Développement sexuel et la libération des ascospores dans Fusarium graminearum

Biology
 

Summary

Croisements sexués et l'isolement de la descendance recombinante sont des outils de recherche importants pour le champignon filamenteux,

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cavinder, B., Sikhakolli, U., Fellows, K. M., Trail, F. Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum. J. Vis. Exp. (61), e3895, doi:10.3791/3895 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Fusarium graminearum est devenu un système modèle pour les études en matière de développement et de la pathogénicité des champignons filamenteux. F. graminearum produit le plus facilement les organes de fructification, appelés périthèces, sur gélose de carotte. Les périthèces contiennent de nombreux types de tissus, des produits à des stades spécifiques du développement périthèce. Il s'agit notamment (par ordre d'apparition) la formation des initiales périthèce (qui donnent lieu à des hyphes ascogènes), la paroi extérieure, paraphyses (mycélium stérile qui occupent le centre du périthèce jusqu'à ce que le asques se développent), le asques, les ascospores et les au sein de l'asques 14. Le développement de chacun de ces tissus est séparé par environ 24 heures et a été la base d'études de transcriptomique pendant le développement sexuel 12,8. Reportez-vous à Hallen et al. (2007) pour une description plus approfondie du développement, y compris des photographies de chaque étape. Ici, nous présentons les méthodes pour générer et à la récolte synchronement le développement de pelouses périthèces pour les études temporelles de la régulation des gènes, le développement et les processus physiologiques. Bien que ces méthodes sont écrites spécifiquement pour être utilisé avec F. graminearum, les techniques peuvent être utilisées pour une variété d'autres champignons, à condition que la fructification peut être induite dans la culture et il ya une certaine synchronie au développement. Nous avons récemment adapté ce protocole d'étudier le développement sexuel de F. verticillioides. Bien que les périthèces individu doit être cueillies à la main dans cette espèce, car une pelouse de développer périthèces n'a pas pu être induite, le processus a bien fonctionné pour étudier le développement (Sikhakolli et Trail, non publié).

La fonction la plus importante des fructifications fongiques est la dispersion des spores. Dans la plupart des espèces de Ascomycota (asque produire des champignons), les spores sont abattus à partir de l'asque, en raison de la génération de la pression de turgescence au sein de l'asque, la conduite d'éjection de spores (et fluide epiplasmic) par l'intermédiaire dupores dans la pointe asque 2,7. Nos études de la libération des ascospores forcé ont abouti à l'élaboration d'un "test de décharge des spores", que nous utilisons pour dépister des mutations dans le processus. Nous présentons ici les détails de cet essai.

F. graminearum est homothallique, et ne peut donc former des fructifications en l'absence d'un partenaire compatible. L'avantage de ce passage à niveau est homothallisme n'est pas nécessaire de générer des homozygotes progéniture pour un trait particulier, une facette qui a facilité l'étude du développement sexuel chez cette espèce 14,7. Cependant, les souches hétérothalliques est généré, qui peut être utilisé pour le franchissement 5,9. Il est également possible de traverser les souches homothalliques d'obtenir des mutants pour plusieurs gènes dans une souche 1. Cela se fait par un plat de Petri coinoculating avec 2 souches. Outre le point de rencontre, la majorité des périthèces sera recombinant (à condition d'une mutation dans l'un des souches parentales n'inhibe paspollinisation croisée). Comme l'âge périthèces, ils respirent la ascospores en masse au lieu de les évacuer de force. L'exsudat de spores résultant (appelé cirrhus) se trouve à la pointe du périthèce et peut facilement être enlevé pour la récupération des spores individuelles. Ici, nous présentons un protocole pour faciliter l'identification des périthèces recombinant et la récupération de la descendance recombinante.

Protocol

1. Produire périthèces

  1. Agar Centre carotte inoculer 10 en a 6,0 cm de diamètre boîte de Pétri avec une souche fertile de F. graminearum (PH Recommander-1).
  2. Lieu inoculé plats sous les lumières lumineuses fluorescentes à température ambiante (18-24 ° C) et laisser croître jusqu'à ce que le mycélium a atteint le bord extérieur de la boîte de Pétri (3-5 jours). Les lampes domestiques commerciaux fluorescentes fonctionnent très bien pour stimuler la formation de corps de fructification et de décharge.
  3. Retirez délicatement le mycélium aérien avec un cure-dent stérile.
  4. Distribuer 1,0 ml de 2,5% de Tween 60 aq à la surface avec une Hockeystick verre stérile ou d'extrémité arrondie d'une tige en verre stérile.
  5. Remettre les assiettes à la lumière. Ne pas ajouter de Parafilm à plaques.
  6. Après 24 h, la surface des plaques doit avoir un aspect brillant. Si mycélium réapparaît, la surface gratter et une nouvelle demande de Tween-60 solution.
  7. Observer le développement des périthèces cours de la semaine prochaine. Les étapes intermédiaires dedéveloppement périthèce peut être récolté en grattant doucement la surface de l'agar-agar et surgelés pour extraction de l'ARN (Figure 1).
  8. Les spores mûres vont s'accumuler sur le couvercle de la plaque par jour 7. Au départ, ces ne sera visible que sous un microscope à dissection, mais le jour 9, ils se sont accumulés à une densité suffisante de manière à être visible à l'œil nu.

2. Essai de décharge des ascospores

  1. Au jour 6 après l'application de la solution de Tween, couper un cercle de 1 cm de diamètre sur l'agar-agar avec un perce-bois. Alternativement, un scalpel peut être utilisé pour enlever un segment de taille similaire. Le cercle peut être coupé en deux et chaque moitié placé sur une lame de microscope en verre.
  2. Orienter les pièces afin que la surface contenant les fructifications est perpendiculaire à la surface de la diapositive, et les spores sont tirés vers le bas la longueur de la glissière.
  3. Placer la lame dans une chambre humide pendant la nuit sous les lumières. Les spores vont s'accumuler sur lesla lame et être visible à l'œil nu le matin suivant (Figure 2).
  4. Spores accumulées peuvent être lavés de la lame à l'eau et quantifiés si vous le souhaitez.
  5. Inhibiteurs potentiels de la décharge d'ascospores peuvent être analysés en les ajoutant à l'arrière du bloc de gélose pendant le montage de l'essai. Certains inhibiteurs de canaux ioniques qui permettent de réduire la décharge ont déjà été testés avec cette technique 15.

3. Génération d'une descendance recombinante

  1. Initier traverser en inoculant agar carotte avec deux souches de F. graminearum (un Nit + et l'autre à lentes), plaçant les points de inoculation sur des côtés opposés de la boîte de Petri.
  2. Une fois que les hyphes ont rempli la surface, grattez partie aérienne et appliquer une solution de Tween-60 tel que décrit ci-dessus. Utilisation d'un marqueur de noter sur le côté de la boîte de Petri, où les hyphes répondre.
  3. Retour cultures à la lumière et incuber jusqu'à périthèces se sont développés, et ont cirrhes êtrearmes à feu pour former de l'périthèces long de l'intersection entre les deux cultures.
  4. Sous le microscope de dissection, mettre en voir les périthèces long de l'intersection des deux cultures. Utilisation une broche d'insecte, stérilisé et trempée dans de l'eau stérile, un toucher cirrhus long de ce bord légèrement avec l'extrémité de la broche. L'humidité sur la broche devrait permettre aux cirrhus de s'en tenir à la broche.
  5. Rincer l'extrémité de la broche avec les cirrhus sur elle dans 200 ul d'eau stérile dans un tube Eppendorf de se laver les spores hors tension.
  6. Flamme de la broche, l'humidifier et reprendre un autre cirrhus. Très 10 à 15 cirrhes, et placer chacun dans un tube séparé de l'eau.
  7. Tubes vortex brièvement suspendue contenant cirrhes.
  8. Retirer 60 pl de la suspension de spores avec une pipette et le lieu sur un milieu MMTS 1 dans un plat de Pétri de 9 cm. Étaler avec une crosse de hockey stérile. La suspension de spores restant peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine et réétalées si nécessaire.
  9. Incubationte à la température ambiante (la lumière n'est pas nécessaire) pendant 3-5 jours jusqu'à ce que les très petites colonies apparaissent (Figure 3). Il y aura deux sortes de phénotypes entre les colonies. Les colonies lentes aura hyphes moins nombreuses que les colonies + NIT. Cirrhes de recombinaison périthèces se montrent les deux phénotypes colonie en proportion à peu près égale. Jeter les plaques avec des colonies de seulement un phénotype unique sur eux. Notez que, parfois, plus de deux phénotypes survenir en raison de la ségrégation des autres facteurs.
  10. Déplacer les colonies à V8 ou de l'agar de carotte pour le stockage. Colonies de test sur gélose de Czapek Dox (les souches lentes ne poussent pas sur Czapek Dox) et sur le PDA avec le chlorate (0,5 M chlorate de potassium; les souches + NIT ne poussent pas sur PDA avec le chlorate) pour confirmer le phénotype correcte. Examinez ces colonies pour les qualités souhaitées.

4. Les résultats représentatifs

Produire des périthèces

Le but est d'avoir une pelouse depérithèces sans mycélium ou des spores apparentes. La surface de la culture sera semblable au velours noir (Figure 1). À 24 h après l'application de Tween la surface de la gélose doit avoir un léger lustre. Si mycélium réapparaissent, puis la plaque peuvent ne pas avoir été gratté assez pour induire le développement périthèce.

Ascospores décharge

Toujours prévoir dans votre test de plusieurs blocs de gélose à partir de la souche de type sauvage. Si ceux qui ne se déclenchent pas, alors soit vos périthèces sont trop jeunes ou trop vieux. Si ils sont trop vieux, alors de nombreux hyphes apparaîtra au-dessus de la surface de la culture en lui donnant une teinte blanchâtre. Si ce n'est pas le cas, ils peuvent être trop jeune, et le dosage doit être jugé à nouveau en 24 h. Parfois, les cultures ne se déchargent pas bien, et l'expérience devra être répétée. Assurez-vous effectuer le test dans les conditions de lumière propres.

Descendance recombinante

Figure 1
Figure 1. Les étapes du développement périthèce sur gélose de carotte. Gauche, 72 h après l'application de Tween. Notez pigment rouge et périthèces très jeune visibles que quelques grains noirs sur la surface. A droite, à 144 h, périthèces matures ont formé. Notez l'absence quasi-complète du mycélium superficiel dans les deux cultures.

Figure 2
Test de décharge Figure 2.. La fiche orange carotte agar est orienté de façon thaspores t force déchargés de la périthèces matures sur sa surface peuvent s'accumuler sur la surface de la lame de verre. 15 h temps d'accumulation.

Figure 3
Figure 3. Les différences de croissance entre Nit nit + et des colonies sur milieu MMTS sélective. Les colonies nit-(pointes de flèches) sont plus petits. Les + de Nit colonies (flèches) montrent une croissance robuste. Photo prise au bout de 7 jours.

Discussion

F. graminearum est particulièrement bien adapté à l'étude du développement du corps fructifère en raison de la disponibilité d'un génome bien annotée ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / ; 4), et de la disponibilité d'un Affymetrix- sur la base microréseau 6. Cela a facilité la capacité à identifier les gènes importants pour la libération des ascospores 7,11,3. Les méthodes présentées ici permettent au chercheur de se concentrer sur un ensemble discret de stades de développement et des fonctions pour l'analyse génétique des fructifications de F. graminearum. Les méthodes sont également facilement adaptables aux champignons connexes qui peuvent être induites à fruits dans la culture, et peut être utilisé comme un standard pour le développement dans une variété d'autres types de fructification des champignons.

La capacité d'évaluer un phénotype de tir des spores peuvent être subtils dans les espèces où les spores sont de petite taille et difficiles à voir, comme Sclerotinia sclerotiorum.

Disclosures

Nous n'avons rien à communiquer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Science Foundation (MCB-0923794 à FT).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fusarium graminearum strain PH-1 Fungal Genetics Stock Center FGSC 9075
Tween 60 Sigma-Aldrich P1629
Czapek’s Dox Agar Difco Laboratories 233810
Potassium Chlorate Sigma-Aldrich 255572

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bowden, R. L., Leslie, J. F. Sexual recombination in Gibberella zeae. Phytopathology. 89, 182-188 (1999).
  2. Buller, A. H. R. Researches on Fungi. Longmans, Green and Co. London, England. (1909).
  3. Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).
  4. Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization. Science. 317, 1400-1402 (2007).
  5. Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae. Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).
  6. Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta. Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).
  7. Hallen, H., Trail, F. The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).
  8. Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins. Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).
  9. Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae. Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).
  10. Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi. Genetics. 118, 417-423 (1988).
  11. Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae. Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).
  12. Qi, W., Kwon, C., Trail, F. Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum). Molecular Genetics and Genomics. 276-287 (2006).
  13. Trail, F. Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota. FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).
  14. Trail, F., Common, R. Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study. Mycologia. 92, 130-138 (2000).
  15. Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum. Mycologica. 94, 181-189 (2002).

Comments

5 Comments

  1. Dear Dr Cavinder,
    please can you explain why the Tween solution must be applied to the culture after the mycelium is removed? what happens if you don't apply the Tween solution? and is this a method that is used in other fungi as well to induce perithecium production?
    kind regards,
    Dr Reiny Scheper reiny.scheper@plantandfood.co.nz

    Reply
    Posted by: Reiny S.
    January 13, 2014 - 12:35 AM
  2. Dear Dr. Scheper,
    We have found that removing the excess mycelium and applying the Tween solution results in the most consistent and prolific perithecium production in our strain. You may find other variations work in your strain.

    Reply
    Posted by: Frances T.
    January 13, 2014 - 7:39 AM
  3. Dear Dr Cavinder,
    Thank you for your reply. I was wondering why Tween? what does it do and how did you come up with the idea to try Tween? is there a paper describing how you (or someone else) determined the optimal method for perithecium production?
    kind regards,
    Reiny

    Reply
    Posted by: Reiny S.
    January 13, 2014 - 7:07 PM
  4. Yes, the Tween is not our method, but has been published in the following manuscript: Klittich CJR, Leslie JF. 1988. Nitrate reduction mutants in
    Fusariunz moniliforme ( Gibbmlla fujikz~roi.) Genetics
    118:417-423.

    Reply
    Posted by: Frances T.
    January 13, 2014 - 7:47 PM
  5. thank you :-)

    Reply
    Posted by: Reiny S.
    January 13, 2014 - 8:32 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics