Voorbereiding van Parasagittal Slices voor onderzoek naar Dorsale-ventrale Organisatie van het knaagdier Medial entorhinale cortex

Published 3/28/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

We beschrijven de procedures voor de voorbereiding en elektrofysiologische opname van de hersenen plakken dat de dorsale-ventrale as van de mediale entorhinale cortex (MEC) te handhaven. Omdat neurale codering van de locatie volgt een rug-buik organisatie binnen de MEC, deze procedures te vergemakkelijken onderzoek van cellulaire mechanismen van belang voor de navigatie en het geheugen.

Cite this Article

Copy Citation

Pastoll, H., White, M., Nolan, M. Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex. J. Vis. Exp. (61), e3802, doi:10.3791/3802 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Computation in de hersenen is afhankelijk van neuronen het adequaat reageren op hun synaptische inputs. Neuronen verschillen in hun aanvulling en distributie van membraan ionenkanalen die bepalen hoe ze reageren op synaptische inputs. Echter, de relatie tussen deze cellulaire eigenschappen en neuronale functie in gedragen dieren niet goed begrepen. Een benadering voor dit probleem is om te onderzoeken topografisch georganiseerd neurale circuits waarin de positie van individuele neuronen kaarten op informatie die ze coderen of berekeningen die zij verrichten 1. Experimenten met behulp van deze aanpak stellen uitgangspunten voor afstemming van synaptische reacties onderliggende informatie-codering in zintuiglijke en cognitieve circuits 2,3.

De topografische organisatie van de ruimtelijke voorstellingen langs de dorsale-ventrale as van de mediale entorhinale cortex (MEC) biedt de mogelijkheid om relaties tussen cellulaire mechanismen en berekeningen tot stand iELANGRIJKE voor ruimtelijke cognitie. Neuronen in laag II van het knaagdier MEC coderen locatie met behulp van grid-achtige vuren velden 4-6. Voor neuronen vinden op dorsale posities in de MEC de afstand tussen de bakken velden die een raster vormen in de orde van 30 cm, terwijl voor neuronen geleidelijk ventrale posities deze afstand toeneemt tot meer dan 1 m. Verschillende studies hebben aangetoond cellulaire eigenschappen van neuronen in laag II van het MEC die, net als de afstand tussen rooster schieten velden ook, verschillen naar gelang van hun rug-buik-positie, wat suggereert dat deze cellulaire eigenschappen van belang zijn voor de ruimtelijke berekening 2,7-10.

Hier beschrijven we de procedures voor de voorbereiding en elektrofysiologische opname van de hersenen plakken dat de dorsale-ventrale omvang van het MEC waardoor onderzoek naar de topografische organisatie van de biofysische en anatomische eigenschappen van MEC neuronen te behouden. De dorsale-ventrale positie van de geïdentificeerde neurons ten opzichte van anatomische oriëntatiepunten is het moeilijk om nauwkeurig vast te stellen met de protocollen die horizontale plakjes MEC 7,8,11,12 te gebruiken, aangezien het moeilijk is om referentiepunten voor de exacte rug-buik-locatie van de slice vast te stellen. De procedures beschrijven we in staat nauwkeurige en consistente meting van de locatie van de opgenomen cellen langs de dorsale-ventrale as van het MEC en de visualisatie van moleculaire gradiënten 2,10. De procedures ontwikkeld voor gebruik met volwassen muizen (> 28 dagen) en zijn met succes toegepast bij muizen tot 1,5 jaar. Met de aanpassingen die kunnen worden gebruikt met jongere muizen of andere knaagdieren. Een gestandaardiseerd systeem van de voorbereiding en de meting zal helpen systematisch onderzoek naar de cellulaire en microschakeling eigenschappen van dit gebied.

Protocol

1. Parasagittal Slice Voorbereiding

1,1 Prepareer uit hersenhelften

Alle dierproeven moeten de lokale ethische toetsing en nationale regelgeving. Bij de experimenten hier beschreven werk volgens het Britse dieren (Scientific Procedures) Act 1986. We routinematig gebruik van cervicale dislocatie zonder verdoving om de muis te euthanaseren voordat u de hersenen. Ook de muis kan terminaal verdoofd, maar in dit geval kan het nodig te bepalen of de keuze van verdoving beïnvloedt neuronale eigenschappen.

Verwijder de hersenen van de muis en direct plaats in een koude (4-8 ° C) het snijden van kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) (zie tabel 1 voor oplossing composities) borrelen om verzadiging met carbogen (95% O 2, 5% CO 2).

Na een maximum van drie minuten, verwijder voorzichtig de hersenen van de cUtting ACSF behulp van een spatel voorzichtig en te plaatsen in een rechtopstaande positie (dorsale zijde naar boven) op filterpapier die vochtig is gemaakt met het snijden ACSF (figuur 1a).

Ter vergemakkelijking van nauwkeurige montage van de hemisferen, gebruik dan een scheermes of scalpel om zoveel mogelijk van de kleine hersenen als mogelijk te verwijderen zonder dat de MEC (gelegen aan de caudale uiteinde van de grote hersenen) en de rostrale derde van de grote hersenen te verwijderen door het snijden in het frontale vlak (figuur 1b).

Hemisect de hersenen, zorg ervoor dat de sectie is precies langs de verticale vlak van de middellijn (Figuur 1C).

Zet de halve bollen aan de borrelde snijden ACSF voor een en een halve minuut.

1.2 Monteer de halve bollen op een vibratome

Voor de montage, ervoor zorgen dat de snijkant van de vibratome blad is een hoek van 20 graden van horizontaal (

Het verzorgen van fysieke effecten te minimaliseren, dient u elk halfrond uit het snijden ACSF met een spatel en positie, zodat de mediale oppervlak rust op de spatel en de dorsale mate geconfronteerd met de richting van de microtoom mes. Schuif elk halfrond op de strook van superlijm, en zorg ervoor te zorgen dat de mediale oppervlak van elke hersenhelft is parallel aan de microtoom basis. Wij hebben geconstateerd dat voor het beste resultaat het dorsale oppervlak van elk halfrond moeten parallel lopen aan en kijken uit op de vibratome mes (figuur 1D).

1.3 Onderhoud van het preparaat tijdens het snijden

Na montage direct onderdompelen de hemisferen in koud snijden ACSF (4 - 8 ° C). Houd de Temperatuure en carbogen verzadiging in het snijden procedure. Als directe koeling en borrelen van de oplossing in de snij-kamer is niet praktisch, regelmatig aan te vullen het snijden ACSF oplossing in de kamer met vers, gekoeld en borrelen oplossing.

1,4 Cut secties

Een vibratome verwijderen cortex van beide helften in het sagittale vlak totdat u de meest laterale omvang van de MEC (meestal ~ 1 mm beneden de laterale oppervlakte) (figuur 1F).

Tussen snijdt til de vibratome blad up ~ 200 micrometer om te voorkomen dat het slepen van het blad terug over en schade aan de blootgestelde weefsel. Tegelijkertijd gesneden 400 pm parasagittal delen van beide helften (als ze opgesteld zoals weergegeven in figuur 1D worden beide gesneden tegelijk) tot de omvang van de mediale MEC bereikt. Dit kan worden geïdentificeerd door de afwezigheid van de dikke witte band rond de Ventro-caudale curve van thij hippocampus (extern capsule), de niet-convexe vorm van het rostrale grens en de hoek dorso-staart "hoek". figuur 1E illustreert de cirkelvormige uiterlijk van de hippocampus de parasagittal vlak dwars op de MEC. figuren 1F-G tonen hoe secties binnen het MEC zich in verschillende laterale-mediale posities bij het snijden. Let op de steeds meer boon-vormige uiterlijk van de hippocampus op meer mediale posities. Elke halfrond levert meestal twee of drie 400 um dikke plakken met de MEC.

1,5 Incubate plakjes

Na elke snede direct plaats de plakjes in carbogen-verzadigde standaard ACSF gehandhaafd in een waterbad van 35 ° C. Laat plakjes bij 35 ° C geïncubeerd gedurende ongeveer 15 minuten in de ACSF na het doorsnijden is voltooid.

Verwijder de houder plak uit het waterbad en blijven borrelen met carbogen bij kamertemperatuur gedurende lhet oosten 45 minuten.

2. Voorbeeld Parasagittal Slice Experiment

Een typisch experiment met behulp van deze voorbereiding is het elektrofysiologische opnames te maken van stellaatcellen in laag II van het MEC.

2.1 Optimaliseren optiek

Voor de opname ervoor zorgen dat de condensor is scherpgesteld op de slice plane (Koehler verlichting) en in het midden onder de hoge vergroting (bv. 40x) doelstelling.

2.2 Identificeer de cellen van belang

Gebruik een lage vergroting (bijvoorbeeld 4x) doel om een schatting van de opnametijd regio te identificeren binnen de MEC (figuur 2A-B). Schakel over naar een sterke vergroting doelstelling om levensvatbare cellen in deze regio (figuur 2C-D) te identificeren.

Als voorbeeld worden putatieve laag II stellaatcellen visueel vastgesteld door de veelhoekige of ovaal vorm en meerdere primaire dendrieten met dezelfde diameterter, en de afwezigheid van een grote diameter apicale dendriet 2,13,14. Zij betrouwbaar aangegeven aan de rand van de laag I / II grens waar zij overvloedig en vaak in groepjes 2,9 (Figuur 2C-D). Andere soorten cellen, zoals interneuronen en de piramidale cellen moeten ook identificeerbaar zijn.

Op dit punt experimenten worden uitgevoerd, bijvoorbeeld met hele cellen patch-clamp aan membraanpotentiaal of membraan bestaande uit geïdentificeerde neuronen, elektrische of optogenetic methoden opnemen synaptische ingangen activeren om de opgenomen neuron. Neuron identiteit kan worden geverifieerd bij de elektrofysiologische eigenschappen van de opgenomen neuron en door het opnemen van fluorescente labels binnen de intracellulaire oplossing.

3. Meet ligging aan de dorso-ventrale as

3.1 Afbeelding locatie van belang en de omliggende slice

Om de positie van een recor te bepalenDED neuron langs de dorsale-ventrale as, eerst met een lage vergroting doelstelling om het imago van de MEC gebied van de slice en de omliggende gebieden. Markeren de locatie van belang, bijvoorbeeld, met inbegrip van de registratie-elektrode in een (Figuur 3A) of uittreedt veld diafragma een heldere cirkel laten om de plaats van belang in een kopie van de foto. Om de opname locatie te bepalen in het beeld de dubbele vervolgens kan worden gesuperponeerd op de eerste afbeelding van de opname locatie en zijn omgeving (Figuur 3B). Tot 3 aparte lage vergroting (4x) beelden kan nodig zijn om het gebied die van een ventrale opname locatie om de dorsale rand van het MEC. Deze beelden kunnen dan worden samengevoegd met behulp van beeld-manipulatie-software om een afbeelding die afstand metingen kunnen worden verricht uit (figuur 3). Verdere controle van de neuron identiteit en locatie kan worden uitgevoerd vanaf de registratie door het opnemen vaninactief markers zoals biocytin of Alexa kleurstoffen in de intracellulaire oplossing en met geschikte verwerking van het weefsel na opname 2.

3.2 Bepaal de dorsale grens van MEC

De dorsale rand van het MEC biedt een handige mijlpaal van waaruit u rug-buik positie te meten. De ventrale rand van het MEC is niet zo goed gedefinieerd.

Figuur 4 laat zien hoe het MEC mobiele monumenten in de zin van Nissl lood plakken op verschillende mediale-laterale posities verschijnen onder DIC verlichting.

Figuur 4 A toont de cirkelvormige hippocampus (figuur 4 (i)) en het ontbreken van een parasubicular uitsteeksel in laag I (Figuur 4 (iv)) verbonden parasagittal schijfjes met laterale entorhinale Cortex (LEC).

Figuur 4 voor Christus tonen typische plakken dat de ME bevattenC. De dorsale deel van de prominente donkere dorsale entorhinale / Parasubicular grensgebied in het DIC verlichte schijfjes bevat een gedeelte van de parasubiculum. De parasubiculum gebied duidelijk blijkt uit Nissl kleuring in de overeenkomstige afbeeldingen in kolom (iii). De rand van de rug MEC (zwarte pijlen in 4B en 4C kolom (iv)) is ventraal de groep parasubicular cellen die ver uitsteekt in laag I (rode pijlen in 4B en 4C kolom (iv)).

Vergelijking van de figuren 4B en 4C kolommen (ii) en (iii) blijkt dat de dorsale rand van de MEC de Nissl delen overeen met een locatie die ventrale de dorsale zijde van de donkere entorhinale / Parasubicular grensgebied de DIC slice ( zwarte pijlen). De ligging van de rand kan worden geschat uit DIC beelden en vergelijking met referentie afbeeldingen (zie ook ref. 14). Toekomst validatie van de dorsale MEC grens met moleculaire merkers zal de nauwkeurigheid van deze schatting. Wij merken op that gekleurd referentie-secties en secties die worden verwerkt voor de morfologische identificatie van gelabelde neuronen, kan onderhevig zijn aan aanzienlijke krimp. Vergelijking van de absolute afstanden ten opzichte van de bezienswaardigheden in DIC en referentiesecties daarom eerst moeten meten en de correctie voor krimp (zie bijvoorbeeld ref 2).

3,3 kalibreren en meten van afstanden

Om het eenvoudig meten van de afstand in beelden te vergemakkelijken, maken gebruik van dezelfde lage vergroting doel het imago van een referentiesysteem om een ​​pixel te stellen: afstand conversie ratio. Meet de pixel afstand van de rand van de rug MEC de locatie van belang langs de omtrek van de MEC een grafische programma omzetten pixelafstand naar afstand micrometer (figuur 5A). Als neuronen gevuld met een marker zoals biocytin dan plaats van een opgenomen neuron kan dan ook worden teruggewonnen door geschikte verwerking (zie bijvoorbeeld referentie 2).

4. Representative resultaten

Figuur 5A toont een voorbeeld lage vergroting (4x) composiet beeld van een parasagittal plak na de opname, met de locaties van de opgenomen neuronen en meting gidsen gelegd. Opnamen van de aangegeven dorsale en ventrale stellaatcellen zijn weergegeven in figuur 5B. Deze opnamen helpen om de identiteit van de cellen vast te stellen en hoe de elektrische eigenschappen van MEC laag II stellaatcellen verschillen in dorsale en ventrale locaties te illustreren.

Figuur 1
Figuur 1. Voorbereiding van parasagittal plakjes. A Whole hersenen rusten met dorsale zijde naar boven op de filter vochtig is gemaakt met het snijden van ACSF. B C Hemisected hersenen klaar voor montage. D gemonteerd halfrond op lijm strook parallel aan cutting edge van vibratome blad voorafgaand aan de onderdompeling in het snijden ACSF en in plakken snijden. E Uiterlijk van afdeling met LEC tijdens het snijden procedure na verwijdering van laterale weefsel nog niet voldoende mediale een standaard parasagittal MEC segment. F Uiterlijk van 'laterale deel van de MEC na verwijdering van een verdere 400 pm weefsel (het oppervlak is 400 pm mediaal aan die getoond in . (F)) G uiterlijk van 'mediale' deel van de MEC na een 400 um parasagittal slice is gesneden HI Schema's van EF respectievelijk met vermelding van anatomische oriëntatiepunten, c:. cerebellum, L: laterale entorhinale cortex (LEC), m: mediale entorhinale cortex (MEC), h: hippocampus, oranje: externe capsule, blauw: corpus callosum, cyaan: dentate gyrus, grEEN-: CA3 & CA1. Het uiterlijk van rostrale grens van de hippocampus in plakjes dat LEC bevatten is concave (zwarte pijl in H), terwijl in plakjes die bevatten alleen MEC, de grens kunnen lineair (rode pijl in I) of concave (rode pijl in J). De geschatte vormen van gekleurde anatomische oriëntatiepunten zijn afkomstig van de aantekeningen in de Allen Brain Atlas ( http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html ).

Figuur 2
Figuur 2. Het identificeren van MEC laag II cellen onder DIC verlichting. Een voorbeeld samengestelde beeld van een para sagittale brain slice bij een lage vergroting (4x). Aparte foto's zijn op elkaar afgestemd en gemengd om afleidende randen en vignettering te verwijderen. Belangrijke mijlpaal gebieden h: hippocampus, m:. MEC B bijsnijden van een individuele lage vergroting (4x) beeld dat laag II van het MEC, zichtbaar als de donkere verticale streep in de buurt van de rechterzijde C MEC laag II bij een hoge vergrotingsfactor bevat (. 40x) met DIC verlichting. Het beeld is een op elkaar afgestemd en gemengd composiet van diverse afbeeldingen. De dichte centrale 'kolom' van cellen is Layer II. D Single DIC hoge vergroting afbeelding met een groep gezonde vermeende stellaatcellen en interneuronen in laag II. Zoals hier getoond, stellaatcellen vaak in groepen op de grens van laag I / II. Piramidale cellen hebben de neiging om dichter bij de Layer II / III grens te vinden. De gestippelde lijnen in AC geven de omvang van de BD respectievelijk. Schaalbalken: in A en B 500 pm, in C en D 100 pm.

Figuur 3 "src =" / files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg "/>
Figuur 3. Het meten van de dorsale-ventrale positie van de locaties van belang. Een Aligned lage vergroting (4x) beelden die de hele dorso-ventrale omvang van het MEC tussen de plaats van belang (gemarkeerd door de tip van een registratie-elektrode) en de donkere entorhinale / Parasubicular grensgebied mijlpaal (gebruikt om de dorsale grens vast te stellen zijn onder andere van de MEC - zie figuur 4) B als in A, maar met een gesuperponeerd beeld met een gediafragmeerd veld diafragma (bedekt met beperkte opaciteit) in plaats van een registratie-elektrode naar de locatie van belang markeren..

Figuur 4
Figuur 4. Het schatten van de dorsale rand van het MEC van DIC beelden van parasagittal plakjes. AC Parasagittal secties (lateraal naar mediaal) van de entorhinale cortex. DIC en Nissl delen zijn uit verschillende mice AC kolom (i):.. Hele parasagittal plakjes (400 micrometer dik) (uitgelijnd en blended composieten met een lage vergroting (4x) beelden) AC kolom (ii): Close-up van entorhinale cortex met karakteristieke donkere entorhinale / Parasubicular grensgebied in het bovenste gedeelte van elke afbeelding. AC kolom (iii) Nissl lood plakken (40 micrometer dik) van een andere muis in lijn met afbeeldingen in AC (ii). De donkere, dichte laag van cellen is laag II. Vergelijking kolommen (ii) en (iii) laat zien hoe de Nissl gekleurde cellen weergegeven in DIC beelden AC kolom (iv). Detail van Nissl gekleurde segmenten. B-en C-kolom (iv) zijn cellen van de parasubiculum (dorsale deel van de donkere entorhinale / Parasubicular grensgebied in het DIC beelden) en cellen van dorsale MEC. In B (iv) en C (iv) de grote dorsale stuk parasubicular cellen die zich uitstrekt tot diep in laag I is goed zichtbaar (rode pijlen). De ventrale rand van deze patches komt overeen met de dorsale boestellen van het MEC (zwarte pijlen). In A (iv) de parasubicular patch afwezig is, wat aangeeft dat de schijf is te lateraal voor een standaard parasagittal MEC slice voorbereiding. In alle panels, zwarte pijlen geven de dorsale grens van MEC. Grijze pijlen geven bij benadering de ventrale rand van het MEC.

Figuur 5
Figuur 5. Representatieve resultaten. Een Blended en bijgesneden gedeelte van het beeld in figuur 3 A. De posities van een dorsale cel en een ventrale cellen zijn aangegeven met blauw en groen gevulde cirkels respectievelijk. De zwarte pijl markeert de geschatte dorsale rand van het MEC en wordt uitgebreid in de diepe lagen van de witte stippellijn. De massieve witte lijn is een gids die de contour pad waarlangs de pixel meting van afstand van de dorsale rand van het MEC aan de ventraal gelegen cel werd genomen. Schaal bar: 500 pm B Electro.fysiologische sporen van de cellen die in A. Van links naar rechts - subthreshold reacties huidige stappen gebruikt ingangsweerstand berekenen spiking reactie op een grote positieve stroom stap spike detail.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Om onderzoek van MEC circuit eigenschappen die een rug-buik-organisatie hebben we hier in detail beschreven in een procedure voor het produceren van een parasagittal slice preparaat dat de dorsale-ventrale omvang van het MEC behoudt volgen vergemakkelijken.

Kritische stappen

Het verwijderen van de hersenen van het dier. Er met name op het uitoefenen van druk op de hersenen te voorkomen. Dit is belangrijker dan snelle verwijdering van de hersenen.

Snijden. Slice moet stevig vastgelijmd aan de vloer van de holding kamer. De vibratome moet z-as trillingen <2 micrometer en moet worden gebruikt met een hoge amplitude en lage snelheden. De optimale instellingen kunnen verschillen tussen de modellen en moet worden vastgesteld door trial and error.

Monitoring oplossing temperaturen. We vinden dat stukje kwaliteit is gevoelig voor temperatuur tijdens en na het snijden. Outsid e de aanbevolen temperatuur varieert het aantal gezonde neuronen verminderd kan worden neuronen moeilijker patch reacties synaptische input kan worden verminderd.

Imaging. Koehler belichting en centreren van het veld diafragma zijn belangrijk voor de visualisatie van cellen voor opname.

Problemen oplossen

Slices bevatten weinig gezonde cellen. Vervang oplossingen. Controleer z-as verplaatsing van de vibratome. Controleer de temperatuur van oplossingen. Controleer de oriëntatie van de plak tijdens het snijden.

Neuronen in de slice zijn moeilijk te zien. Kijk Koehler verlichting goed is geconfigureerd. Controleer microscoop lenzen schoon zijn.

Moeilijkheidsgraad vormen gigaseals. Controleer de vorm van opname elektroden. Onderzoek slice op tekenen van celdood, bijvoorbeeld ronde cel vormen of een hoog contrast cellen.

ve_content "> Beelden van de slice zijn moeilijk af te stemmen. Zorg ervoor dat de schijfjes zijn van de focus naar een maximale detail vast te leggen. Voor automatische beelduitlijning> 40% beeld overlap is meestal voldoende.

Beperkingen

Een mogelijke beperking van de parasagittal slice voorbereiding is dat zeer lange afstand synaptische verbindingen binnen het MEC niet kan lopen evenwijdig aan de parasagittal vliegtuig 9, 15 en kunnen dus niet worden bewaard. Handhaving van deze verbindingen kan het nodig het wijzigen van de voorbereiding procedure om de hoek van de slice gesneden door een van beide hemisecting of het monteren van de hersenhelften op de vibratome onder een hoek in de rostraal-caudaal vliegtuig te veranderen. Soortgelijke overwegingen kunnen gelden voor het behoud van andere verbindingen, bijvoorbeeld afferente input van de mediale septum.

Vergelijking met horizontale MEC slice preparaat

  1. Nauwkeurige meting van de rug-buik-locatie is van belangvoor het vaststellen van kwantitatieve relaties tussen de positie langs op de rug-buik-as en fysiologische eigenschappen. In horizontale plak de voorbereidingen 7,8,11,12 is het moeilijk om de exacte rug-buik-locatie van de snede en dit bemoeilijkt de oprichting van een steeds verwezen locatie. In tegenstelling, in de parasagittal slice voorbereiding de dorsale rand van het MEC is eenvoudig vast te stellen als een referentiepunt en kennis van de diepte van een neuron in een stuk is niet nodig om de rug-buik positie te meten. Parasagittal plakjes dan ook veel gemakkelijker nauwkeurige meting van de rug-buik-locatie, waardoor er meer een snelle en nauwkeurige onderzoek van kwantitatieve relaties tussen de rug-buik-locatie en de cellulaire en circuit eigenschappen.
  2. Moleculaire gradiënten zijn belangrijk voor de topografische circuit organisatie op het MEC en kunnen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentie of andere etikettering technieken. In vergelijking met horizontale segmenten, waarbij the signaal zou moeten worden vergeleken tussen de plakjes op verschillende rug-buik-locaties, de parasagittal voorbereiding zorgt voor een eenvoudiger, meer fijnkorrelig en meer betrouwbare visualisatie en kwantificatie van rug-buik moleculaire gradiënten.
  3. . Dorsale-ventrale gradiënten in synaptische verbinding kan een belangrijke rol spelen in het MEC functie. De parasagittal slice voorbereiding kan behouden synaptische verbindingen tussen de dorsale en ventrale gebieden binnen de MEC, wat belangrijk is voor het onderzoeken van hoe verbindingen verschillen binnen en tussen de verschillende locaties langs de dorsale-ventrale as van het MEC en voor het behoud van de integriteit circuit even op verschillende rug-buik locaties. Als verbinding varieert in hoofdzaak langs de dorsale-ventrale as, horizontale plakjes zijn minder waarschijnlijk even inbegrip van de gehele functionele microschakelingen bij elke extreem.

Toekomstige ontwikkelingen en toepassingen

Kennis van de moleculaire determinantenvan cellulaire identiteit in de MEC in staat zal stellen de definitieve typering van neuronale identiteit en het mogelijk maken meer nauwkeurige bepaling van de rug-buik-locatie.

Met behulp van de parasagittal slice voorbereiding, kon topografisch georganiseerd reacties van celtype-en locatie-specifieke activiteit van meerdere neuronen tegelijkertijd in acht worden genomen (bijvoorbeeld met behulp van spanning sensitieve kleurstoffen of calcium-beeldvorming) in een enkel schijfje.

In combinatie met optogenetic tools, de parasagittal voorbereiding maakt selectieve activering op verschillende plaatsen langs de dorsale-ventrale as. Vragen hoe de microcircuits op verschillende rug-buik-locaties speelt in op ruimtelijk gerichte activering kunnen leveren belangrijke inzichten in MEC microschakeling functie.

We verwachten dat deze voorbereiding zal een eenvoudige, robuuste en gestandaardiseerde basis voor het onderzoeken van rug-buik-gradiënten in fysiologische eigenschappen bieden en faciliterenhet begrijpen van hoe deze gradiënten dragen aan de informatieverwerking eigenschappen van het MEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Niets bekend te maken.

Acknowledgements

Wij zijn bedanken de volgende voor hun steun: Commonwealth Scholarship Commissie Verenigd Koninkrijk financiering (HP), EPSRC (HP), BBSRC (MFN) en de Europese Unie Marie Curie-acties (MFN).

References

  1. O'Donnell, C., Nolan, M. F. Tuning of synaptic responses: an organizing principle for optimization of neural circuits. Trends Neurosci. 34, 51-60 (2011).
  2. Garden, D. L. F., Dodson, P. D., O'Donnell, C., White, M. D., Nolan, M. F. Tuning of synaptic integration in the medial entorhinal cortex to the organization of grid cell firing fields. Neuron. 60, 875-889 (2008).
  3. Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick. Journal of Neuroscience. 25, 1924-1934 (2005).
  4. Hafting, T., Fyhn, M., Molden, S., Moser, M. -B., Moser, E. I. Microstructure of a spatial map in the entorhinal cortex. Nature. 436, 801-806 (2005).
  5. Sargolini, F. Conjunctive representation of position, direction, and velocity in entorhinal cortex. Science. 312, 758-762 (2006).
  6. Fyhn, M., Hafting, T., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. -B. Grid cells in mice. Hippocampus. 18, 1230-1238 (2008).
  7. Giocomo, L. M., Zilli, E. A., Fransén, E., Hasselmo, M. E. Temporal frequency of subthreshold oscillations scales with entorhinal grid cell field spacing. Science. 315, 1719-1722 (2007).
  8. Giocomo, L. M., Hasselmo, M. E. Time constants of h current in layer II stellate cells differ along the dorsal to ventral axis of medial entorhinal cortex. Journal of Neuroscience. 28, 9414-9425 (2008).
  9. Burgalossi, A. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70, 773-786 (2011).
  10. Dodson, P. D., Pastoll, H., Nolan, M. F. Dorsal-ventral organization of theta-like activity intrinsic to entorhinal stellate neurons is mediated by differences in stochastic current fluctuations. J. Physiol. (Lond). 589, 2993-3008 (2011).
  11. Nolan, M., Dudman, J., Dodson, P., Santoro, B. HCN1 channels control resting and active integrative properties of stellate cells from layer II of the entorhinal cortex. Journal of Neuroscience. 27, (2007).
  12. Boehlen, A., Heinemann, U., Erchova, I. The range of intrinsic frequencies represented by medial entorhinal cortex stellate cells extends with age. Journal of Neuroscience. 30, 4585-4589 (2010).
  13. Klink, R., Alonso, A. Morphological characteristics of layer II projection neurons in the rat medial entorhinal cortex. Hippocampus. 7, 571-583 (1997).
  14. van Groen, T. Entorhinal cortex of the mouse: cytoarchitectonical organization. Hippocampus. 11, 397-407 (2001).
  15. Dolorfo, C. L., Amaral, D. G. Entorhinal cortex of the rat: organization of intrinsic connections. The Journal of Comparative Neurology. 398, 49-82 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats