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의 배아와 성인 신경 줄기 세포의 확장 * These authors contributed equally

Neuroscience
 

Summary

체세포 줄기 세포의 확장을 제어하는​​ 것은 자신의 연구와 치료에 사용 hampering 결정하는 주요 요인입니다. 여기 시간적 마우스 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가하는 데 사용할 수있는 개발 및 성인기 동안 신경 줄기 세포 확장을 제어 할 수있는 시스템을 설명합니다.

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Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection. J. Vis. Exp. (68), e4093, doi:10.3791/4093 (2012).

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Abstract

체세포 줄기 세포는 성인 동안 배아 개발 및 조직 항상성 동안 조직 형성을위한 중요한 요소입니다 추가 줄기 세포 (확장) 또는 더 차별화 된 세포 유형 (차별화)을 생성하기 위해 나눌 수 있습니다. 현재 큰 노력이이 재생 의학 1,2에 대한 소설 전략을 개발하기위한 기본이라고 생각하기 때문에 차별화로 확장에서 체세포의 줄기 세포의 스위치를 제어 향해 투자하고 있습니다. 그러나, 체세포의 줄기 세포의 연구와 사용의 주요 과제는 자신의 확장을 제어하기가 매우 어렵 입증 된 것입니다.

여기 cdk4/cyclinD1 단지의 표현, G1 단계의 주요 조절기를 조작하여 마우스 배아 피질 또는 성인 해마의 신경 줄기 / 전구 세포의 컨트롤 (모두 NSC로 칭함) 확장 할 수있는 시스템을 설명 세포주기와 체세포 줄기 세포 비교의erentiation 3,4. 특히, 두 개의 다른 접근 방식은 cdk4/cyclinD1 단지는 생체에 NSC에 overexpressed하는에 의해 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법으로, 세포주기의 규제 당국의 overexpression은 마우스 telencephalon의 내강에 cdk4/cyclinD1 인코딩을 plasmids은의 episomal 표현을 트리거링, 따라서, 측 방향 피질의 NSC에게 제공하기 위해 자궁의 electroporation의 다음 주입함으로써 얻을 수 있습니다 transgenes 5-8. 두 번째 접근 방법으로, 매우 집중 HIV-파생 바이러스는 stereotaxically 9 감염된 세포의 게놈에있는 바이러스 구조의 통합 후 세포주기의 규제의 제정 표현을 트리거링, 따라서 성인 마우스 해마의 이가있는 이랑에 주입되어 있습니다. 그의 기본적인 원칙 이미 다른 비디오 프로토콜 10-14에서 설명 된 두 가지 방법은, 내가에 최적화 된), II를 조직의 손상을 줄일 수) 매우 구체적인 뇌 regio의 대상 폭 넓은 부분이NS, III)는 각 지역 내에서 조작 세포의 높은 숫자를 얻을, 그리고 IV)는 각 셀 내에서 transgenes 높은 표현 수준을 게재됩니다. 두 접근법을 사용하여 transgenes의 과도 overexpression 인해 Cre-표현 각각 NSC는 loxP 사이트으로 둘러싸인 cdk4/cyclinD1을 가진 바이러스에 감염 9,15의 세포 분열 또는 tamoxifen 관리에 electroporated plasmids 자연 희석하여 다른 방법으로 얻어진다 .

이 방법 심하게 및 조직 - 특히 마우스의 뇌에서 유전자의 표현을 조작 할 수있는 매우 강력한 플랫폼을 제공합니다. 특히, cdk4/cyclinD1 단지의 표현을 조작하여 우리의 시스템은 궁극적으로 포유류의 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가, 따라서, 시간적 NSC 확장의 관리 및 차별화에 대한 그들의 스위치를 할 수 있습니다. 우리 접근 방식은 기초 연구에 매우 중요하고 치료를 위해 체세포의 줄기 세포를 사용 할 수 있습니다포유류의 중추 신경계의 난에 대한 이해)을 제공하는 동시에이 체세포 줄기를 사용하여) 성인, III 동안) 개발, II 동안 더 나은인지 기능에 성인 neurogenesis의 역할, 그리고 아마도 IV)를 조직 항상성을 조직 형성에 셀 공헌을 막기 neurodegenerative 질병 모델 세포.

Protocol

예비 노트

수술은 동물 복지에 대한 지방 자치 단체의 승인에 따라 완벽하게 훈련 된 조사가 수행해야합니다. 모든주의 깊은 마취, 수술 후 진통제의 투여하고, 이상 10 분, 각막 탈수 실명을 방지하기 위해 눈 윤활제의 응용 프로그램을 지속 운영 등의 동물로 입은 고통과 스트레스를 최소화하기 위해 이동해야합니다. Anesthetized 마우스는 37 지속적으로 따뜻한 보관해야합니다 ° C 전체 복구 및 모든 수술 도구 및 솔루션을 살균해야합니다 때까지. 생물학적 후드의 사용이 엄격하게 필요하지 않습니다 만, 연산자는 실험실 코트, 마스크 및 장갑을 착용하여 작업 동안 동물을 감염 가능성을 최소화하기 위해 모든 합리적인 조치를 취합니다. 마찬가지로, 바이러스의 생성 및 사용에 관한 모든 단계가 승인해야하며 지방 자치 단체의 규정에 따라 S2 영역에서 수행해야합니다.마지막으로, 바이러스와 접촉되었습니다 수있는 모든 도구와 표면에 대한 철저한 정화가 승인 시설 소독 관행 (HIV에 대한 70% 장군님-OH 및 / 또는 autoclaving을 닦고 별)에 따라 수행해야합니다.

제 1 부 : 배아 NSC의 확장

1. 자궁의 electroporation에

  1. 복제 후 PCMS-EGFP (Clontech) 또는 pDSV - mRFPnls 벡터 16 transgenes (예 cdk4/cyclinD1)는 3-5 μg / μl의 농도로 멸균 PBS에 EndoFree 키트와 resuspend를 사용하여 plasmids를 정화. 곧 수술 전에 CA의 최종 비율 PBS에 0.​​05 % FastGreen와 plasmids를 섞는다. 4시 4분 1초하고 모든 침전물 제거 16,000 XG에서 2 분의 혼합물을 원심 분리기.
  2. 이전에 가져온 붕규산 유리 모세관에 DNA 혼합물을로드합니다. P-97 피펫 풀러를 사용하여 당기는 매개 변수는 다음과 같습니다 풀다운 : 200, 벨 : 140, 시간 : 140. 열이 램프 시험에 의해 주어진과 사양에 따라 달라집니다되어 있습니다모세 혈관의 ific 많이 사용된다. 자궁의 electroporation 플랫폼 (그림 1A)의 근처에 PicoPump의 노즐에 모세관을 장착하고, stereomicroscope 아래의 팁과 반곡 점에서 닉을 구부린다.
  3. 마른 유리 구슬 살균기의 모든 수술 도구를 소독하고 깊이 isoflurane vaporizer를 사용하여 회임의 날 12-15에서 임신 마우스를 마취. 37 ° C로 설정 난방 플랫폼에 위로 향한 위치에 동물을 놓고 코 콘을 통해 지속적인 isoflurane 관리 이하로 유지하십시오.
  4. 복부의 피부를 면도, 결국 70 %의 에탄올과 사이에 닦고, Betaisodona 여러 번으로 소독하고, 0.1 MG / 선제 진통제와 같은 kg 농도를에 피하 buprenorphine을 (PBS에 희석) 주입. 고급 가위를 사용하여 복막 캐비티에 액세스 할 수있는 기본 근육 벽의 후 2cm 길이 방향 피부의 절단 등을,합니다. 복막 캐비티 캘리포니아 조제. 이IUE 솔루션 (D-PBS는 펜 / 패 혈성 100 U / ML을 포함)의 ML 37에 prewarmed ° C와 난방 블록에 솔루션을 보관.
  5. uteri가 제거 될에서 균열 (fissure)를 포함하는 살균 drap와 마우스를 다룹니다. 텅스텐 견인기를 사용하여 절개를 철회, 자궁을 파악하고 인접 태아 사이의 포셉 (그림 1B, 왼쪽)와 함께 개최를 뽑아 마지막으로 무균 drap에 바칠 것이다. 전체 작업 기간 동안, 기관과 몸 캐비티에 보습 크림도 발라과 동물의 탈수를 방지하기 IUE 솔루션 자궁을 씻어.
  6. 조심스럽게 엄지와 검지 사이를 가지고있는 자궁을 처리하고 머리를 연산자에 대한 가시성과 지향 때까지 한 배아를 켜십시오. telencephalic 반구를 파악하고 dorso - 외 측면에서 중 하나를 삽입. 심실이 FastGreen (; 오른쪽 그림 1b)에 의해 설명 될 때까지 PicoPump의 풋 스위치를 사용하여 DNA 솔루션 1-2 μl를 놓습니다.
  7. (그림 1C)에서 음극에서 전극의 양극과 사각형 전기 필드를 생성 electroporator를 사용하여 각 펄스 사이 950 밀리 초 간격으로 50 밀리에 30 V의 6 펄스를 제공은 운영 풋 스위치를 통해. 이 출혈 손상 배아의 원인이 될 수 있습니다로 전극이 태반 가까이에 두지 마십시오.
  8. 모든 배아 주입하고 electroporated 때, 복강에 다시 자궁을 배치하고 모든 3-4mm를 suturing 봉합 문자열로 근육질의 벽을 닫습니다. 노트는 근육에 아늑한하지만 조직의 약간의 붓기를 허용하기에 너무 타이트 해 진해야합니다. 마지막으로, 금속 클립을 사용하여 놓인 피부를 닫습니다. Betaisodona로 피부를 소독, isoflurane 마스크에서 마우스를 제거하고 완전히 깨어 주택 케이지에 전송할 수 있습니다. 전위의 동작이 정상 때까지 마우스의 복구를 모니터링 할 수 있습니다.

2. 샘의 처리ple

  1. 하나 이상의 일 electroporation 후, 마우스를 희생 배아를 수집하고 올바르게 형광 stereomicroscope (그림 1D)를 사용하여 electroporated 사람들을 식별합니다. 얼음처럼 차가운 PBS에 머리를 해부하고, 4퍼센트 PFA (인산 완충 산도 7.4의 paraformaldehyde)에 밤을 해결할 수 있습니다. 결국, BrdU는 세포주기의 속도론 및 세포 증식 3 조사하기 위해 서로 다른 패러다임에 따라 희생하기 전에 관리 할 수 있습니다.
  2. 뇌 그런 다음 sectioning이며 대상 NSC과 자손에 기능 transgenes의 효과를 평가하기 위해 반경 방향 glia의 여러 마커, 기저 progenitors 뉴런 (Pax6, Nestin, Tbr2, Tbr1, Tuj1 등) immunostaining에 처리됩니다 공동 electroporated 리포터 유전자의 표현에 의해 식별.

그림 1
1 그림.자궁의 electroporation합니다. 자궁의 electroporation 플랫폼에서의 (A) 도식 표현입니다. (B) 수술 중에 임신 마우스 위치 (오른쪽)와 마우스 배아 (왼쪽)의 telencephalic 남반구에있는 DNA / FastGreen 혼합 (파란색)의 주입을 보여주는 그림. (C) 제도 분사의 사이트 (파란색)에 인접한 양극 (+)과 자궁 벽과 접촉 전극의 배치를 보여주고 있습니다. 화살표는 양극에 대한 DNA의 마이그레이션을 나타냅니다. 배아 일 13 살 GFP의 plasmids과 electroporation 후 마우스의 배아 24 시간의 (D) 사진. 점선은 telencephalic 반구를 demarcates. Calegari 외에서 수정되었습니다., 2004 년 17 제도.

2 부 : 성인 NSC의 확장

1. HIV-파생 된 바이러스 입자의 생산

  1. 1 일 : 판 5 × 10 10cm 6 293T 세포D-가상이 열 inactivated 태아 소 혈청의 10 % 펜 / 패 혈성 (문화 매체)의 100 U / ML을 포함하는 8 ML과 요리. 37에 하나의 바이러스 준비와 밤 문화 15 요리를 사용 ° C, 5 % CO 2.
  2. 일 2 : 모든 음식에 대해) 내가 인코딩을 3 plasmids 각각의 일반 D-가상 5 μg의 1 ML에 VSVG (기공을 갖는 구염 바이러스 유형 G) 봉투 단백질, II) 개그 / 폴을 (그룹 특정 항원 / 효소) 희석 , 그리고 III) polycistronic 이전 9 HIV 기반의 전송 벡터 (p6NST90)에 복제 기능 및 기자 transgenes (예 cdk4/cyclinD1/GFP)를 표현 구성합니다. D-가상은 실온에서 15-30 분에 대해 1 MG / ML 주식 솔루션 및 배양에 PBS에서 사전에 용해 된 polyethylenimine 45 μl를 포함하는 1 ML과이 솔루션을 섞는다. 한편에서는 세포에서 미디어를 제거하고 열 inactivated 태아 소 혈청의 15 % 및 100 U / 펜 / 패 혈성의 ML을 포함하는 신선한 D-가상의 요리에 4 ML를 추가합니다. 2 m을 추가transfection 혼합물과 문화 하룻밤의 리터.
  3. 3 일 : 500 MM 120 μl transgenes의 표현을 향상시킬 수 있도록 음식에 따라 오세영 - 부티르산을 추가, 문화 매체의 5 ML로 transfection 매체를 대체하는 후 6-8 시간에 부드럽게와 문화를 섞는다.
  4. 4 일 : supernatants을 (ca. 70 ML 총)를 수집, 2 polyallomer의 원심 분리기 튜브 (35 X 89mm)에 0.22 μm 필터 및 전송을 통해 전달합니다. 4에 90 분에 110,000 XG의 Ultracentrifuge ° C 스윙 로터를 사용합니다. 표면에 뜨는 폐기하십시오, 각 튜브에 PBS 6 ML을 추가하고 1 시간에 얼음을 품다. 펠렛을 Resuspend 한 polyallomer의 원심 분리기 튜브 (14 X 95mm)에 전송할 수 있습니다. 4에 90 분에 110,000 XG의 Ultracentrifuge ° C 스윙 로터를 사용합니다. 표면에 뜨는 폐기하십시오, PBS의 50 μl의 펠렛을 resuspend, -80에서 5 μl aliquots 및 매장을 ° C. 바이러스 titer는 10 8 -10 9 CFU / ML의 범위에있을 것입니다. (참고 : 바이러스가 온도와 스토리지, 아보에 매우 민감한이드 재 냉동은 운송 중에 드라이 아이스를 유지하고 사용하기 전에 빨리 해동.)

2. Stereotaxic 주입

  1. isoflurane과 6~10주 오래된 마우스를 마취하고 적절하게 머리를 해결하기 위해 귀 바, 입맛 지원을 사용하여 stereotaxic 프레임 (그림 2A)에 발생하기 쉬운 위치에 동물을 배치합니다. 동물은 37 ° C에서 지속적인 isoflurane 관리 아래 설정 가열 패드에 따뜻한 보관됩니다.
  2. 피하 선제 진통제와 같은 buprenorphine 작업 솔루션 100 μl를 삽입, 마우스의 머리에 피부의 스트라이프를 면도 등 1.4에 설명 desinfect. 메스를 사용 CA를합니다. 시상 봉합의 수준에서 두개골을 노출 머리 피부에 1.5 cm 긴 세로 절개. 피부를 철회하고 부드럽게 멸균면 새싹과 뼈 표면을 청소하십시오.
  3. 파라핀 오일과 모세관 유리 (1.2의 사양) 하프 작성하여 삽입 주입기 펌프에 장착두 번째 링 (그림 2B)까지 모세관. 모세관의 끝은 bregma, 시상 및 측면 봉합 (그림 2C) (stereomicroscope의 도움으로 결정 예정) 사이의 연결 지점에 위치 할 때까지 x, y 및 z 축에있는 모세관 홀더를 이동하고, 재 세트 X, Y 및 Z 값 0.
  4. 앞 - 뒤 축 (Y)에 ± 만나는-측면 축에 1.6 mm (X)와 -1.9 mm로 모세관를 이동하고 수술 마커 펜을 사용하여 뼈를 표시합니다. CA의 구멍을 확인합니다. 뇌를 손상하지주의를 지불 전기 맹연습을하는 것을 사용하여 두개골에 0.5 mm 지름.
  5. 귀 바에 위치 parafilm의 한 부분에 바이러스 정지 5 μl 소적 (1 나누어지는)을 넣고 비말에있는 모세관의 끝을 immerge. CA를 빨아 줘. nanoliter 주입기를 사용하여 바이러스 정지 3.5 μl 55 NL / 초에 설정합니다. 물방울이 증발하므로 빠르게이 단계를 실행합니다.
  6. 사이트 O에 모세관 이동F 주입과 끝이 pial 표면을 감동까지 내려 이동합니다. 0으로 dorso - 복부 축 값 (Z)를 재설정합니다. 이 시점에서 -1.9 mm의 모세관과 조직을 침투와 4 NL / 초의 속도로 바이러스 정지의 1.5 μl를 놓습니다. 바이러스 정지 트로프 모세관 트랙의 역류를 최소화 한 후 모세관를 철회 할 2~3분 기다립니다. 두 번째 주입은 controlateral 남반구에서 수행 할 수 있습니다.
  7. , 피부를 봉합 소독하고, 자궁 electroporation (1.8)에서 이전에 설명 된대로 동물이 마취에서 회복 할 수 있습니다.

그림 2
그림 2. Stereotaxic 바이러스 주사. stereotaxic 분사 (A)와 CA의 삽입을 보여주는 분해 모세관 홀더을 수행하기 위해 필요한 구성 요소 (A와 B) 도식 표현두 번째 링 (B)까지 pillary. (C) 피부에 귀 바, 입맛 지원에 의해 고정 마우스 머리 사진이 두개골을 (왼쪽) 노출 컷. 점선 상자의 배율은 (오른쪽) 측면과 시상 봉합, bregma 및 주입 (원)의 사이트를 보여줍니다.

3. 샘플의 처리

  1. 1 대 - 3 주 후 감염, CA와 마우스를 perfuse. 4퍼센트 PFA의 100 ML은 뇌를 해부하고 4퍼센트 PFA의가 하루 아침에 게시 - 수정합니다. 결국, BrdU 및 / 또는 tamoxifen는 각각 9, 세포주기의 속도론을 조사하고 loxP 사이트에서 옆에있는 바이러스 transgenes의 표현을 중지 다른 패러다임에 따라 희생하기 전에 관리 할 수 있습니다.
  2. 뇌 그런 다음 줄기와 progenitors 세포 뉴런 (예 : Sox2, GFAP, Nestin, Tbr2, doublecortin 등)의 여러 마커를 사용하여 immunostaining을 위해 처리 할 수 있습니다.

Representative Results

  1. 전반적으로, 자궁의 electroporation에 측면 피질 (그림 3A)의 폭 넓은 영역에서 리포터 유전자의 강력한 표현을 표시 electroporated 배아의 60~80%를 얻을. 형광 단백질은 쉽게 하나 이상의 주 동안 지속 신호 수술 후 가능한 한 빨리 3~6시간으로 전체 마운트 배아에서 발견 할 수 있습니다. 대상 영역에서 세포의 30-50 % 정도는 일반적으로 세포의 비율 보통 90% 위에서는 두 (또는 이상) 공동 electroporated transgenes (그림 3B, 왼쪽) 6,8를 공동 표현으로 transgene (들)을 표현 15. apoptosis (ca. 2.0-2.5 %)의 최소 레벨이 electroporation에서 약 2 시간 후 관찰 할 수 있지만,이 값은 약 6 시간 후 생리 레벨 (ca. 0.5-1.0 %) (FC, 게시되지 않은 데이터)으로 돌아갑니다. 수술로 인해 죽어 배아 나 임신 쥐의 비율 (<5 %) 일반적으로 무시할 수 있습니다. 이러한 상황에서 cd​​k4/cyclinD1과 공동 electroporation 4 다음개발 8 시간 30 %로 신경 전구의 확장 (오른쪽 그림 3B, 그리고 C) 15 증가 트리거합니다.

그림 3
그림 3. cdk4/cyclinD1 overexpression에 의해 신경 progenitors의 확장. 24시간 배아 일 13 살 GFP 및 RFP plasmids과 electroporation 후 마우스 배아의 측면 피질을 통해 섹션의 (A) 형광 그림. (B) 기초 전구 마커 Tbr2에 대한 cdk4/GFP 및 cyclinD1/RFP plasmids과 immunolabeling과 공동 electroporation 후 48 시간으로 형광등 사진. DAPI counterstainig (왼쪽)와 Tbr2과 형광 기자 (오른쪽) 표시됩니다. 와 subventricular 영역의 경계 (SVZ, 노란색 점선) 선은 심실 영역의 꼭대기 표면 (흰색 라인 VZ)을 나타냅니다. 증가 생을 확인합니다증가 생성 및 cdk4/cyclinD1의 overexpression 후 기저 progenitors의 확장으로 인해 피질의 electroporated 부분 (흰색 화살촉)에 SVZ의 ckness. P <0.05; N = 3 (C) 효과의 정량화는 B. 바 = SD에 표시. C에서 막대 그래프는 랭 외., 2009 15에서 가져옵니다.

  1. 후 바이러스 stereotaxic 사출, CA. 운영 마우스의 80 %는 전체 이가있는 이랑을 통해 transgenes의 강력한 표현을 표시합니다. GFP의 제정 표현은 쉽게 수술 후 가능한 한 빨리 사일 등 40 μm 섹션에서 발견 할 수 있습니다. 이가있는 이랑의 뱃 부리 장식이있는 - 투 - 꼬리 축을 따라 셀 10-30 %는 (CA 총. 10,000-30,000 세포에 해당) 일반적으로 transgene (들) (그림 4A) 9을 표현. 때문에 수술에 죽어 마우스의 비율 (<5 %) 무시할 수 있습니다. 이러한 조건에서 cd​​k4/cyclinD1의 세 가지 주 overexpression은 끝으로 NSC 증가 트리거 두-폴드 (그림 4B) 9 70 % (그림 4C)에 의해 neurogenesis 감소하는 반면.

그림 4
4 그림. 바이러스 감염의 효과. 해마의 뱃 부리 장식이있는 - 투 - 꼬리 축을 따라 40 μm 두께의 시리얼 코로나 섹션 (1마다 6 수집)에서 찍은 7 형광 사진의 (A) 3D 재건. GFP + 감염된 세포 (녹색)과 이가있는 이랑의 DAPI 핵 염색 (파란색)이 (위) 표시됩니다. A (중간)와 (, 앨런 뇌 아틀라스에서 수정 녹색 pseudocolor으로 강조 해마와 대뇌 반구 전체의 3D 표현 (하단)에 나타난에 해당하는 코로나 섹션의 시야 사진 www.brain-map.org ) . 흰색 화살표는 분사의 사이트를 가리 킵니다. 측면 (L), 뱃 부리 장식이있는 (R), 그리고 가졌염 (D) 축 (X, Y 및 Z 좌표 stereotaxic) (오른쪽) 표시됩니다. nestin + NSC (B)와 DCX + GFP의 인구 내에서 신생아 뉴런 (C) + 삼주 stereotaxic GFP (흰색) 또는 cdk4/cyclinD1/GFP의 주입 (검은 색) 바이러스에 감염된 후 세포의 (B와 C) 비율. 바 = SD, P <0.005, N = 3. B와 C에서 그래프 Artegiani 외., 2011에서 발췌.

Discussion

자궁의 electroporation에 대한 중요한 단계는 전기 분야의 배달시의 방향 마이그레이션 충전에 따라 달라집니다 이후 DNA의 품질과 순도입니다. 같은 endotoxins 같은 추가 요금이 부과 분자의 제거를 포함하지 않는 DNA 정화를위한 프로토콜이 좋지 배달로 이어지는 자연의 DNA 부정적인 요금의 마스킹 될 수 있습니다. 분명 가장 가까운 가능한 타겟이 될 수있는 영역에 전극과 자궁 벽을 터치하면 electroporation 효율을 향상시킬 수 있습니다. 또 다른 중요한이 최적의 전기 분야의 전송 기본이기 때문에 사용되는 전극의 품질입니다. 눈 및 / 또는 등등 혈청의 흔적, 지질, 등 유기 잔류 물에 의해도 보이지 않는 미세 흠집이 불가피하게 자신의 속성을 잃지 전극에 이르는 시간이 지남에 축적됩니다. 옛 및 / 또는 더러운 electropes는 electroporation 효율에 갑자기 드롭의 가장 큰 원인이며, 따라서, R이어야합니다가능한 한 빨리이가 발견되기 때문에 eplaced. 비교적 간단하지만, 자궁의 electroporation에 일반적으로 만족하고 재현 결과를 달성하기 위해 훈련의 몇 주이 필요합니다. 가 개발 배아의 기관 및 조직에, 사실상, 적용 할 수 있기 때문에이 기술은 매우 다양한입니다. 물론, 이러한 뇌 등의 캐비티를 포함한 기관은 대상과 DNA의 비교적 큰 볼륨을 주입의 용이성으로 인해 transfected 세포의 높은 비율을 할 수 있도록 특히 용이합니다.

stereotaxic 바이러스 주사를 설정에서 발생하는 일반적인 문제는 몇 감염된 세포 및 /하거나 원하지 않는 영역을 타겟팅하는 것입니다. 첫 번째 문제는 주로 낮은 titer 바이러스의 주입과 상관 있습니다. 문화의 통로 낮은 번호를 가진 293T 세포가 빠르게 성장하고 높은 바이러스 titers로 연결됩니다. CA보다 오래된 세포를 사용합니다. 20 구절을 권장 미만 80 % 효율 transfection의 의미없는 것은 좋은을 보장하지 않습니다바이러스 생산. 바이러스 펠렛의 Resuspension도 중요합니다, 바이러스 정지는 모세가 피해야 할 필요가 윗니와 아랫니가 맞 물리다 수 동질 및 바이러스 clumps를 표시 할 수 있습니다. 바이러스는 온도 드랍스 및 장기 저장에 매우 민감합니다. 이 이유로, aliquots이 영구적으로 -80 ° C에서 저장하고 refrozen 할 수 없습니다 필요합니다. 심지어 이런 상황에서, 감염의 감소는 스토리지의 6-12 개월 후에 관찰 할 수있다. 학습 단계에서, 우리는 각각의 바이러스 준비 바이러스 titer를 테스트하고 장기 보관 한 후 다시 수행하는 것이 좋습니다. 뇌의 원치 않는 영역에 감염된 세포의 존재는 연습이 필요합니다 stereotaxic 프레임에 마우스 머리 차선 위치에 따라 달라집니다 수 있습니다. 또한, 그렇지 않으면이 부정확 주입의 결과로, pial 표면에 정확하게 공을 재설정 할 수 없습니다 때문에 두개골에 구멍을 여는 동안 뇌의 표면을 손상하지 중요합니다. 좌표우리가이 프로토콜에서 제공하는 C57/BL6 6-10주 옛 여자라고합니다 그리고 서로 다른 변형 / 연령 / 성별을 위해 최적화하는 것이 좋습니다. 이 기술의 취득은 바이러스를 준비하고 샘플을 분석하는 데 필요한 단계 이상으로 인해 자궁의 electroporation보다 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다. 우리는 강력하게 마우스 수술과 stereotaxic 분사가 안정적이고 재현 될 한 후 바이러스 만 사용하는 것이 좋습니다. 이를 달성하기위한 첫 번째 단계는 euthanized 마우스에서 해당 Hoechst 33342와 같은 세포 permeant DNA의 염료를, 삽입 즉시 뇌를 분석하는 것입니다.

자궁의 electroporation 및 stereotaxic 바이러스 주사를 개의 강력한 심하게으로 시스템과 조직 - 특히 포유류의 개발 및 성인기 동안 CNS 내에서 유전자 발현을 조작입니다. 세포 만 subpopulation을 타겟팅의 제한에도 불구하고, 이러한 시스템은 전례없는 속도를 제공하고 더 많은 기존의 방법에 비해 쉽게, 전유전자 변형 마우스의 N 특히 힘든 시간이 소요 세대. 그러나,이 유사성에도 불구하고, 몇 가지 차이가​​ 가치가 멘션있는 두 가지 기술 사이에 존재합니다. 이러한 DNA가 주입되어 심실을 delimiting 유일한 세포이기 때문에 첫째, 자궁의 electroporation에, 다른 세포 유형의 타겟팅과 관련하여 초기에 적절한 줄기 세포 (또한 반경 방향 glial 세포라고도 함)의 transfection로 연결됩니다. 세포 분열의 결과로, plasmids은 이후의 전구 및 / 또는 시간의 함수로 피질에 걸쳐 transfected 세포의 재배포에 이르는 neuronal 딸 세포를 타겟으로, 어머니의 줄기 세포에서 상속됩니다. 대조적으로, 성인 뇌의 HIV의 lentiviruses의 사용은 줄기 세포, progenitors, 뉴런뿐만 아니라 성숙 glial 세포를 포함한 모든 세포 타입의 동시 감염 발생합니다. 참고 더 일반적으로 사용되는 레트로 바이러스가 잠복 반대로 HIV의 lentiviruses를 사용에 관한 사실입니다그 lentiviral 통합 따라서 성인, 동작 줄기 세포의도 타겟 수 있도록 독립적으로 세포의 mitotic 상태에서 발생합니다.

둘째, electroporation 및 바이러스 감염 사이의 또 다른 중요한 차이점은 후자에 의해 달성 감염된 세포의 게놈에있는 DNA의 돌이킬 수없는 통합에 반대하는 등의 일시적인, episomal 표현이 전에 의해 달성되는 것입니다. 연속 셀 부문, electroporated plasmids의 희석하고, 이소성 cyclinD1 단백질의 저하의 결과로, 각 세포주기에 있었 것입니다. 이 효과는 몇 개월 (게시되지 않은 결과) 지속하기 위해 발견 된 성인 뇌에있는 동안 따라서, 태아의 개발 기간 동안 NSC의 확장은 지난 약 이일 15에 게재되었습니다.

전) cdk4/cyclinD1 개발 중) 최선을 다하고 신경 progenitors을 더 G1 및 II와 세포에 강력한 영향을 이후 셋째, 더 이상 세포주기를반대 성인 중에 마찬가지 동안 줄기 세포보다 두 조작은 성인 동안 개발과 줄기 세포 중 신경 progenitors의 확장을 주로 실행하는 발견되었습니다. 각각의 경우에 뉴런의 증가는 두 가지 방법에 의해 달성되었습니다.

넷째, 바이러스 주입은 쉽게 간단하게 stereotaxic 좌표를 변경하여 성인 뇌의 여러 지역에서 안정적으로 reproducibly, 수행 할 수 있습니다. 반면에, 자궁의 electroporation에 의한 이러한 뇌 줄기, hippocampal 형성, 또는 척추 등 중추 신경계의 특정 지역의 정확한 타겟팅 reproducibly 달성하기 힘들 것입니다. stereotaxic 분사가 어떤 시대의 쥐를 수행 할 수 있으며 또한, 자궁의 electroporation에 최적의 성능을 E16에 E11에 대한에서 제한되어 있습니다. 이전 E11에 대한 단계는 초음파 후방 산란 현미경 18,19의 사용 또는 전체 배아 컬트 중 하나를 요구우레 시스템 17,20.

자신의 연구와 조작이 소설 셀 기반의 재생 치료의 개발에 대한 기본적인 것으로 생각되기 때문에, 최근 체세포 줄기 세포의 기본 세포 생물학의 증가 관심이 추진되었습니다. cdk4/cyclinD1의 overexpression에 대한 특히, 우리의 프로토콜은 transitorily 성인 뇌에서 생성 된 뉴런의 수를 증가시키기 위해 생체 내 NSC의 확장 (그림 3B와 C와 4B와 C)을 높일 수있는 방법을 제공합니다. 우리는이 조작이 더 뇌 개발, 진화와 항상성뿐만 아니라인지 기능이나 신경 변성이나 부상에서 회복에 대한 그들의 공헌에 NSC의 역할을 이해하기 위해 다양한 상황의 숫자에 중요 할 수 있다고 생각합니다.

Disclosures

BA와 FC는 cdk4/cyclinD1 바이러스 (EP 10160288.6)에 의해 성인 체세포의 줄기 세포의 조건부 확장을 설명하는 특허 신청서를 제출했습니다.

Acknowledgments

이 작품은 재생 요법, TU 드레스덴 (Dresden)의 의료 학부 및 DFG 공동 연구 센터 SFB655 (하위 프로젝트 A20)를위한 센터에 의해 지원되었다. BA는 셋방-BB 프로그램, 드레스덴 (Dresden)의 화목에 의해 지원되었다. 우리는 Drs 감사드립니다. Noriko 스미, 타다 노무라, 디터 Chichung의 거짓말, 그리고 자궁의 electroporation 및 stereotaxic 바이러스 주입에의 설정까지 동안 귀중한 조언 라비 Jagasia.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Endofree maxi plasmid kit Qiagen 12362
FastGreen Sigma F7258
P-97 Flaming/Brown pipette puller Sutter Instruments
Borosilicate capillaries with filament Sutter Instruments BF120-69-10
Table top laboratory animal anesthesia system VetEquip 901806
Isofluran Baxter HDG9623
Germinator 500 glass bead sterilizer SouthPointe Surgical GRM5-1460
Iris forceps WPI 15917
Betaisodona solution Mundipharma 1931491
Pico Pump WPI PV820
ECM 830 square wave electroporator Harvard Apparatus 450052
Round tweezer electrodes NEPAGENE CUY650P1
Suture material Ethicon V493H
Reflex clip applier for wound closure WPI 500345
Temgesic injection solution Essex Pharma AG
DMEM w/Glutamax-I Invitrogen 31966021
Fetal Bovin Serum Invitrogen 1027016
Penicillin/Streptomicin Gibco 15140
Tissue culture dish Falcon 353003
Polyethylenimine 250 ml Sigma-Aldrich 40872-7
n-Butyric acid, sodium salt Sigma B 5887
Tube, thinwall, polyallomer Beckman 326823 / 331374
Model 900 small animal stereotaxic instrument Kopf Instruments
OPMI pico microscope Zeiss
SYS-Micro4 controller and Nanoliter2000 injector WPI B203MC4
Glass replacement 3.5 nanoliter WPI 4878
SR drill general application Foredam K2272
Antibody Supplier Catalog # Dilution
Doublecortin Santacruz SC8066 1:100
GFAP Chemicon MAB3404 1:500
Nestin BD Biosciences 556309 1:1000
S100β Abcam Ab868 1:1000
Sox2 Millipore AB-5603 1:500
Tbr2 Abcam Ab23345 1:400
Table of antibodies

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References

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