Desenvolvimento Sexual e descarga de ascósporos em Fusarium graminearum

Biology
 

Summary

Cruzamentos sexuais e isolamento da progênie recombinante são importantes ferramentas de pesquisa para o fungo filamentoso,

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Cavinder, B., Sikhakolli, U., Fellows, K. M., Trail, F. Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum. J. Vis. Exp. (61), e3895, doi:10.3791/3895 (2012).

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Abstract

Fusarium graminearum tornou-se um sistema modelo para estudos em desenvolvimento e patogenicidade de fungos filamentosos. F. graminearum mais facilmente produz corpos de frutificação, chamados peritécios, em ágar cenoura. Peritécios conter inúmeros tipos de tecidos, produzidas em fases específicas do desenvolvimento peritécio. Estes incluem (por ordem de aparecimento) a formação de as iniciais peritécio (que dão origem às hifas ascogenous), a parede exterior, paráfise (micélios estéril que ocupam o centro do peritécio até que o ascos desenvolver), o ascos, e os ascósporos dentro do ascos 14. O desenvolvimento de cada um destes tecidos é separado por aproximadamente 24 horas e tem sido a base em estudos transcriptomic durante o desenvolvimento sexual 12,8. Consulte Hallen et al. (2007) para uma descrição mais completa do desenvolvimento, incluindo fotografias de cada etapa. Aqui, apresentamos os métodos para gerar e colher síncronaly desenvolvimento de gramados de peritécios para estudos temporais de regulação gênica, desenvolvimento e processos fisiológicos. Embora estes métodos são escritos especificamente para ser utilizado com F. graminearum, as técnicas podem ser utilizadas para uma variedade de outros fungos, desde que a frutificação pode ser induzida em cultura e há algum sincronia com o desenvolvimento. Recentemente adaptado este protocolo para estudar o desenvolvimento sexual de F. verticillioides. Embora peritécios indivíduo deve ser colhido manualmente nesta espécie, porque um gramado de desenvolver peritécios não poderia ser induzido, o processo funcionou bem para estudar o desenvolvimento (Sikhakolli e Trail, inédito).

A função mais importante de corpos de frutificação de fungos é a dispersão de esporos. Em muitas das espécies de Ascomycota (ascus produzindo fungos), os esporos são disparadas a partir do ascus, devido à geração de pressão de turgescência dentro do ascus, dirigindo ejecção de esporos (e fluido epiplasmic) através doporo na ponta ascus 2,7. Nossos estudos de descarga de ascósporos forçada resultaram no desenvolvimento de um "ensaio de descarga de esporos", que usamos para triagem de mutações no processo. Apresentamos aqui os detalhes deste ensaio.

F. graminearum é homothallic e, portanto, pode formar corpos de frutificação, na ausência de um parceiro compatível. A vantagem de homothallism é que atravessamento não é necessária para gerar descendência homozigótica para um traço particular, uma faceta que facilitou o estudo do desenvolvimento sexual nesta espécie 14,7. No entanto, as estirpes heterotálico ter sido gerados que podem ser utilizados para a passagem 5,9. É também possível para atravessar as estirpes homothallic para se obter mutantes para vários genes na estirpe um 1. Isso é feito por coinoculating uma placa de Petri com 2 estirpes. Ao longo do ponto de encontro, a maioria dos peritécios será recombinante (fornecida uma mutação em uma das estirpes-mãe não inibede cruzamento). Com a idade peritécios, eles exalam ascósporos em massa ao invés de descarregá-los à força. O exsudado de esporos resultante (chamado um cirrhus) senta-se a ponta do peritécio e pode ser facilmente removido para a recuperação de esporos individuais. Aqui nós apresentamos um protocolo para facilitar a identificação de recombinante peritécios ea recuperação da progênie recombinante.

Protocol

1. Produzindo peritécios

  1. Centro de ágar cenoura inocular 10 em um centímetro de diâmetro 6,0 prato de Petri com uma cepa fértil de F. graminearum (Recomenda PH-1).
  2. O local de inoculação de pratos sob brilhantes luzes fluorescentes à temperatura ambiente (18-24 ° C) e deixa-se crescer até micélio tenha atingido o bordo exterior da placa de Petri (3-5 dias). Luzes fluorescentes domésticas comerciais funcionam bem para estimular a formação de frutificação corpo e descarga.
  3. Remova cuidadosamente o micélio aéreo com um palito estéril.
  4. Distribuir 1,0 ml 2,5% de Tween 60 aq à superfície com uma hockeystick vidro estéril ou extremidade arredondada de uma vareta de vidro estéril.
  5. Retornar placas à luz. Não adicione Parafilm para placas.
  6. Após 24 h, a superfície das placas devem ter uma aparência brilhante. Se micélios reaparece, raspagem de superfície e reaplicar Tween-60 solução.
  7. Observe o desenvolvimento de peritécios na próxima semana. Os estágios intermediários dedesenvolvimento peritécio pode ser colhido por suavemente raspagem da superfície do agar e flash congelado para RNA de extracção (Figura 1).
  8. Esporos maduros irá acumular-se na tampa do prato por dia 7. Inicialmente, estes só será visível sob um microscópio de dissecação, mas por dia 9, eles irão ter acumulado à densidade suficiente de modo a ser visível a olho nu.

2. Ensaio de descarga de ascósporos

  1. No dia 6 após a aplicação da solução de Tween, cortar um círculo 1 cm de diâmetro para fora do ágar com uma broca de madeira. Alternativamente, um bisturi pode ser usado para remover um segmento de dimensões semelhantes. O círculo pode ser cortado ao meio e cada metade colocada numa lâmina de microscópio de vidro.
  2. Orientar as peças para a superfície contendo os corpos de frutificação é perpendicular à superfície da lâmina, e os esporos são disparados ao longo do comprimento da lâmina.
  3. Colocar a lâmina em uma câmara de umidade durante a noite sob as luzes. Esporos irá acumular sobrea corrediça e ser visível a olho nu na manhã seguinte (Figura 2).
  4. Esporos acumulados podem ser lavadas para fora do slide com água e quantificados, se desejado.
  5. Potenciais inibidores de descarga de ascósporos pode ser ensaiada adicionando-os para o lado de trás do bloco de agar durante a montagem do ensaio. Alguns inibidores de canais iónicos que reduzem descarga foram previamente testados com esta técnica 15.

3. Geração de progênie recombinante

  1. Iniciado atravessar através da inoculação em ágar cenoura com duas cepas de F. graminearum (um Nit + e um nit-), colocando os pontos de inoculação em lados opostos da placa de Petri.
  2. Uma vez que as hifas ter enchido a superfície, raspar parte aérea e aplicar Tween-60 solução como acima descrito. Use um marcador notar, no lado da placa de Petri onde as hifas se encontram.
  3. Voltar culturas à luz e incubar até peritécios têm desenvolvido, e ter barbilhoes serarma para formar a partir do peritécio ao longo da intersecção entre as duas culturas.
  4. Sob o microscópio de dissecação, pôr em ver a peritécios ao longo da intersecção das duas culturas. Usando um pino de insectos, esterilizados e mergulhado em água estéril, um toque cirrhus ao longo desta fronteira levemente com a ponta do pino. A umidade no pino deve permitir que os cirrhus para manter o pino.
  5. Lavar a extremidade do pino com os cirrhus sobre ele em 200 uL de água estéril num tubo de Eppendorf para lavar os esporos fora.
  6. Chama a pino, umedecê-la novamente e escolher outra cirrhus. Escolha 10-15 barbilhoes, e colocar cada em um tubo separado de água.
  7. Resumidamente tubos vortex contendo suspenso barbilhoes.
  8. Remover 60 uL da suspensão de esporos com uma pipeta, coloque em MMTS meio 1 em um prato 9 centímetros de Petri. Espalhe com um taco de hóquei estéril. A suspensão de esporos restante pode ser armazenado a 4 ° C durante até uma semana e replated se necessário.
  9. Incubaçãote à temperatura ambiente (luz não necessário) durante 3-5 dias até as colónias muito pequenas aparecem (Figura 3). Haverá dois tipos de fenótipos entre as colônias. As colônias de nit terá hifas esparsa que as colónias + NIT. Barbilhoes de recombinante peritécios irá mostrar ambos os fenótipos de colônias em proporção aproximadamente igual. Descartar as placas com colônias de apenas um único fenótipo sobre eles. Note que às vezes mais de dois fenótipos resultar devido à segregação de outros fatores.
  10. Mova colônias de V8 ou ágar cenoura para o armazenamento. Colónias de teste em Agar Czapek Dox (os estirpes nit-não vai crescer em Dox Czapek) e em PDA com clorato (0,5 M clorato de potássio; as estirpes + de nit não vai crescer em PDA com clorato) para confirmar a correcta fenótipo. Examine essas colônias para as qualidades desejadas.

4. Os resultados representativos

Produzindo peritécios

O objectivo é ter um relvado deperitécios sem qualquer micélios ou esporos aparentes. A superfície da cultura aparecerá semelhante a veludo preto (Figura 1). Aos 24 hr após a aplicação de Tween a superfície do ágar deve ter um ligeiro brilho. Se micélios reaparecer, então a placa não pode ter sido raspada suficiente para induzir o desenvolvimento peritécio.

Ascósporos de descarga

Sempre fornecer na sua ensaio vários blocos de agar a partir da estirpe de tipo selvagem. Se aqueles que não fazer fogo, em seguida, os peritécios são demasiado jovem ou demasiado velho. Se eles são muito antiga, em seguida hifas numerosos irá aparecer sobre a superfície da cultura dando-lhe uma tonalidade esbranquiçada. Se este não for o caso, eles podem ser muito jovens, e no ensaio deve ser tentada de novo em 24 hr. Ocasionalmente, as culturas não cumprir bem, eo experimento terá que ser repetido. Certifique-se de realizar o ensaio nas condições de luz adequadas.

Progênie recombinante

A Figura 1
Figura 1. Estágios de desenvolvimento peritécio em agar de cenoura. H, para a esquerda 72 após a aplicação de Tween. Observação pigmento vermelho e peritécios muito jovem visível como uma grãos negros na superfície. Direito de, a 144 h, peritécios maduros ter se formado. Nota quase completa ausência de micélio superficial em ambas as culturas.

A Figura 2
Figura ensaio de descarga 2.. A ficha de agar de laranja cenoura é orientada de modo thaesporos t forçosamente descarregadas a partir do peritécios maduro na sua superfície podem acumular-se sobre a superfície da lâmina de vidro. 15 hr tempo de acumulação.

A Figura 3
Figura 3. Diferenças de crescimento entre Nit + e-NIT colônias em meio MMTS seletivo. As colónias nit-(pontas de seta) são menores. A NIT + de colônias (setas) mostram um crescimento robusto. Fotografia tirada depois de 7 dias.

Discussion

F. graminearum está particularmente bem adaptado para o estudo do desenvolvimento corpo de frutificação, devido à disponibilidade de um genoma bem anotado ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / ; 4), e da disponibilidade de uma Affymetrix- baseado microarray 6. Isto facilitou a capacidade de identificar genes importantes para ascósporos descarga 7,11,3. Os métodos apresentados aqui permitirá que o pesquisador se concentrar em um conjunto discreto de estágios de desenvolvimento e funções para a análise genética dos corpos de frutificação de F. graminearum. Os métodos também são facilmente adaptáveis ​​a fungos relacionados que podem ser induzidos a fruta em cultura, e pode ser usado como um padrão para o desenvolvimento de uma variedade de outros tipos de corpo de frutificação fúngicas.

A capacidade de avaliar um fenótipo de disparo de esporos podem ser sutis em espécies onde os esporos são pequenos e difíceis de ver, como Sclerotinia sclerotiorum.

Disclosures

Não temos nada a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi suportado por uma concessão do National Science Foundation (MCB-0923794 para FT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fusarium graminearum strain PH-1 Fungal Genetics Stock Center FGSC 9075
Tween 60 Sigma-Aldrich P1629
Czapek’s Dox Agar Difco Laboratories 233810
Potassium Chlorate Sigma-Aldrich 255572

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References

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Comments

5 Comments

  1. Dear Dr Cavinder,
    please can you explain why the Tween solution must be applied to the culture after the mycelium is removed? what happens if you don't apply the Tween solution? and is this a method that is used in other fungi as well to induce perithecium production?
    kind regards,
    Dr Reiny Scheper reiny.scheper@plantandfood.co.nz

    Reply
    Posted by: Reiny S.
    January 13, 2014 - 12:35 AM
  2. Dear Dr. Scheper,
    We have found that removing the excess mycelium and applying the Tween solution results in the most consistent and prolific perithecium production in our strain. You may find other variations work in your strain.

    Reply
    Posted by: Frances T.
    January 13, 2014 - 7:39 AM
  3. Dear Dr Cavinder,
    Thank you for your reply. I was wondering why Tween? what does it do and how did you come up with the idea to try Tween? is there a paper describing how you (or someone else) determined the optimal method for perithecium production?
    kind regards,
    Reiny

    Reply
    Posted by: Reiny S.
    January 13, 2014 - 7:07 PM
  4. Yes, the Tween is not our method, but has been published in the following manuscript: Klittich CJR, Leslie JF. 1988. Nitrate reduction mutants in
    Fusariunz moniliforme ( Gibbmlla fujikz~roi.) Genetics
    118:417-423.

    Reply
    Posted by: Frances T.
    January 13, 2014 - 7:47 PM
  5. thank you :-)

    Reply
    Posted by: Reiny S.
    January 13, 2014 - 8:32 PM

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