Isolement des fibroblastes de rat par portail

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Une technique pour isoler les fibroblastes portail de foie de rat est décrit. Foies sont perfusés et digéré

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Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion. J. Vis. Exp. (64), e3669, doi:10.3791/3669 (2012).

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Abstract

La fibrose du foie est défini par le dépôt excessif de matrice extracellulaire par les myofibroblastes activés. Il ya plusieurs précurseurs de myofibroblastes hépatiques, y compris les cellules étoilées du foie, des fibroblastes portail et la moelle osseuse des fibroblastes issus 1. Cellules étoilées hépatiques ont été la mieux étudiée, mais les fibroblastes du portail sont de plus en plus reconnue en tant que contributeurs importants à la piscine myofibroblastes, en particulier dans la fibrose biliaire 2. Fibroblastes portail subissent une prolifération en réponse à des lésions épithéliales biliaires, ce qui pourrait jouer un rôle clé dans les premiers stades de la cicatrisation biliaire 3-5. Une méthode d'isolement des fibroblastes portail permettrait étude in vitro de cette population cellulaire et conduire à une meilleure compréhension du rôle des fibroblastes portail jouer dans la fibrose biliaire.

Fibroblastes portail ont été isolés en utilisant diverses techniques, y compris l'excroissance 6, 7 et liperfusion ver avec digestion enzymatique suivie par la sélection de 8 taille. L'avantage de la digestion et de la technique de sélection de taille par rapport à la technique de l'excroissance est que les cellules peuvent être étudiés sans la nécessité de passage dans la culture. Ici, nous présentons une version modifiée de la technique originale décrite par Kruglov et Dranoff 8 pour l'isolement des fibroblastes portail de foie de rat qui se traduit par une population relativement pure de cellules primaires.

Protocol

L'ensemble de la procédure est effectuée à température ambiante à moins d'indication contraire.

1. Préparation des solutions enzymatiques

  1. Préparer des solutions enzymatiques selon le tableau 1 et le filtre stérile à l'aide d'un filtre de 0,22 um. Conserver la solution une solution à 2 et à la température ambiante et la solution 3 à 4 ° C jusqu'à ce moment de l'emploi. Toutes les solutions et équipements entrant en contact avec des cellules isolées doivent être stériles.

2. Préparation de l'équipement de perfusion

  1. Premier système de perfusion avec HBSS moins de Ca 2 + / Mg 2 +, qui a été chauffé à 37 ° C. Remarque: Afin de s'assurer que le perfusat est de 37 ° C quand il arrive au niveau du foie, HBSS est réchauffé dans un bain-marie réglé à 37 ° C. Après son passage à travers la pompe de perfusion, il passe par un condenseur de verre gainé qui est connecté à un ensemble de circulation d'eau à 40 ° C (Fig. 1).
  2. Stériliser chirurgicale pourols dans un bécher avec de l'éthanol 70%.

3. Perfusion du foie

  1. Anesthésier un mâle adulte Sprague-Dawley rats par injection intrapéritonéale de Nembutal (50-100 poids corporel mg / kg est nécessaire pour obtenir une anesthésie adéquate).
  2. Placez l'animal dans une position couchée sur un plateau en plastique et de fixer les membres sur le plateau avec du ruban adhésif.
  3. Nettoyez l'abdomen avec de l'EtOH 70%.
  4. Faire une petite incision dans la peau de l'abdomen sur la ligne médiane. Disséquer la peau loin de l'aponévrose en faisant un grand U coupe sur l'abdomen. Coupez le muscle abdominal avec des ciseaux en suivant la forme même d'exposer la cavité péritonéale.
  5. Exposer la veine porte en utilisant 2 cotons-tiges pour bouger doucement les viscères abdominaux sur le côté droit.
  6. Passer deux stériles sutures de soie 2.0 ci-dessous la veine porte et attacher lâchement.
  7. Cathétériser la veine porte avec un cathéter jauge 16-18 IV et fixer le cathéter en place en serrant la ti lâchesutures ED dans l'étape précédente (Fig. 2).
  8. Injecter l'héparine diluée à travers le cathéter IV (1 ml d'unités d'héparine USP 5000 / ml dilué avec 4 ml de HBSS moins de Ca 2 + / Mg 2 +). Le foie doit blanchir.
  9. Connecter le cathéter IV le système de perfusion. Perfuser avec du HBSS moins de Ca 2 + / Mg 2 + à un débit de 20 ml / min pendant 10 minutes. Transect l'IVC inférieure vers le foie pour permettre le drainage du sang et de liquide de perfusion. Aspirer le sang regroupées à partir de la cavité abdominale.
  10. Changer le liquide de perfusion à une solution de collagénase de 0,3% (150 mg de collagénase de type 2 dans 500 ml HBSS en plus de Ca 2 + / Mg 2 +) et perfuser pendant 25 minutes. Gardez l'humidité du foie en le recouvrant avec le rabat précédemment disséqué abdominale. Mettre un couvercle boîte de Pétri sur le rabat et la position abdominale d'une lampe de chaleur sur la zone à maintenir la température intra-abdominale à environ 37 ° C.

4. Préparation de ee l'arbre biliaire

  1. Retirer le foie en le soulevant hors de la cavité abdominale avec une pince et le placer dans une boîte de culture de tissu stérile rempli de froid Leibovitz L-15 médias.
  2. De travail dans la hotte de culture tissulaire, décoller la capsule du foie et doucement taquiner le parenchyme hépatique en dehors avec une pince. Déplacez le foie par plusieurs plats remplis de Liebovitz de L-15 médias tout en continuant à taquiner l'écart du parenchyme, jusqu'à ce que finalement parti avec l'arbre isolé biliaire. Le parenchyme hépatique est de couleur beige, tandis que l'arbre biliaire restante est blanc.
  3. Placez l'arbre isolé biliaire dans un tube Falcon de 50 ml remplie avec 10 ml de pénicilline / streptomycine (10.000 UI / ml de pénicilline et 10.000 mg / ml de streptomycine); laisser sur la glace pendant 15 minutes.

5. Isolement de la fraction des fibroblastes Portail

  1. Placez l'arbre biliaire dans un tube stérile de 50 ml faucon et émincer avec des ciseaux stériles.
  2. Ajouter une petite quantité d'enzyme solution N ° 1 dans le tube (environ 5 ml) et de continuer à émincer l'arbre biliaire jusqu'à ce qu'il atteigne la consistance d'une pâte.
  3. Verser la boue dans une bouteille en verre stérile. Laver tube falcon avec le reste de la solution n ° 1, puis versez-le dans la bouteille en verre. Incuber à 37 ° C avec agitation à 100 tours par minute pendant 30 minutes.
  4. Filtrer la suspension à travers un bécher recouvert d'une couche unique de maillage en nylon (taille de pores de 30 microns).
  5. Transférer tout tissu restant au-dessus de la maille à une bouteille en verre stérile par lavage de la prise avec une solution enzymatique N ° 2. Commencez par verser la moitié (25 ml) de la solution dans un récipient stérile de 15 cm de Petri. Retirer soigneusement le maillage du bécher en maintenant les bords de la maille sans contaminer la zone centrale, puis inversant le filet et le trempage dans la solution dans la boîte de Petri pour enlever tout tissu restant sur le tamis. Jeter le filet. Transférer la solution dans la boîte de Petri dans une bouteille en verre stérile. Rincer la boîte de Pétri avec la REMAYi-ning 25 ml de solution n ° 2 et de le transférer à la bouteille en verre même. Incuber à 37 ° C avec agitation à 100 tours par minute pendant 30 minutes.
  6. Dans le même temps, prendre le filtrat dans le bécher et verser dans un tube Falcon de 50 ml. Centrifuger à 1600 rpm (460 x g) pendant 5 minutes à température ambiante.
  7. Aspirer les médias et remettre en suspension le culot dans 25 ml de solution n ° 3.
  8. Prenez la solution de l'étape 5.5 et de la filtrer dans un deuxième bécher stérile recouvert de maille de 30 microns.
  9. Jeter le filet. Centrifuger le filtrat à 1600 rpm pendant 5 minutes à température ambiante. Aspirer et remettre en suspension le culot avec 25 ml de solution n ° 3 comme cela a été fait à l'étape 5.7.
  10. Mélanger les 2 fractions des étapes 5.7 et 5.9 et centrifuger à nouveau à 1600 rpm pendant 5 minutes à température ambiante.
  11. Aspirer les médias et remettre en suspension le culot dans 10 ml de milieux de culture de fibroblastes portail (DMEM/F12 supplémenté avec 10% de FBS, 1% de pénicilline / streptomycine, gentamycine 0,3%, et 0,2% fungizone).
  12. Compter les cellules pour assurer la viabilité et la plaque dans les plats de culture de tissus. Selon l'application désirée, de 0,5 à 5 x 10 6 cellules par 10 cm plaque de culture tissulaire sont appropriés. D'un adulte Sprague-Dawley rats, nous obtiennent généralement de 2 à 10 millions de cellules viables.
  13. Remplacer les milieux de culture le lendemain pour enlever les débris non-adhérent. Par la suite, remplacez les milieux de culture tous les 2 jours.

6. Les résultats représentatifs

Fibroblastes primaires portail isolées de foie de rat adulte sont présentés à 1, 3 et 7 jours après l'isolement (Fig. 3). Remarquer que les cellules sont allongées, avec la morphologie caractéristique des fibroblastes. Les cellules peuvent être colorées avec des anticorps anti-élastine (CL55041AP, Labs Cedarlane, Burlington, Caroline du Nord) pour confirmer la pureté. Fibroblastes portail subissent une différenciation myofibroblastique dans la culture. Ceci peut être démontré par immunomarquage pour l'actine musculaire lisse α-(α-SMA; A2547, Sigma, St. Louis, MO).

Solution de collagénase 0,3% Collagénase de type 2 150 mg HBSS avec Ca 2 + / Mg 2 + 500 ml Solution n ° 1 (Pronase) Sérum-albumine bovine 50 mg La collagénase de type 2 25 mg Pronase 18 mg DNase 3 mg DMEM/F12 47,5 ml Pen / Strep 1 ml Sérum de veau fœtal 1,5 ml Solution n ° 2 Sérum-albumine bovine 50 mg (Hyaluronidase) La collagénase de type 2 25 mg Hyaluronidase 22 mg DNase 3 mg DMEM/F12 47,5 ml Pen / Strep 1 ml Sérum de veau fœtal 1,5 ml Solution n ° 3 DNase 3 mg Milieu RPMI 1640 50 ml

Tableau 1. Solutions enzymatiques.

Figure 1
Figure 1. Perfusion mis en place. A. Circulateur d'eau pour la colonne réchauffement. La colonne B. contenant les médias de perfusion. Robinet C commander sortie de la pompe. D. Pompe entrée. E. à vitesse variable pompe péristaltique. Bouteille isotherme avec F. Bio-Clean détergent. Lampe chauffante G.. Eau H. bain pour les médias de perfusion réchauffement.

Figure 2
Figure 2. En perfusion in situ. A. Cathéter intraveineux inséré dans la veine porte, fixé avec une suture et relié à la tubulure de perfusion par l'intermédiaire d'robinet. B. Glass pipette reliée à fiole à vide et d'aspiration murale pour éliminer le liquide de perfusion s'écoule de sectionnée IVC. Intestins I.. L. foie.

Figure 3
Figure 3. Le contraste de phase et l'immunofluorescence tache de fibroblastes portail de rat en culture. Fibroblastes cultivés pendant portail 1, 3, et 7 jours après l'isolement ont été fixées et colorées de l'élastine, α-SMA et DAPI.

Discussion

Fibroblastes portail jouer un rôle important dans la fibrose biliaire. Ici, nous décrivons une modification du protocole original publié par Kruglov et Dranoff 8 pour isoler les fibroblastes portail de foie de rat, en fournissant un moyen simple d'étudier cette population de cellules in vitro.

Cette approche utilise la digestion de protéase et basée sur la taille de filtration. Le principal avantage de cette méthode est que la population est relativement pure de cellules peuvent être obtenues sans passage dans la culture, permettant l'étude de l'expression des gènes ou le comportement des cellules fonctionnelles plusieurs jours après l'isolement. Cette technique offre également la possibilité d'isoler des cellules de foie à la fois sains et malades.

Une des étapes les plus critiques de ce protocole est la digestion enzymatique du parenchyme hépatique. Pour assurer une digestion réussie, il est important de confirmer que le sang est complètement évacuée du foie au cours de la première perfusion en faisant en sorte qu'il n'y est même blanchir du foie. Pour faciliter cela, il est possible d'utiliser un coton-tige pour masser doucement le foie tout en perfusant. Au cours de digestion des résultats du parenchyme hépatique dans un faible rendement de cellules viables, tandis que la sous-digestion, il sera difficile de séparer le parenchyme hépatique à partir de l'arbre biliaire. Comme les préparatifs de la pronase ont variabilité de l'activité enzymatique entre les différents lots, l'optimisation de la quantité utilisée peut être nécessaire quand il ya un faible rendement de cellules viables.

Ce protocole peut être modifié pour isoler les fibroblastes portail de foie de souris ou de foie de rat jeune en utilisant un gabarit plus petit cathéter IV à cathétériser la veine porte, la diminution du volume des solutions de perfusion en proportion de poids de l'animal, et en diminuant le débit de perfusion du foie à environ 10 ml / min.

Fibroblastes portail de la culture subissent une différenciation myofibroblastique en 10-14 jours, comme en témoignent les α-SMA excompression 9. Divers marqueurs ont été utilisés pour distinguer les fibroblastes portail à partir de cellules étoilées du foie, y compris fibuline-2, IL-6, l'élastine, nucléoside triphosphate diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofiline-1 et des protéines neuronales telles que la synaptophysine 2, 6, 10, 11 . Nous avons constaté que l'élastine est un bon marqueur pour les fibroblastes portail, même après la différenciation myofibroblastique, tandis que NTPDase2 est perdu après fibroblastes portail ont subi la culture, après plusieurs jours 9. Par conséquent, nous avons généralement de confirmer l'isolement des fibroblastes portail par immunofluorescence de l'élastine.

La limitation de cette technique est que, immédiatement après l'isolement des fibroblastes portail, il ya une petite fraction de contaminer les cellules, y compris les cellules de Kupffer et les cellules biliaires. Fibroblastes portail va dépasser ces cellules contaminantes dans les 2-3 jours, cependant, ce qui donne une population relativement pur (> 98%) 9.

Since fibroblastes portail de la culture subissent une différenciation myofibroblastique sur le plastique de culture tissulaire, nous avons généralement l'étude de ces cellules dans les 7 jours d'isolement. Les cellules sont maintenues dans le portail des milieux de culture de fibroblastes contenant 10% de sérum de veau fœtal, comme décrit dans la section des méthodes. Cependant, ces cellules vont survivre dans des milieux de croissance contenant 2% de sérum de veau fœtal pendant plusieurs jours. En général, nous n'utilisons pas de faibles milieux sans sérum pendant au moins 24 heures après l'isolement. Une fois les fibroblastes portail subissent une différenciation myofibroblastique, ils peuvent être repiquées à plusieurs reprises et conservées comme des stocks congelés de myofibroblastes.

Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par le NIH R01 DK05823 (à RGW), F32 DK083213 (à JWW), F30 DK081265 (à ALO), et par une subvention de la Fred et Suzanne Biesecker Centre hépatique pédiatrique (à PBE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Type 2 Collagenase Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) LS004177
Pronase Roche (Indianapolis, IN) 70290120
Hyaluronidase Sigma (St. Louis, MO) H3506
Deoxyribonuclease Sigma D4527
DMEM/F12 Invitrogen (Carlsbad, CA) 11320
HBSS without Ca2+/Mg2+ Mediatech (Manassas, VA) 21-021-CM
HBSS with Ca2+/Mg2+ Mediatech 21-020-CM
Leibovitz's L-15 Invitrogen 11415
RPMI Medium 1640 Invitrogen 11875
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
Fetal Bovine Serum Gemini Bio (West Sacramento, CA) 900-108
Nitex Nylon Mesh 30 μm Genesee Scientific (San Diego, CA) 57-105

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References

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