视网膜神经细胞发育和成熟的单细胞的剖析

Neuroscience

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Summary

描述一个孤立单一的视网膜细胞,随后他们的cDNA扩增的方法。单细胞转录揭示了在组织细胞的异质性目前的程度,并揭示了罕见的细胞群的新的标记基因。所附的协议,可以调整,以适应多种不同的细胞类型。

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Goetz, J. J., Trimarchi, J. M. Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons. J. Vis. Exp. (62), e3824, doi:10.3791/3824 (2012).

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Abstract

高度专业化的,但非常小的细胞群体在许多组织中发挥的重要作用。细胞类型特异性标志物和基因表达程序极为罕见的细胞亚群的识别一直是一个挑战,使用标准的整个组织的方法。单个细胞的基因表达图谱允许获得了前所未有的细胞类型,包括只有一个很小的比例,共组织1-7。此外,这种技术可用于研究基因的表达,瞬时表达细胞小的数字,在动态发展过渡8的方案。

这种细胞的多样性的问题反复出现在中枢神经系统(CNS)神经连接可以相当不同的细胞之间发生9。不同的细胞类型的确切的数字是不准确不得而知,但据估计可能有多达1000个不同类型的皮质我tself 10。复杂的神经回路的功能(S)可能依靠一些罕见的神经类型和他们表达的基因。通过确定新的标志物和分子分类不同的神经元,单细胞的方法是在中枢神经系统的细胞类型分析特别有用。它也可能有助于阐明神经发育机制在神经祖发展的早期阶段,通过识别差异表达的基因和基因途径。

作为一种简单,方便地访问组织神经元具有相当的多样性,脊椎动物的视网膜是一个极好的模型系统研究细胞发育,神经细胞的分化和神经多样化的进程。然而,这种细胞的多样性,如中枢神经系统的其他部分,可以决定采取一种特定的细胞命运,推动视网膜祖细胞的遗传途径提出一个问题,特别是考虑到杆感光弥补马jority视网膜细胞总人口的11。在这里,我们报告单( 图1)视网膜细胞中表达的转录的识别方法。单细胞分析技术允许在不同的细胞群体的视网膜2,4,5,12评估为异质目前的金额的。此外,这种方法揭示了一个新的候选基因,可能发挥的作用(S)在决策过程中的细胞命运发生在视网膜祖细胞亚群8。随着协议的一些简单的调整,这种技术可以用于许多不同的组织和细胞类型。

Protocol

1。细胞分离

  1. 流程图,概述了协议,显示图1。特别是在本协议所使用的试剂的目录编号,请参考表1。剖析在PBS洗澡的视网膜。在解剖中,最好是删除的,因为玻璃体视网膜可以阻碍分离和镜头。它并不总是非常重要的,以消除所有的视网膜色素上皮(RPE),并在某些情况下,它可能无法彻底清除它。然而,感光细胞的单细胞分析实验中,RPE应该被删除。未能取出视网膜色素上皮可导致污染的视杆细胞与视网膜色素上皮基因表达概况。这大概是由于感光细胞和视网膜色素上皮之间的连接。
    分离,整个成年小鼠视网膜孵育10分钟,含20在1.5 ml离心管在37°C辅以10毫米肝素钠激活木瓜蛋白酶μL,20μL25毫米5毫米EDTA半胱氨酸,360μL汉克的平衡盐溶液(HBSS中)。用于过滤嘴的枪头整个协议的所有步骤,以尽量减少潜在的污染。木瓜蛋白酶浓度和孵育时间将根据不同的年龄和组织的性质。例如,以游离在产后当天(P0)分离视网膜,孵化10μL激活木瓜蛋白酶,10μL25 5 mM的EDTA的mM的半胱氨酸,与380μL汉克的平衡盐溶液(HBSS中)辅以10毫米肝素钠视网膜在37°C为10分钟来自不同物种的视网膜也需要略有不同的条件。鸡视网膜是比大多数的发展阶段小鼠视网膜更薄。使用10μL激活木瓜蛋白酶,10微升25毫米5毫米EDTA半胱氨酸,380μL汉克的平衡盐溶液(HBSS中)以10毫米为5分钟肝素钠,在37°C间足够的游离ţ这些视网膜。
  2. 轻轻拍打管驱逐任何解决的细胞,然后磨碎轻轻的10-20倍,与P1000移液器。额外的10分钟孵育在37°C,如果坚持大的组织团块,然后再重新磨碎的10-20倍。
  3. 加入5μLDNA酶I(10 U /μL),静置室温5分钟。与P1000移液器轻轻磨碎。时代的确切数目将需要凭经验确定,但一般落在10-20之间。
  4. 在表上的离心机离心3分钟3000转,取出上清液,留在底部100-200微升的液体,挖掘管打跑沉淀。加入1毫升的HBSS和悬浮颗粒,温和研磨。攻管是关键,因为这里只是重新悬浮颗粒与许多视网膜细胞裂解。这是用成年鼠的视网膜尤其如此。
  5. 在3分钟3000转离心,小心取出450μL的PBS上清,重悬包含0.1%的牛血清白蛋白。重要的是尽可能上清删除,以尽量减少从裂解细胞,并从任何产品的分离,可以抑制未来的反应的基因存在。

2。收获的单细胞

  1. 准备两个6厘米的菜,含有5毫升含0.1%BSA的PBS。上一碟板分离的细胞,使细胞至少5分钟解决。被异形的单细胞的性质在很大程度上取决于所用的细胞密度。例如,与荧光标记的GFP标记的细胞非常罕见,整个分离视网膜镀在一个6厘米的菜。对于较为丰富的细胞,细胞少,最初镀,使更容易收获的第一个微管细胞(或非常接近1)。
  2. 将板倒置显微镜分离细胞。我们使用奥林巴斯IMT-2模型。使用微电极已制订一个科幻NE喷嘴(内径0.5毫米,外径1.04毫米)( 图2),连同吸气管,收获一个单细胞。容易进入细胞,当它接近他们的菜放在微量。这是至关重要的吸气管是既不太长也不短距离倒置显微镜(我们用我们的倒置显微镜使用的吸气管为38.1厘米长)的阶段。如果管过长,细胞可能不被驱逐的微量有效地将收集管。我们使用旧的IMT-2型倒置显微镜的首要原因是,我们已经发现它具有理想的距离,吸气装配管阶段。后进入微管,细胞(或细胞)被驱逐到第二盘(洗板),以确保一个只有一个细胞基因表达谱的收获。在第二盘,它通常是必要的,要么删除一个新的微管外来细胞或利息细胞移动到一个不同的位置,以确保只有一个单细胞进入微管。
  3. 当完全从邻近的细胞中分离单个细胞,使用一个新的微管吸的利益,在2.2节细胞,然后直接驱逐到0.2毫升PCR扩增含有4.5μL细胞裂解液管。细胞被驱逐到方管,小心不折断管微量的一角。样品可以在台式离心浸入细胞裂解液中纺简要。这纺通常完成后每5细胞,然后再在含有单细胞裂解液collection.Tubes年底应保持在冰上的单细胞分离时间。为了达到最佳效果,收集单细胞内分离后两个小时的窗口。在这个时候已经过去了,最好是进行逆转录步骤,因为更多的时间已经observ增加RNA降解的机会。

3。反转录

  1. 简单地旋转在台式minicentrifuge的样本,以确保所有的单个细胞,细胞裂解液中浸泡。促进细胞裂解,在70℃孵育90秒的样本。在热循环。立即放回冰管。
  2. 离开管上冰2分钟。对于所有的试剂添加,使用过滤尖枪头,以防止污染。执行反转录,增加0.33微升三标(200 U /μL),0.05μLRNase抑制剂(40 U /μL),0.07μLT4基因32蛋白。孵育50分钟,在50°Ç在热循环反应混合物。为15分钟和地方冰灭活酶在70°C间。
  3. 要删除自由的引子,添加我(20 U /μL)0.1μL酶切缓冲液(10X),0.8μL卫生署2 0(分子生物学级),0.1μL酶切。在37°C孵育30分钟1热循环。孵化在80°C反应25分钟,然后放在冰管的酶失活。

4。尾矿和单细胞PCR

  1. 尾矿的反应混合物加入6μl和使用热循环到20分钟,70℃孵育10分钟的样品在37°C,并保持在4°C间
  2. 加入10μl的PCR反应混合物的尾样本,并执行第二链的合成和PCR扩增,使用下列条件:
    1. 95℃2分钟
    2. 37℃5分钟
    3. 72℃16分钟
    4. 93℃40秒
    5. 67℃1分钟
    6. 72℃6分钟,每个周期6秒
    7. 转到步骤4 34倍
    8. 72℃10分钟
    9. 保持在4°C间

5。 Affymetrix公司芯片的标签

  1. 标签10-20微克的cDNA(浓度扩增的cDNA结果ING集团是从一个单细胞通常~~ 1微克/微升),Affymetrix公司的芯片获得了强大的杂交。首先,在80μL加入10-20μl到的单细胞cDNA 8μL1X一普所有的缓冲和稀释1μL(1点10分在1X一普所有缓冲区)DNaseI基因片段反应。在37°C孵育13分钟热循环灭活DNase I可在100°C和置于冰上15分钟。
  2. 加入20μL5X TDT缓冲区,2.5μL生物素N6-ddATP(恩佐Biosciences公司),1μLTDT(在TDT缓冲区稀释1:8)。
  3. 在37°C孵育90分钟,然后用5分钟在65°C储存在-20°C,或立即向Affymetrix的基因芯片杂交。使用标准的Affymetrix公司的协议,进行杂交。

6。代表结果

评估质量的cDNA,cDNA样本10μL1%琼脂糖凝胶装上。 cDNA的主要判断的尺寸范围(500-2000 BP)和强度的cDNA涂片( 图1图3a)。图1所示的凝胶,每车道显示,从视网膜细胞的cDNA涂片分离E16.5。车道显示之间产生涂片,只有媒体时,被吸入进针,并存入PCR管。这些通道是从来没有完全缺乏淡淡涂抹,但他们没有表现出任何结果,特定基因的PCR引物被用来放大从他们的基因。此外,基因涂片强度可以有所不同(比较图1图3a)。图3A车道A,F,G和H包含强大的cDNA涂片检查,而车道B,C,D和E是相当少的健壮。

基因特异性PCR是用来作为一个从一个单细胞的cDNA质量二级屏幕。在图3的cDNA荧光视网膜神经节细胞的分离和他们睾丸D使用PCR引物对视网膜神经节细胞标记Brn3b和Pax6。对于这个实验中,1μL的cDNA进行PCR 30个循环。实时定量PCR技术将是一个最好的检测,但它可以是昂贵的,是没有必要的,仅仅是评估质量的cDNA。所有的单细胞8药检呈阳性了8 Brn3b和6 PAX6( 图3b)。即使基因涂片Brn3b和Pax6带那么强劲。尽管这些PCR结果,这是我们的经验,如车道B,C,D和E的cDNA涂片不产生强大的杂交Affymetrix公司的阵列,一般可以避免。感光标记CRX基因特异性PCR被用来确定在单细胞的cDNA( 图3b)的污染水平。选择一个感光标记,因为这些细胞使视网膜的大部分(〜70%),因此,任何细胞裂解发生的最有可能涉及棒photoreceptors。在这些基因的筹备工作,只有淡淡的CRX目前的金额,甚至后30 PCR循环。最后,这种基于PCR的屏幕可以用来确定一个特定的细胞类型的子集之前对他们进行全面的芯片分析得出的cDNA。这可以帮助优先细胞是异形的,因为这是在这个过程中最昂贵的一步。例如,我们已经确定了由视网膜神经节细胞亚群的筛选存在的,基因Tachykinin1( 图3b)。

从PCR为基础的小屏幕,特别是单细胞的选择和一个Affymetrix的基因芯片杂交的cDNA。芯片的数据进行比较,可以使用标准的聚类算法发现的模式。如在图4的热图,生成以图形方式表示数据。有两个主要结论,对单细胞分析数据4。首先,在特定的细胞类型的基因表达,发现在这些细胞类型几乎完全后进行单细胞协议。在大多数情况下的一种细胞类型的标记基因也被发现在第二个细胞类型,如观察,双极细胞表达一些“棒”的基因在较低水平,这在第二个单元格类型的表达式可以通过以下方式确认原位杂交或抗体染色。其次,在更多样化的无长突细胞和神经节细胞型材,基因表达的异质性是显而易见的。只表示,在约1/4的发展中国家的神经节细胞pou4f1,,而Nr4a2和Scube2是在不同的无长突细胞的异质性基因表达的两个例子。事实上,在热图中所示的基因只是一个小样本的数百个基因已被确定和发展的神经节细胞的标记,或标记为2,4无长突细胞的不同人群证实。


图1。单细胞分析方法的流程图。第一视网膜是孤立和分离到单个细胞用木瓜蛋白酶。第二,单个细胞的收获与拉的玻璃针和存放到PCR管。裂解细胞的cDNA采用逆转录的PCR扩增。如所示的琼脂糖凝胶上产生的cDNA质量评估。车道后,在第一线的DNA梯状条带,从单个细胞扩增产物交替媒体控制(红色括号表示)的cDNA涂片。涂片质量(红色括号)Affymetrix的基因芯片杂交。

图2
图2。针和吸气管组装的照片。单细胞分离使用的毛细作用拉玻璃微管(内径0.5毫米,外径1.04毫米)和吹吸气压力转移。重要的是,吸气管都足够长的时间,轻松地操纵和足够短,以可靠地履行单个细胞。毛细管拉成针的一个特写视图显示在B

图3
图3。与阴性对照组(A)的基因单细胞涂片检查和基因特异PCR的有代表性的例子。要确定的单细胞基因扩增后的质量,每个单细胞样本的10微升1%琼脂糖凝胶上运行。一抹黑,应该会出现500-2000 BP之间。额外的基于PCR的筛选特定基因可以帮助识别/确认被隔离的细胞类型和污染目前在样品量(B)。视网膜神经节细胞的特定引物标记Brn3b和Pax6进行了测试,以确认这些细胞(行1和2)的身份。评估准备感光污染量,为感光标记CRX的特定的引物被用来(第3行)。神经节细胞的亚群,还可以通过为,如Tachykinin1(4行)标记的筛选确定。

图4
图4。单细胞标记基因的表达。选定在22个不同的单细胞表达的基因芯片结果显示在热图格式。从芯片信号的强度已经调整,以符合红色的强度。黑色表示没有信号的芯片。视网膜神经节细胞(研资局)的前体显示中分离出胚胎的时间点,而其他细胞分离成人视网膜。

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Discussion

被认为是考虑到他们的基因表达6,8更均匀的人口数量不断扩大的研究揭示强大的细胞,细胞变异。至少有一个实例,该基因表达的“噪音”已被证明发挥了重要的生物功能13。使用传统的全组织方法掩盖单个细胞之间的基因表达差异。这些实验产生一个“平均”的细胞,这可能不是代表14的表达谱。在这里,我们提出了一个从单一的视网膜细胞的基因表达模式的分离和鉴定方法。单个细胞的研究,使研究人员能够探测底层的复杂组织细胞的异质性,这是确定鲜明的各种细胞类型的基因表达模式的关键。此外,单细胞的分离,可以提供洞察到驾驶的基因逐张活动方案在时间点idual细胞的整个发展。虽然有用,特别是在研究神经系统的,复杂的蜂窝网络的功能,可以依靠独特罕见的细胞类型的基因表达,该协议可以适应从各种组织中分离单个细胞。

在早期发展的小鼠视网膜神经节细胞,水平细胞,锥感光细胞和无长突细胞都产生重叠的窗口时间15。此外,已退出细胞周期的每个细胞,在不同的成熟阶段,这实际上只增加了复杂性视网膜发育。最后,对于某些类型的视网膜神经细胞,存在着许多不同的形态在成熟的视网膜16(〜30,在无长突细胞的情况下)。由于视网膜是这种混合类型的细胞,基因芯片和基因表达序列分析(SAGE)的基础研究17-19依赖的homogeniz的ATION的整个视网膜都无法发现罕见的亚型,并未能解决动态类型的细胞之间的基因表达差异表达的基因标记,特别是在开发过程中。开始,以了解不同类型的细胞,无论是在成人的视网膜和视网膜发育过程中的复杂性,单细胞〜200来自许多不同的时间点的单个细胞的基因表达图谱进行了分析2-5,8。由此产生的数据提供了一个新的标记单个细胞类型的主机,并成为重要的转变提供了一个窗口,在发育时间,以前不受重视。

单细胞基因表达谱揭示基因表达无长突细胞,它预计在相当大的异质性,并在Müller胶质细胞,这是意想不到的5。虽然检查单的无长突细胞的数据显示超过450个基因表达在无长突细胞和排除来自其他视网膜细胞类型,这些基因的表达在所有4个无长突细胞。这些结果最有可能出现的事实,无长突细胞类是极其多样的和潜在的异质性是反映了这些细胞的独特功能。这些发现将不可能有整个组织为基础的方法。最后,骑自行车的视网膜祖细胞(RPC)的显示在任何异形8视网膜细胞类型的基因表达的异质性程度最高。转录因子类基因与祖细胞之间的异质性程度最高的,这表明动态的基因表达模式,可以在不同的视网膜细胞类型8的发展发挥了重要作用。再次,这些结果将不会有可能不使用的单细胞基因表达分析技术。

单细胞转录组研究还可以利用的洞察力,深入了解疾病的机制。在许多神经退行性疾病,包括视网膜变性疾病,一些神经元的死亡,而邻近的神经元生存20。了解为什么有些细胞发生凋亡,需要改变在这些疾病模型,在单个细胞的基因或基因的鉴定。全组织模型可能会再次掩盖往往不会死在同一时间,因此,在任何特定时间的组织是死亡和存活细胞的混合物,因为细胞的变化。此外,对于许多癌症细胞的起源是一个悬而未决的问题。这是特别是儿童眼肿瘤视网膜母细胞瘤的情况下。最近使用协议的细节在这里单细胞分析,结果表明,视网膜母细胞瘤单个细胞拥有21多种细胞类型的基因表达程序。看来,这些细胞是未分化的祖细胞和神经元的2杂种1。这些实验需要在单细胞水平上分析,不会有可能与整个组织的方法。

替代方法

线性放大是一种基于PCR扩增协议的详细的替代。而基于PCR扩增被认为是导致倾斜的丰度关系,被认为是线性放大,以维持这些关系22。线性扩增技术已被用来剖析几个神经类型23。然而,这两种方法之间的直接比较表明,线性扩增技术,可以具有较高的假阴性率24,25。我们赞成在这份报告中详述的原因有两个基于PCR的方法。首先,在我们的实验中,我们重点放在基因与细胞之间的强大的表达差异。第二,我们已经找到了很好的相关性之间的单细胞芯片亲提交实验,并在相同的基因原位杂交研究。事实上,到目前为止,我们已经完成数百个基因的原位杂交,并观察至少75%的匹配从芯片的预测模式。这很可能是一个保守的估计,因为有差异的最常见的原因是缺乏原位探测信号。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

References

  1. Tietjen, I. Single-cell transcriptional analysis of neuronal progenitors. Neuron. 38, 161-175 (2003).
  2. Trimarchi, J. M. Molecular heterogeneity of developing retinal ganglion and amacrine cells revealed through single cell gene expression profiling. J. Comp. Neurol. 502, 1047-1065 (2007).
  3. Trimarchi, J. M., Cho, S. H., Cepko, C. L. Identification of genes expressed preferentially in the developing peripheral margin of the optic cup. Dev. Dyn. 238, 2327-2327 (2009).
  4. Cherry, T. J., Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Development and diversification of retinal amacrine interneurons at single cell resolution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9495-9500 (2009).
  5. Roesch, K. The transcriptome of retinal Muller glial cells. J. Comp. Neurol. 509, 225-238 (2008).
  6. Ramos, C. A. Evidence for diversity in transcriptional profiles of single hematopoietic stem cells. PLoS Genet. 2, e159 (2006).
  7. Chiang, M. K., Melton, D. A. Single-cell transcript analysis of pancreas development. Dev. Cell. 4, 383-393 (2003).
  8. Trimarchi, J. M., Stadler, M. B., Cepko, C. L. Individual retinal progenitor cells display extensive heterogeneity of gene expression. PLoS ONE. 3, e1588 (2008).
  9. Nelson, S. B., Sugino, K., Hempel, C. M. The problem of neuronal cell types: a physiological genomics approach. Trends Neurosci. 29, 339-345 (2006).
  10. Stevens, C. F. Neuronal diversity: too many cell types for comfort. Curr. Biol. 8, R708-R710 (1998).
  11. Cepko, C. L., Austin, C. P., Yang, X., Alexiades, M., Ezzeddine, D. Cell fate determination in the vertebrate retina. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 589-595 (1996).
  12. Kim, D. S. Identification of molecular markers of bipolar cells in the murine retina. J. Comp. Neurol. 507, 1795-1810 (2008).
  13. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453, 544-547 (2008).
  14. Levsky, J. M., Singer, R. H. Gene expression and the myth of the average cell. Trends Cell Biol. 13, 4-6 (2003).
  15. Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nat. Rev. Neurosci. 2, 109-118 (2001).
  16. Masland, R. H., Raviola, E. Confronting complexity: strategies for understanding the microcircuitry of the retina. Annu. Rev. Neurosci. 23, 249-284 (2000).
  17. Blackshaw, S. Genomic analysis of mouse retinal development. PLoS Biol. 2, e247 (2004).
  18. Livesey, F. J., Young, T. L., Cepko, C. L. An analysis of the gene expression program of mammalian neural progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1374-1379 (2004).
  19. Chowers, I. Identification of novel genes preferentially expressed in the retina using a custom human retina cDNA microarray. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 3732-3741 (2003).
  20. Clarke, G. C., Leavitt, R. A., Andrews, B. R., Hayden, D. F., Lumsden, M. R., J, C., McInnes, R. R. A one-hit model of cell death in inherited neuronal degenerations. Nature. 406, 195-199 (2000).
  21. McEvoy, J. F. -O., Zhang, J., Nemeth, J., Brennan, K., Bradley, R., Krafcik, C., Rodriguez-Galindo, F., Wilson, C., Xiong, M., Lozano, S. Coexpression of normally incompatible developmental pathways in retinoblastoma genesis. Cancer Cell. 20, 260-275 (2011).
  22. Gelder, R. N. V. an Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).
  23. Ginsberg, S. D., Che, S. Expression profile analysis within the human hippocampus: comparison of CA1 and CA3 pyramidal neurons. J. Comp. Neurol. 487, 107-118 (2005).
  24. Iscove, N. N. Representation is faithfully preserved in global cDNA amplified exponentially from sub-picogram quantities of mRNA. Nat. Biotechnol. 20, 940-943 (2002).
  25. Subkhankulova, T., Livesey, F. J. Comparative evaluation of linear and exponential amplification techniques for expression profiling at the single-cell level. Genome Biol. 7, R18 (2006).

Comments

2 Comments

  1. The text refers to Table 1 for a list of reagents, but I am not finding this table. If is possible to get the cat #s for reagents used? Thanks.

    Reply
    Posted by: D V.
    October 9, 2015 - 4:25 PM
  2. Yes I notice that the pdf for Table 1 somehow got lost in the shuffle. I am happy to provide that for you if you email me directly.

    Reply
    Posted by: Jeff T.
    October 9, 2015 - 5:40 PM

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