para familiarizarse con el fondo fluorescente.

Recientemente, los métodos más BiFC basado han sido desarrollados para ampliar aún más las aplicaciones de la prueba BiFC a diversos aspectos de las proteínas, el ARN-proteína interacciones 12, y la hibridación de ADN 13. Por ejemplo, multicolor y BiFC BiFC basada en FRET (BiFC-FRET) de ensayo se han desarrollado para identificar y visualizar los complejos ternarios de las células vivas 14.

La combinación de la puerta de enlace y BiFC es una poderosa herramienta para los investigadores que buscan entender las interacciones de proteínas en las células intactas. Las construcciones utilizadas en nuestro sistema BiFC también se puede utilizar para generar plantas transgénicas estables para visualizar las interacciones proteína más dinámico en los diferentes tejidos y en diferentes etapas de desarrollo que no pueden ser observados en el sistema de expresión transitoria. Hemos incorporado una etiqueta HA y una etiqueta de FLAG en nuestros vectores BiFC (pEarleyGate201-YC y pEarleyGate202 YN-), respectivamente. Esta modificación hace posible que diferentes aplicaciones de aguas abajo, como el Western Blot, Co-inmunoprecipitación y purificación de la afinidad, etc, después de la visualización de las interacciones.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Damos las gracias a Nguyen Vi por leer el manuscrito y la asistencia de laboratorio en general.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
MES hydrate Sigma-Aldrich M2933
1 mL slip-tip tuberculin syringe BD Biosciences 309602

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References

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