Affinity Rensing av influensavirus ribonucleoprotein Komplekser fra Chromatin av infiserte celler

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Influensavirus kopiere deres RNA genomet i forbindelse med host-celle kromatin. Her presenterer vi en metode for å rense intakte viral ribonucleoprotein komplekser fra kromatin av infiserte celler. Renset virale komplekser kan analyseres av både Western blot og primer forlengelse av protein og RNA innhold, henholdsvis.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Chase, G. P., Schwemmle, M. Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells. J. Vis. Exp. (64), e4028, doi:10.3791/4028 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Som alle negative-Strand RNA virus, er genomet til influensavirus pakket i form av viral ribonucleoprotein komplekser (vRNP), der single-strandet genomet er encapsidated av nucleoprotein (NP), og tilknyttet trimeric polymerase som består av PA, PB1, og PB2 underenhetene. Men i motsetning til de fleste RNA virus, influensavirus utføre viral RNA syntese i kjernen av infiserte celler. Interessant, bruker viral mRNA-syntese cellulære pre-mRNA som primere, og det har blitt foreslått at denne prosessen foregår på kromatin en. Interaksjoner mellom viral polymerase og verten RNA polymerase II, samt mellom NP og vert nucleosomes har også blitt karakterisert 1,2.

Nylig, generering av rekombinante influensavirus som koder en One-Strep-Tag genetisk smeltet til C-terminus av PB2 subenhet av viral polymerase (rWSN-PB2-Strep 3) har væreEN beskrevet. Disse rekombinante virus tillate rensing av PB2-holdige komplekser, inkludert vRNPs, fra infiserte celler. For å oppnå renset vRNPs, blir cellekulturer smittet, og vRNPs er affinitet renset fra lysates avledet fra disse cellene. Imidlertid har de lysis prosedyrer som brukes hittil vært basert på ett-trinns vaskemiddel lysis, som, til tross for tilstedeværelsen av en generell nuklease, ofte trekke kromatin-bundet materiale bare ineffektivt.

Vårt forarbeidet antydet at en stor del av kjernefysiske vRNPs ikke ble trukket under tradisjonell cellelyse, og derfor ikke kunne være slektskap renset. For å øke denne utvinning effektivitet, og å skille kromatin-bundet fra ikke-kromatin-bundet kjernefysiske vRNPs, tilpasset vi en trinnvis subcellulære utvinning protokollen til influensa virus-infiserte celler. Kort, skiller denne prosedyren første kjernene fra cellen og deretter trekker oppløselige kjernefysiske proteiner (her kalt "nucleoplasmic" fraksjon).De resterende uløselige kjernefysisk materiale blir så fordøyd med Benzonase, en uspesifikk DNA / RNA nuklease, etterfulgt av to salt ekstraksjonsmetoder trinn: først med 150 mM NaCl (kalt "ch150"), deretter 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1 ). Disse salt ekstraksjonsmetoder trinnene ble valgt basert på observasjon vår at 500 mM NaCl var tilstrekkelig til å solubilize over 85% av kjernefysiske vRNPs likevel tillate binding av kodede vRNPs til affinitet matrisen.

Etter subcellulære fraksjonering av infiserte celler, er det mulig å affinitet rense PB2-merket vRNPs fra hver enkelt fraksjon og analysere deres protein og RNA komponenter ved hjelp av Western Blot og primer extension, henholdsvis. Nylig, benyttet vi denne metoden for å oppdage at vRNP eksport komplekser skjemaet under slutten poeng etter infeksjon på kromatin brøkdel ekstrahert med 500 mM NaCl (ch500) 3.

Protocol

En skjematisk flytskjema av protokollen er vist i fig. 1 og en tabell av reagenser er presentert nedenfor.

1. Infeksjon (16 - 24 t)

  1. Seed ut Jakten celler i 5 150 mm plast cellekultur retter i Dulbecco modifiserte Eagle medium (DMEM)-høy glukose medium, slik at de vil nå ca 80% confluency neste dag (ca 5 x 10 8 celler). Det er viktig at cellene ikke blir 100% confluency.
  2. På den neste dagen, fortynne Strep-tagget influensavirus lager i fosfat-bufret saltvann (PBS) som inneholder 0,3% bovint serum albumin (BSA) til et mangfold av infeksjon av tre.
  3. Fjern vekstmedium fra cellene, vask straks med PBS, og tilsett 10 ml PBS som inneholder viruset til cellene. Inkuber i 1 time ved romtemperatur.
  4. Erstatt infeksjon medium med DMEM-høy glukose, og fortsetter inkubering ved 37 ° C.
"> Lengden på inkubasjon avhenger fase av infeksjonen som skal studeres (se diskusjon).

2. Subcellulære Fraksjonering (3 t)

  1. Vask celler gang med kald PBS og deretter utsette celler i kaldt PBS med en gummiskraper og overføring til en 50 ml konisk rør.
  2. Pellet celler i en tabell-topp sentrifuger i 5 min ved 1000 rpm og deretter aspirer PBS.
  3. Resuspender cellepelleten i 10 ml kaldt sukrose buffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCl, 2 mM Mg Acetat (MgOAc), 3 mm CaCl 2, 340 mm sukrose, 1 mm ditiotreitol (DTT), 1% proteasehemmer mix) . Etter suspensjon, passere cellene gjennom en 200 mL pipette tips er festet til et 10 ml plast serum pipette for å forstyrre celle klumper.
  4. Inkuber 10 min på isen. Vend forsiktig jevne mellomrom for å resuspender celler.
  5. Legg Nonidet P-40 (NP-40) til en endelig konsentrasjon på 0,5% og virvle i høy hastighet for 15 sek. Umiddelbart sentrifuger for 10 minutter ved 3500 xg ved 4 ° C i en table-top centrifuge.
  6. Fjern supernatanten og oppbevares ved 4 ° C. Dette er cytoplasmatisk fraksjonen. Den pellet bør være mindre og hvitere enn den opprinnelige cellen pellet. Alle fraksjoner kan lagres i minst 4 timer ved 4 ° C.
  7. Vask pelleten i 5 ml kaldt sukrose buffer, re-sentrifuger som i trinn 2,5 og kast supernatanten.
  8. Resuspender pellet (som inneholder kjerner) i 1,5 ml kaldt nucleoplasmic utvinning buffer (50 mm HEPES pH 7,9, 150 mm KOAc, 1,5 mm 2 MgCl, 0,1% NP-40, 1 mm DTT, 1% proteasehemmer mix).
  9. Overføring til en kjølt, all-glass 4 ml Dounce homogenizer med en tettsittende stampe og homogenisere kjerner med 20 slag.
    Unngå skumdannelse under homogenisering. Motstanden bør øke etter ca 10 slag. Effektiv homogenisering kan bekreftes under et fase kontrast mikroskop.
  10. Overfør homogenisert atomkjerner til en 1,5 ml mikrosentrifuge rør og inkuber 20 min på en roterende hjul ved 4 °C.
  11. Sentrifuger ved 16 000 x g i en mikrosentrifuge ved 4 ° C i 10 min.
  12. Fjern supernatanten og oppbevares ved 4 ° C. Dette er nucleoplasmic fraksjonen.
  13. Resuspender pellet i 1,5 ml fordøyelsen buffer (50 mm HEPES pH 7,9, 10 mm NaCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mm DTT, 1% proteasehemmer mix, 100 U / ml Benzonase (for RNA-analyse, erstatning med 20 U / ml RNase -free DNase I)) forvarmet til 37 ° C, og inkuber 10 min ved 37 ° C.
  14. Legg 42 mL av 5 M NaCl (for endelig konsentrasjon på 150 mM NaCl) og inkuber 20 min ytterligere ved 4 ° C.
  15. Sentrifuger ved 16 000 x g i en mikrosentrifuge ved 4 ° C i 10 min.
  16. Fjern supernatanten og oppbevares ved 4 ° C. Dette er ch150 fraksjonen.
  17. Resuspender pellet i 1,5 ml kaldt høy-salt buffer (50 mM HEPES pH 7,9, 500 mm NaCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,1% NP-40, 1 mm DTT, 1% proteasehemmer mix) og inkuber 20 min på isen.
  18. Sentrifuger ved 16 000 x g </ Em> i en mikrosentrifuge ved 4 ° C i 10 min.
  19. Fjern supernatanten og oppbevares ved 4 ° C. Dette er ch500 fraksjonen.

3. Strep-tag Renselse (2 t)

  1. Legg 300 mL av 5 M NaCl til cytoplasmisk fraksjonen (for endelig konsentrasjon på 150 mm NaCl).
  2. Delmengde 100 mL av pakket Strep-Tactin Sepharose perler per fraksjon i en 15 ml konisk rør.
  3. Legg 10 volumer av Strep vaskebuffer (20 mm HEPES pH 7,9, 150 mM NaCl (500 mM NaCl for ch500 prøver), 1 mm EDTA) til perler, snu røret for å blande, og sentrifuger 5 min ved 1000 x g i en tabletop sentrifuger.
  4. Kast supernatanten, gjenta trinn 3,3 to ganger og deretter resuspender perlen pellet i en tilsvarende volum Strep vaskebuffer.
  5. Tilsett 200 mL av utvasket Strep-Tactin perle slurry til hver fraksjon (i 1,5 ml Mikrosentrifugerør for nuceloplasmic og ch150 og ch500 fraksjoner og en 15 ml konisk tube for cytoplasmisk fraksjon).
  6. Roterrør 1t ved 4 ° C på en roterende hjul.
  7. Sentrifugerør 1 min ved 1000 x g ved 4 ° C. Kast supernatanten.
  8. Tilsett 1 ml kald Strep vaskebuffer til hvert rør. Overfør perler fra 15 ml tube (cytoplasmatisk fraksjon) til 1,5 ml tube. Vask alle rør 1 min ved 4 ° C, sentrifugering etter som i trinn 3.7. Gjenta dette vasketrinn to ganger.
  9. Etter den siste vasketrinn, fjerne alle spor av vaskebuffer ved hjelp av en flat pipette tips. Tilsett 100 mL eluering buffer (Strep vaskebuffer inneholder 2,5 mm desthiobiotin) og forsiktig bland.
  10. Inkuber 15 min på isen. Bland forsiktig perler innimellom ved å trykke på bunnen av rørene.
  11. Sentrifugerør 1 min ved 1000 x g ved 4 ° C i mikrosentrifuge. Samle supernatanten som inneholder eluted Strep-kodede vRNPs.

4. Representative Resultater

Effektiviteten av fraksjonering er best bedømmes av Western blot analyse av de fraksjonert lysates hjelp antibodies spesifikke for subcellulære markører (Fig. 2). Spesielt bør vellykket subnuclear fraksjonering viser liten eller ingen cellulær RNA polymerase II (Pol II) i nucleoplasmic, eller løselige kjernefysisk brøkdel 4, og de ​​fleste bør trekkes ut med 150 mM NaCl 5. En degradering av Pol II er også reproduserbart observert i influensa virus-infiserte celler sammenlignet med friske celler, i samsvar med litteraturen 6.

Rensing av vRNPs er best bedømmes av sølv eller Coomassie farging, som vist for en cytoplasmisk eluatet i fig. 3. Vår erfaring er mest Strep-PB2 renset i som del av en fullt utformet vRNP, dvs. lite løselig polymerase fanget. Dette gjenspeiles i den høye NP: PA/PB1/PB2 ratio observert av sølv eller Coomassie farging. Et lavere ratio tyder buffer forurensning med RNases, som flere allestedsnærværende RNases (som RNase A) er kjent for å kløyve viral RNA på en slik måte at dissocispiste polymerase fra NP multimers 7. Interessant, behandling med Benzonase alene, mens tilstrekkelig til å fordøye viral RNA, synes å ha noen effekt på stochiometric prosenter av vRNP proteiner. Selv om vi ikke kan forklare dette fenomenet, observerte vi avbrudd av vRNPs etter fordøyelsen med andre RNases (data ikke vist), noe som tyder på at Benzonase kan forlate visse strukturelt viktige RNA regioner intakt. Etter rensing av vRNPs fra cytoplasma og nucleoplasm (utføres uten nuklease fordøyelse), kan 8 svake, men diskret band på høy molekylvekt bli observert av sølv flekker, som tilsvarer den anslåtte molekylmasser av de 8 influensa genom segmenter (se ref. 3 ).

De relative mengdene av vRNPs renset fra hver fraksjon på 9 timer etter infeksjon er vist i fig. 4. Fordelingen av vRNPs varierer i løpet av infeksjon, med sterkest akkumulering i ch150 fraksjonen på tidlige tidspunkter, ogøkt opphopning i nucleoplasm og cytoplasma ved slutten tidspunkter.

Figur 1
Figur 1. Flow diagram av subcellulære fraksjonering. Tilpasset fra ref. 3.

Figur 2
Figur 2. Western blot analyse av subcellulære fraksjoner fra influensavirus-infiserte celler. 10 9 Jakten celler ble infisert med influensavirus belastning WSN for ni timer før subcellulære fraksjonering. Like mengder total protein ble lagt i hvert kjørefelt og analysert ved hjelp av antistoffer som vises. RNA polymerase II (Pol II) ble oppdaget ved hjelp 8WG16 klone, som anerkjenner alle former for C-terminal domenet (hypophosphorylated bandet er mest fremtredende). Tilpasset fra ref. 3.

Figur 3
Figur 3.Silver flekk analyse av renset vRNPs. Jakten celler ble infisert med rWSN (som en negativ kontroll) eller rWSN-PB2-Strep for 9 timer, etterfulgt av Strep rensing fra cytoplasmic fraksjonen. Asterisk betegner band som ikke er synlige etter RNase fordøyelsen. Tilpasset fra ref. 3.

Figur 4
Figur 4. Silver flekk analyse av vRNPs renset fra ulike cellulære fraksjoner. 10 9 Jakten celler ble infisert med rWSN-PB2-Strep eller rWSN for 9 timer etterfulgt av subcellulære fraksjonering og Strep rensing. Like mengder eluatet fra hver fraksjon ble lastet inn. Tilpasset fra ref. 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mens mange studier har nylig identifisert enkelte proteiner eller mobilnett involvert i influensavirusinfeksjon 8, forblir den funksjonelle betydningen av de fleste av disse interaksjonene uklar. Gitt den absolutte avhengighet av kromatin-baserte funksjoner for influensavirus RNA syntese og komplekse biofysiske og biokjemiske natur kjernen 9, vil nye teknikker bli pålagt å belyse disse funksjonene. Den subnuclear fraksjonering vi presenterer her, kombinert med affinitet rensing av vRNPs, tillater karakterisering av viktige virale RNA fabrikker som tidligere var utilgjengelige.

Mange subcellulære fraksjonering protokoller, har tidligere blitt beskrevet i litteraturen. Vi observerte at de fleste av disse tradisjonelle metodene fører til for tidlig lekkasje av vRNPs fra kjernen, et fenomen også beskrevet for Pol II 10. Ved å bruke en kort inkubasjon av pre-svulmet celler med en lav concentration av en svak vaskemiddel, NP-40, skjedde effektiv plasmamembranen lysis uten betydelig kjernefysisk lekkasje. Interessant, utføre vår subcellulære fraksjonering bruker A549 og HEK293T celler heller enn Jakten celler førte til sterke kjernekraften lekkasje av vRNPs i begge cellelinjer. Senking av NP-40 konsentrasjonen til ca 0,2% redusert dette problemet, men på grunn av noen variasjon av disse cellelinjer, bør optimale forhold fastsettes empirisk. En annen mulig altermative er bruken av ikke-menneskelige, influensa virus-mottakelige cellelinjer som MDCK eller Vero celler.

Vår salt utvinning protokollen skiller seg fra tradisjonelle kromatin ekstraksjonsprosedyrene som ofte bruker lavere saltkonsentrasjoner og / eller høy EDTA konsentrasjoner. Vår protokoll skiller kromatin i to spesifikke fraksjoner, en Pol II-high/histone-low brøk og dens gjensidige. Imidlertid kan andre kromatin hentingsmetodene også være kompatibel med affinitet rensing av VRNPs. Siden de fleste kromatin ekstraksjonsprosedyrene har fokusert på DNA-protein interaksjoner i forhold til protein-protein interaksjoner, nye teknikker som kreves for å utvinne tett kromatin-bundet multi-protein komplekser 11.

Generelt bør lengden på infeksjon bestemmes empirisk grunn av variasjoner blant virusstammer og cellelinjer. Bruke rWSN-PB2-Strep tøyning ved en MOI på 3, har vi utført subcellulære fraksjonering på tidspunkter varierende fra 3 til 10 timer etter infeksjonen. Vår erfaring gir mindre enn tre timer av smitte for få renset vRNPs for nyttig Western blot analyse, mens infeksjon lenger enn 3 H resulterer i sterk cytopathic effekt og en påfølgende blanding av fraksjoner.

Muligheten til å isolere intakt, tett kromatin-bundet virale komplekser åpner opp flere muligheter. Mens vi utnyttet en rekombinant virus som uttrykker en streptokokk-merket PB2, kan andre affinitet tagger også brukes, samt Traditional immunoprecipitation målretting andre virale proteiner. Videre, mens vår analyse av vRNPs var begrenset til karakterisering av deres protein og RNA komponenter, kunne de rensede komplekser også brukes til å utføre funksjonell in vitro syntese analyser. Endelig kan separasjon av vRNPs i grove funksjonelle arter gjennom subnuclear fraksjonering også tillate nærmere studie av flere nylig beskrevet posttranslasjonelle modifikasjoner av virale proteiner som kreves for effektiv viral RNA syntese 12,13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke Nada Naffakh og Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) for rWSN-PB2-Strep virus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM-high glucose GIBCO, by Life Technologies 11965-092
BSA Sigma-Aldrich A9418
Protease inhibitor Mix G SERVA Electrophoresis 39101
Benzonase Nuclease Novagen, EMD Millipore 71206 25 U/μl
DNase I, RNase-free Thermo Fisher Scientific, Inc. EN0523 50 U/μl
Dounce homogenizer Wheaton 432-1271 Use type "B" pestle
Strep-Tactin Sepharose IBA GmbH 2-1201-025 50% suspension column format can also be used
Desthiobiotin IBA GmbH 2-1000-002

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II. J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).
  2. Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes. Virology. 332, 329 (2005).
  3. Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting. PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).
  4. Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure. Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).
  5. Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin. Genome Res. 19, 460 (2009).
  6. Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II. J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).
  7. Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins. J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).
  8. Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, Cellular networks involved in the influenza virus life cycle. Cell Host Microbe. 7, 427 (2010).
  9. Engelhardt, O. G., Fodor, E. Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection. Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).
  10. Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315. J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).
  11. Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research. Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).
  12. Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J. Virol. 85, 6618 (2011).
  13. Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication. EMBO J. 29, 3879 (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics