Вовлечение рост дендритов в культуре симпатических нейронов

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Мы опишем протокол для использования костных морфогенетических белков-7 (BMP-7) или Матригель выборочно стимулировать рост дендритов в первичных симпатических нейронов в отрыве от верхних шейных ганглиев (SCG) перинатальной крысы.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ghogha, A., Bruun, D. A., Lein, P. J. Inducing Dendritic Growth in Cultured Sympathetic Neurons. J. Vis. Exp. (61), e3546, doi:10.3791/3546 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Форма дендритных беседки определяет общее синаптической вход нейрона может получить 1-3, и влияет на типы и распределение этих входов 4-6. Измененные формы рост дендритов и пластичности, связанные с нарушениями неврологического функции в экспериментальных моделях 7, и, как полагают, способствует клинические симптомы наблюдаются и в нервной 8-10 нарушений и нейродегенеративных заболеваний, 11-13. Такие наблюдения подчеркивают функциональное значение именно дендритные регулирующих морфологию, и предполагают, что определение механизмов, которые контролируют рост дендритов будет не только способствовать пониманию того, как нейронные связи регулируются во время нормального развития, но также может дать представление о новых терапевтических стратегий для различных неврологических заболеваний.

Механистические исследования дендритных рост будет значительно облегчается благодаря наличию офа модель системы, которая позволяет нейронам экспериментально перешли от состояния, в котором они не распространяются на дендриты, в котором они разработать дендритных беседки сравнима с их коллегами в естественных условиях. Первичные культуры симпатических нейронов в отрыве от верхних шейных ганглиев (SCG) перинатальной грызунов обеспечить такую ​​модель. При культивировании в определенной среде в отсутствие сыворотки и ганглиозные клетки глии, симпатических нейронов распространяется единый процесс, который аксонального, и это однополярный состояние сохраняется в течение нескольких недель или месяцев в культуре 14,15. Тем не менее, добавление или костные морфогенетические белки-7 (BMP-7), 16,17 или 18 Матригель питательной среды вызывает эти нейроны расширить несколько процессов, которые отвечают морфологические, биохимические и функциональные критерии дендритов. Симпатических нейронов в отрыве от SCG перинатальной грызунов и выросли при определенных условиях однородной популяции нейронов 19которые отвечают равномерно дендритов способствующих деятельности Матригель, BMP-7 и других БМП из decapentaplegic (ДПП) и 60A подсемейства 17,18,20,21. Важно отметить, что Матригель и БМП-индуцированных дендритных формирование происходит при отсутствии изменений в выживаемости клеток или рост аксонов 17,18.

Здесь мы опишем, как настроить диссоциированных культурах симпатических нейронов, полученных из ГКО перинатальной крысы, так что они отвечают на избирательный дендритов, содействие деятельности Матригель или БМП.

Protocol

1. Подготовка питательной среды (C2 среды)

  1. Добавьте следующее в указанном порядке, в стерильный, одноразовый 500 мл колбе Эрленмейера:
    Количество Компонент Конечная концентрация
    190 мл DMEM (низкий уровень глюкозы) N / A
    10 мл жирных кислот BSA (20mg/ml в DMEM) 50 мкг / мл
    2,8 мл L-Глютамин 1,4 мм
    4 мл инсулина / трансферрин / селен (100x) 10 мкг / мл инсулина 5,5 мкг / мл трансферрина 38,7 нМ селена
    0,4 мл NGF (125 мкг / мл) 100 нг / мл
    200 мл Ветчина F-12 N / A
  2. Swirl мягко то смеси и аликвоту 10 мл на трубе в 17 х 100 стерильные пробирки крышкой оснастку.
  3. Хранить при температуре -80 ° C
  4. Важные замечания:
    • Таяние NGF непосредственно перед использованием.
    • Перед аликвоты NGF маточного раствора, намывной внутренних стен культуры тканей пластиковых серологические пипетки с белками, чтобы минимизировать налипание NGF в пластик. Самый простой подход заключается в пипетировать смесь DMEM, содержащей BSA в несколько раз. Промойте NGF трубку несколько раз смесью DMEM.
    • Добавить F-12, потому что последний свободный цистеин может дестабилизировать дисульфидных связей в инсулине.
    • Не замораживать в объемах, превышающих 10 мл, потому что КАПО 4 кристалла могут образовывать
    • Не замораживания-оттаивания C2 среднего более чем в 2 раза.

2. Подготовка стекла Покровные

  1. Мы обнаружили, что только мелкие немецкие покровные стекла последовательно работать в этом протоколе (см. таблицу 1 для рекомендуемого источника и номер по каталогу).
  2. Добавить 75-100 мл 70%-ной азотной кислотой до 300 мл в стеклянных бутылках образца с политетрафторэтилена (ПТФЭ или тефлон) крышки вкладыши (Fisher каталог # 09-911-765).
  3. Надев перчатки, падение покровные по одному в растворе азотной кислоты. Добавьте достаточно покровные, чтобы слой не более 2-3 покровных толстый на дне банки.
  4. Осторожно встряхните контейнеры с покровные в течение 6-8 часов при комнатной температуре на орбитальном шейкере набор не более чем 185 оборотов в минуту.
  5. Работа в вытяжной шкаф, тщательно сцеживать кислоты и распоряжаться в соответствии с местными правилами. Промыть покровные раз с ультра-чистой культуре ткани класса водой, затем добавить 75-100 мл воды в контейнер. Покровные стекла могут быть промыты несколько раз, если вода становится мутной. Слегка встряхните при комнатной температуре в течение ночи на набор орбитальный шейкер для не более 185 оборотов в минуту.
  6. Повторите описанную выше последовательность азотной кислоты / культуре ткани класса воды ежедневно в течение всего 3 дней.
  7. Декантируйте окончательныйкультуры тканей класса водой и добавить достаточно ацетон, едва охватывают покровные.
  8. Декантируйте это ацетон и распоряжаться правильно.
  9. Передача покровные для 150 мм стеклянной посуде Петри. Добавьте достаточно ацетон, едва охватывают покровные. Убедитесь, что покровные в один слой на блюдо.
  10. Позвольте ацетон испаряется в течение ночи в вытяжной шкаф.
  11. Выпекать покровные в сушильном шкафу при температуре 180 ° С в течение 1,5 часов для стерилизации.

3. Подготовка Покровные культуры

  1. За день до вскрытия, добавить 1 стакан покровное (полученного, как описано выше) в каждую лунку 24-луночного планшета культуры тканей с использованием стерильной техники. Добавить 200 мкл стерильной поли-D-лизина раствор (100 мг / мл в 0,5 М Трис-буфере, рН 8) в каждую лунку и хранить пластины при температуре 4 ° С в течение ночи.
  2. В день вскрытия, а в идеале до начала вскрытия, аспирации поли-D-лизин решения от каждой скважины и промыть каждую лунку 5 разстерильной ткани культуры класс воды.
  3. Добавить 200 мкл низкой глюкозы DMEM каждой пластины и магазинов в 37 ° C инкубатора. Примерно за 1 час до покрытия соты, удалить низкой глюкозы DMEM и добавьте 250 мкл среды C2 на лунку. Магазин пластин при 37 ° С до 5% CO 2 до клетки готовы быть покрытием.

4. Вскрытие и изоляции верхнего шейного ганглия

  1. Диссоциированных культурах симпатических нейронов, как правило, подготовленные диссоциации верхний шейный ганглий (SCG) собран из пренатального (эмбрионального дней 19-21) крысят, потому что есть меньше глиальных клеток. Тем не менее, это тот же протокол может быть успешно использован с раннего послеродового (от 1 до 3 дней) крысят или перинатальной щенков мыши.
  2. Эвтаназии беременных крыс с помощью CO 2 ингаляции. Бритье живота и мытье кожи с 70% этанола. Удалить рога матки в стерильных условиях и поместить рога матки в стерильных 150 мм блюдо Петри. Избежатьповреждение кишечника или других внутренних органов плотины во время вскрытия.
  3. Поместите чашку Петри с щенками на кастрюлю лед, чтобы обезболить эмбриональных щенков. Проанализируйте эмбрионов бесплатно рога матки и околоплодных оболочек. Отрежьте спинной мозг каждого щенка вдоль средней линии под плечом к эвтаназии щенков. Это также разрывает полой вены, что снижает кровотечение из сонной артерии во время вскрытия ГКО. После расчлененный свободным от рога матки, место эмбрионов в стерильной L-15 средней Лейбовиц (или любой воздушной буферной среде) с добавлением пенициллина и стрептомицина.
  4. Поместите эмбрионы на спине на 150 мм чашки Петри, наполовину заполненной Sylgard. Используя стерильные иглы 20 датчик, контактный грудной клетки и головы, мягко hyperextending шеи, что облегчает вскрытие ГКО.
  5. Сделайте срединный разрез вдоль шеи на уровне ключицы выявить подчелюстных желез. Удаление железы с использованием тонких щипцы (по. 4 или нет. 5 Dumont), чтобы выставить мышечного слоя.
  6. Используйте тонкий пинцет, чтобы сократить кивательной мышцы возле ключицы. Затем аккуратно поднять и надрезать omohyoid мышц рядом с трахеи. Эта мышца очень тонкая, поэтому избежать сокращения слишком глубоко, чтобы не порвать основной сонной артерии и СКГ. После того как эти мышечные слои удаляются, сонной артерии и блуждающий нерв должен быть хорошо виден.
  7. SCG лежит чуть ниже бифуркации сонной артерии. Используя тонкий пинцет (№ 4, или нет. 5), притупить рассекать ткани от обеих сторон сонной артерии, чтобы разоблачить узла. Используя 2 тонких щипцов, понять сонной артерии чуть выше и ниже ростральной и хвостовой концы ГКО, соответственно, для удаления части сонной артерии, лежащих выше ГКО, а также СКГ себя. Вполне вероятно, что узловые ганглий, который находится рядом с ГКО на данном этапе развития, также будут удалены на этот шаг. Узловые ганглиев может быть identifieг ее круглая форма и большой блуждающего нерва проектирования от него. Это проходит по одной из ветвей сонной артерии. В отличие от ГКО является миндалевидные и лежит прямо под бифуркации сонной артерии. Поместите расчлененный ткань в стерильную 35 мм культуры блюда, содержащие L-15, средние и антибиотиков. Удалить ГКО от всех щенков перед переходом к следующему шагу.
  8. Используя тонкий пинцет, осторожно отделить ГКО от сонной артерии и другие ткани удаляются во время вскрытия (в частности, блуждающего нерва и узловые ганглий). Используйте тонкий пинцет, чтобы удалить капсулу из ганглиев. Это значительно сокращает количество нейронных клеток в культуре. Передача ганглиев в другой стерильный 35 мм блюда, содержащие L-15, среда.
  9. Чтобы отделить ГКО, удалите L-15 средней и заменить 2 мл коллагеназы (конечная концентрация 1 мг / мл) / Dispase (конечная концентрация 5 мг / мл) в кальция и магния без сбалансированный солевой раствор Хэнка. ИнкубацииТе при 37 ° С в течение 40 минут.
  10. Передача ГКО в стерильный 15 мл конические трубки центрифуги и довести объем до 10 мл L-15 дополнен BSA (конечная концентрация 1-2 мг / мл). Центрифуга 200 X г при комнатной температуре в течение 5 минут. Удалите супернатант и промыть еще раз с L-15 дополнен BSA.
  11. После второй стирки, удалить все L-15 и ресуспендируют ганглиев в ~ 2 мл среды C2. Растереть клеток с использованием огневой полировкой изогнутый кончик пипетки, убедитесь, что пипетка покрыта BSA/L15 перед растиранием чтобы свести к минимуму прилипание клеток к стеклу. Растереть мягко 3-4 раза. Пусть большого скопления устояться в течение 1 минуты и передачи клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку. Добавить еще C2 СМИ оставшихся ГКО и растереть. Дав скопления решить, передавать клеточной суспензии из второй растирания в том, что собранные после первого растирания. Повторите эту процедуру несколько раз, пока ганглиев в основном диссоциированной. Discard оставшиеся сгустки после четвертого растирания.
  12. Для клеток диссоциированных из одного помета крысят (обычно 12-16 щенков), довести общий объем среды в клеточной суспензии до 8-10 мл путем добавления дополнительных средних С2. Осторожно ресуспендирования клеток с помощью пипетки и удалять небольшие аликвоты определить плотность клеток. Регулировка громкости клеточной суспензии 2 раза для достижения желаемой плотности клеток в культуре, а затем, будучи уверенным, что для поддержания клеток в суспензии, аликвоту 250 мл клеточной суспензии в каждую лунку. Для морфометрических исследований рост дендритов, мы обычно пластина клеток при низкой плотности (~ 5 х 10 4 клеток на лунку) в 24-луночных планшетах.
  13. Наша лаборатория насиживает СКГ культур в стеклянной сушильные шкафы, а не непосредственно в СО 2-инкубаторе. Мы делаем это потому симпатических нейронов, выращенных в бессывороточной среде работать лучше с более высокой концентрации СО 2 (6,5%). Кроме того, мы не используем антибиотики в оУра средств массовой информации, поскольку она тормозит рост аксонов и поддержания культуры в сушильные шкафы, кажется, свести к минимуму распространение загрязнения, если она развивается множество культур. Используя эту систему, мы регулярно поддерживать SCG культур до 8 недель. После покрытием, SCG культуры размещены на фарфоровой тарелке эксикаторе в стеклянной сушильные шкафы со стерильной водой в нижней части. Примерно 120 мл CO 2 вводится в эксикаторе до уплотнения его закрыть и размещение всего в эксикаторе набор инкубаторе 35,5 ° C.

5. Кормления и содержания культур

  1. Культура, как правило, кормят 3 раза в неделю, с первого обмена медиа происходит через 24 часа после покрытия. С помощью стерильного изогнутый кончик пипетки, аккуратно снять около половины средств массовой информации на лунку. Используя чистую стерильную изогнутый кончик пипетки, заменить объем среды удален со свежими С2.
  2. Чтобы устранить не-нервных клеток из культуры, анти-митотический агент цитosine-D-арабинофуранозида (ARA-C, конечная концентрация 1-2 мкм), как правило, добавляется в питательную среду на первом СМИ обмена (например, через 24 часа после покрытия) в течение 48 часов. Такая концентрация ARA-C, как правило, достаточно, чтобы удалить все не-нервных клеток. Если дополнительные ARA-C требуется лечение, рекомендуется сделать это через кормление свести к минимуму токсическое воздействие на нейроны.

6. Вовлечение рост дендритов с Матригель или BMP-7

  1. Чтобы стимулировать рост дендритов, Матригель или BMP-7 будет добавлен в культуру после не-нервных клеток были устранены и ARA-C уровней в культурах значительно сокращаются. Как правило, мы добавим Матригель или BMP-7 в среду на 5-й день в пробирке, но рост дендритов могут быть вызваны Матригель или BMP-7 добавлены в любой момент времени в пробирке. Матригель или BMP-7 добавлен в среду С2 и культуры подается как описано выше.
  2. Матригель и БМП-индуцированный рост дендритов времяи зависит от концентрации. Для максимального эффекта, Матригель добавляют С2 в конечной концентрации 50-75 мкг / мл; BMP-7 добавлен в среду С2 в конечной концентрации 50 нг / мл. Матригель концентрации более 100 мкг / мл или BMP-7 концентрации более 100 нг / мл были отмечены вызывать токсичность нейронов. Дендритные процессы (как определено морфологические критерии) стало очевидным, примерно через 48 часов после первоначального воздействия на Матригель или BMP-7 на максимально эффективных концентрациях. Чтобы стимулировать устойчивый рост дендритов, культуры подаются с BMP-7, содержащий среду при каждом кормлении. Эквивалентные результаты были получены с использованием 2 БМП, 4, 5 и 6 в сопоставимых концентрациях 20,21.

7. Иммуноцитохимическая Анализ BMP-7-индуцированный рост дендритов

  1. Когда желаемая степень дендритных разветвление было достигнуто, культуры закрепляются на 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатного буфера. Лучший фиксацииchieved заменив половину среднего и 4% параформальдегида и повторять этот шаг 3-5 раз в течение 10-15 минут.
  2. Промыть культуры заменив половину 4% параформальдегида с фосфатным буферным раствором (PBS) и повторяя этот шаг три раза в течение 10 - 15 минут.
  3. Удалите все PBS и добавьте 200 мкл 0,1% Тритон Х-100 в PBS в каждую лунку в течение 5 минут при комнатной температуре permeabilize клеток.
  4. Удалить Triton решение стремлением и добавить 200 мкл на лунку блокировки буферным раствором (PBS дополнен 3-5% BSA и 1% козьей сыворотки). Выдержите в течение 20-30 минут при комнатной температуре.
  5. Удалите блокирующий буфер и добавить первичных антител, микротрубочек связанных белков-2 (MAP2) разводят в 1:2000 - 1:5000 в блокирующем буфере. Инкубируйте культур в течение 1 часа при комнатной температуре или на ночь при 4 ° C.
  6. Удалить первичную решение антитела, мыть культур с PBS три раза в течение 15 минут при комнатной температуре.
  7. Инкубируйте культур с вторичными антителами разводят в PBS с добавлением 1% BSA в течение 1-2 часов при комнатной температуре в темноте.
  8. Удаление вторичной решение антител и мыть культур с PBS три раза в течение 10-15 минут при комнатной температуре в темноте.
  9. Горе покровных стекол на клетку вниз в каплю водной среде при монтаже соответствующим рН флуорохромом привязаны к вторичным антителом. Хранить слайды ночь при комнатной температуре, чтобы монтаж полусухое. Хранить слайды при температуре 4 ° C до изображений.
  10. Позвольте слайды, чтобы уравновесить до комнатной температуры перед изображениями. Получить люминесцентные изображения с помощью фазово-контрастной микроскопии оборудованных для эпифлуоресцентной. Как правило, все беседки дендритных одного нейрона может быть получены с помощью 20-кратным цель и соответствующие фильтры.

8. Представитель Результаты

Симпатических нейронов в отрыве от SCG перинатальной рац и выращенные в отсутствие сыворотки и ганглиозные клетки глии не выразить MAP2 иммунопозитивных процессов (рис. 1), а, как правило, распространяется только одна аксонального процесс 14,15. Воздействие BMP-7 (рис. 1) или Матригель индуцирует образование многочисленных процессов, которые отвечают морфологические, биохимические и функциональные критерии дендритов 17,18. Дендритов способствующих деятельности либо Матригель или BMP-7 является концентрация и зависящей от времени 17,18,20. Максимальный рост дендритов наблюдается использование концентрации Матригель между 50 и 75 мкг / мл или BMP-7 от 30 до 100 нг / мл, а половину максимального эффекта, как правило, наблюдается в BMP-7 концентрацией ~ 2 нг / мл. Тем не менее, значительных изменений в рост дендритов могут быть обнаружены с BMP-7 таких низких концентрациях, как 300 пг / мл. Дендритные ответ на любой Матригель или BMP-7 относительно медленно, с <50% нейронов, образуя второй процесс в течение 24 часов после воздействия или дендритов-р romoting агента. Тем не менее, в течение 3 дней после первого BMP-7 воздействия, практически все нейроны реагируют на максимально эффективное Матригель или BMP-7 концентрациях. Количество дендритов в нейронах продолжает увеличиваться с непрерывным воздействием BMP-7, при этом большинство изменений, происходящих в течение первых 10 дней лечения. Через 4 недели, BMP-7, обработанных нейронов как правило, имеют 6-8 первичных дендритов, которые обладают вторичные, третичные и даже четвертичные дендритных ветвей 17. Это увеличение в дендритных беседки происходит в отсутствие каких-либо существенных изменений в рост аксонов и дендритов сопоставимых ответов может быть вызвана с использованием аналогичных концентрации 2 БМП, 4, 5 или 6 20,21. Дендритные рост также может быть вызвано совместного культивирования симпатических нейронов с эндогенными ганглиозные клетки глии 15,22, однако дендритные ответ значительно медленнее, в этих условиях.

. JPG "/>
Рисунок 1. BMP-7 стимулирует рост дендритов в культуре симпатических нейронов. Номера для нервных клеток были исключены из СКГ культур путем обработки анти-митотического в течение 48 часов начало на 2-й день в пробирке. Начиная с 5-й день в пробирке, культуры обрабатывали либо контрольной среде (А) или среде с BMP-7 в 50 нг / мл (B). На 11-й день в пробирке (после 5 дней лечения BMP), культур immunostained с МКА против MAP2, белок, содержащийся в основном в дендриты нейронов и somata. Как показано на представителя флуоресценции микрофотографии, нейронов, выращенных в контролируемых условиях не имеют дендриты, о чем свидетельствует отсутствие MAP-2 иммунопозитивных дендритов процессов (А), в отличие от нейронов подвергается BMP-7 (B), как правило, имеют несколько конических MAP-2 иммунопозитивных дендритов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Преимуществами этой модели можно отнести: (а) культур состоят из однородного населения симпатических нейронов лишенной других типов клеток 17,23, (б) фактор роста требований симпатических нейронов хорошо установлена, которая позволяет использовать определенной среде, а также ряд определенных средств массовой информации, и субстратов хорошо работать для роста и поддержания симпатических нейронов 23, (с) нейронов в этих культурах реагировать равномерно дендритов, содействие деятельности Матригель, BMP-7 и других БМП ГО и 60A подсемейства 17,18,20,21, и (г) Матригель или БМП-индуцированных дендритных формирование происходит при отсутствии изменений в выживаемости клеток или рост аксонов 17,18. Эта модель позволяет экспериментального контроля, когда рост дендритов срабатывает, которые позволяют получить синхронизированных популяций нейронов на различных этапах рост дендритов, например, непосредственно предшествующий образованию дендритов, во время первичного dendritogenesis (начальное образование первичных дендритов) и на более поздних этапах созревание дендритных. Наиболее существенные ограничения модели включают ограниченное количество РНК и белка доступны типичные вскрытия одного помета, которые могут ограничить биохимические исследования, и некоторые трудности в манипулирование экспрессии генов. Последние достижения в области методов для выражения кДНК в первичных культурах клеток нейронов быстро преодолеть этот последний недостаток. Есть публикации отчетности успешного применения на основе липидов систем доставки, nucleofection и аденовирусных векторов культурного симпатических нейронов. Сообщил эффективность трансфекции являются относительно низкими (как правило, от 10-20% с липофекция или nucleofection и до 30-50% при вирусной инфекции), которая является адекватной для конечных точек на основе анализа отдельных клеток, например, морфологический анализ, но может быть проблематичным для многих биохимических конечных точек.

Факторы, тхат может повлиять на БМП-индуцированный рост дендритов в культуре симпатических нейронов включают культивирования нейронов при очень высокой плотности клеток и в том числе сыворотки в культуре средств массовой информации. Несмотря на то, что причина высокой плотности клеток ослабляет дендритов способствующих деятельности БМП не известно, вполне вероятно, что сыворотка ослабляет эту деятельность, потому что БМП связывают жадно с белками сыворотки. Интересно, что сыворотка сама слаба дендритов, содействия деятельности в культуре симпатических нейронов 24, и наши предварительные данные показывают, что эта деятельность опосредована БМП, которые присутствуют в большинстве, если не все коммерческие сыворотки. БМП также присутствуют в Матригель и, вероятно, посредником его дендритов, содействие деятельности. Третий фактор, который может повлиять на дендрит-содействие деятельности БМП является неправильной обработки и хранения БМП. Не храните решения BMP акции в концентрации менее 0,1 мг / мл. Важно, чтобы не допустить BMP акций или рабочих растворов, чтобы стать очень простой, и мы рекомендуем буферетрансфертов используется для разбавления растворы имеют рН 4,5 ± 0,05. Смешайте все решения энергично до аликвоты, но не так энергично, что решения, пена, и использовать только полипропиленовые трубы, потому что БМП, как правило, придерживаются других пластмасс. Не храните аликвоты в морозильных камерах, которые имеют функцию автоматического размораживания, так как езда на велосипеде температуры достаточно, чтобы разрушить деятельность BMP-7. Настоятельно рекомендуется, что BMP решения храниться при -80 ° C и замораживания-оттаивания быть сведено к минимуму (не замораживания-оттаивания более 2-3 раз). Подобные меры предосторожности должны быть использованы в работе Матригель. Кроме того, рекомендуется, чтобы быть Матригель медленно разморозить при 4 ° C. Матригель не будет вызывать рост дендритов, когда используется для намывной поверхностей перед покрытием нейронов, она действует только при добавлении в среду культивирования установленных нейронов клеточных культур 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана финансирование от Национального института здоровья (гранты R21 и R01 NS45037 ES014901).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass coverslips Bellco Glass 1943-10012 12 mm Round Coverslip #1 Thickness, German glass
Bent tip pipets Bellco Glass 1273-50003
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899-100MG Stock solution 1 mg/ml
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 15230
Fine forceps Dumont no. 4 and 5 Fine Science Tools 11252-30 11241-30
20-gauge needles BD Biosciences 305176
Leibovitz’s L-15 medium Invitrogen 11415
Collagenase Worthington Biochemical 4176 1 mg/ml
Dispase Roche Group 04942078001 5 mg/ml
Hank’s balanced salt solution( -Ca,-Mg) Invitrogen 14185-052
DMEM Low glucose Invitrogen 11885
L-Glutamine Invitrogen 25030 20 mM
Insulin/Transferrin/ Selenium Invitrogen 51500-056 100X
Fatty-acid free BSA Calbiochem 126609
NGF Harlan Laboratories 5017
Ham F-12 nutrient medium (F-12) Invitrogen 11765
Cytosine arabinoside Sigma-Aldrich C1768
Matrigel BD Biosciences 356234 Avoid repeated freeze-thaw cycles
BMP-7 R&D Systems 345-BP BMP7-07H BMPs 4, 5 and 6 work equally as well as BMP-7 and are sometimes easier to obtain commercially
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Mouse anti-rat MAP2 antibody Sternberger Monoclonals Inc. SMI52 1/5000
Alexa Fluor 546 goat-anti-mouse Invitrogen A11003 1/10000
Mounting media Molecular Probes, Life Technologies P7481

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Purpura, D. P. The Neurosciences: A Study Program. Quarton, Q. C., Melnechuk, T., Schmitt, F. O. Rockefeller University Press. 372-393 (1967).
  2. Purves, D. Functional and structural changes in mammalian sympathetic neurons following interruption of their axons. J. Physiol. 252, 429-463 (1975).
  3. Purves, D. A Trophic Theory of Neural Connections. Harvard University Press. (1988).
  4. Miller, J. P., Jacobs, G. A. Relationships between neuronal structure and function. J. Exp. Biol. 112, 129-145 (1984).
  5. Schuman, E. M. Synapse specificity and long-term information storage. Neuron. 18, 339-342 (1997).
  6. Sejnowski, T. J. The year of the dendrite. Science. 275, 178-179 (1997).
  7. Berger-Sweeney, J., Hohmann, C. F. Behavioral consequences of abnormal cortical development: insights into developmental disabilities. Behav. Brain Res. 86, 121-142 (1997).
  8. Connors, S. L. Fetal mechanisms in neurodevelopmental disorders. Pediatric Neurology. 38, 163-176 (2008).
  9. Pardo, C. A., Eberhart, C. G. The neurobiology of autism. Brain Pathology (Zurich, Switzerland). 17, 434-447 (2007).
  10. Zoghbi, H. Y. Postnatal neurodevelopmental disorders: meeting at the synapse. Science. 302, 826-830 (2003).
  11. de Ruiter, J. P., Uylings, H. B. Morphometric and dendritic analysis of fascia dentata granule cells in human aging and senile dementia. Brain Res. 402, 217-229 (1987).
  12. Flood, D. G., Coleman, P. D. Hippocampal plasticity in normal aging and decreased plasticity in Alzheimer's disease. Prog. Brain Res. 83, 435-443 (1990).
  13. Jagadha, V., Becker, L. E. Dendritic pathology: an overview of Golgi studies in man. Can. J. Neurol. Sci. 16, 41-50 (1989).
  14. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. I. Conditions under which neurons form axons but not dendrites. Dev. Biol. 128, 324-336 (1988).
  15. Tropea, M., Johnson, M. I., Higgins, D. Glial cells promote dendritic development in rat sympathetic neurons in vitro. Glia. 1, 380-392 (1988).
  16. Lein, P. The effects of extracellular matrix and osteogenic protein-1 on the morphological differentiation of rat sympathetic neurons. Int. J. Dev. Neurosci. 14, 203-215 (1996).
  17. Lein, P., Johnson, M., Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 induces dendritic growth in rat sympathetic neurons. Neuron. 15, 597-605 (1995).
  18. Lein, P. J., Higgins, D. Laminin and a basement membrane extract have different effects on axonal and dendritic outgrowth from embryonic rat sympathetic neurons in vitro. 136, 330-345 (1989).
  19. Higgins, D., Lein, P. J., Osterhout, D. J., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. The MIT Press. 177-295 (1991).
  20. Beck, H. N., Drahushuk, K., Jacoby, D. B., Higgins, D., Lein, P. J. Bone morphogenetic protein-5 (BMP-5) promotes dendritic growth in cultured sympathetic neurons. BMC Neurosci. 2, 12-12 (2001).
  21. Guo, X., Rueger, D., Higgins, D. Osteogenic protein-1 and related bone morphogenetic proteins regulate dendritic growth and the expression of microtubule-associated protein-2 in rat sympathetic neurons. Neurosci. Lett. 245, 131-134 (1998).
  22. Lein, P. J. Glia induce dendritic growth in cultured sympathetic neurons by modulating the balance between bone morphogenetic proteins (BMPs) and BMP antagonists. J. Neurosci. 22, 10377-10387 (2002).
  23. Higgins, D., Lein, P., Osterhout, D., Johnson, M. I. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. MIT Press. 177-205 (1991).
  24. Bruckenstein, D. A., Higgins, D. Morphological differentiation of embryonic rat sympathetic neurons in tissue culture. II. Serum promotes dendritic growth. Dev. Biol. 128, 337-348 (1988).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics