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May 06, 2020
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이 프로토콜은 우리가 개발 중인 신피질의 확장 및 접이식을 연구할 수 있는 중요한 동물 모형에 있는 생체내 유전 조작을 능력을 발휘할 수 있게 합니다. 이 방법의 주요 장점은 뇌 발달을위한 핵심 세포 유형인 신경 줄기 세포를 대상으로 높은 공간 및 현세적 특이성을 사용하는 것입니다. 절차를 시작하기 전에, 마이크로 파이펫 풀러에 유리 모세 혈관을 당기고 모세관팁의 직경을 조정하기 위해 모세관의 탈부분을 잘라 집게를 사용합니다.
배아 당일 33일에는 PBS에서 DNA의 적절한 농도를 추가하여 부드러운 혼합으로 0.1%의 패스트 그린을 보충하고, 3시간 금식, 마취, 임신한 여성 페렛을 열패드가 있는 수술 대에 놓습니다. 관동맥 피부를 만지고 두 번째와 세 번째 또는 세 번째 및 네 번째 발가락 사이의 피부를 꼬집어 두 뒷사지의 적절한 수준의 침전을 확인하십시오. 이소플루란은 메스꺼움과 현기증을 포함한 부작용을 일으킬 수 있습니다.
액체 형태로 이소플루란을 취급할 때는 보호 장비를 사용하십시오. 수술 중에 적절한 캐니스터를 사용하여 가스를 포획하십시오. 진통제, 항생제 및 포도당으로 동물을 피하시키고 동물의 눈에 연고를 놓습니다.
클리퍼를 사용하여 복부를 면도하고 노출 된 피부를 물, 비누 및 요오드 용액으로 청소하십시오. 그런 다음 거즈 면봉으로 피부를 건조시키고 알코올과 요오드 스크럽으로 소독하십시오. 자궁 전기포이션의 경우, 동물 위에 멸균 드레이프를 놓고 메스를 사용하여 리나 알바에서 약 5센티미터의 피부 절개를 합니다.
가위를 사용하여 근육 층을 잘라 절개 부위 주위에 거즈 면봉을 놓습니다. 거즈를 PBS로 적시고 자궁을 면봉에 놓습니다. 긴 팁이 있는 파이펫을 사용하여, 주입될 태아 당 DNA 용액 5 마이크로리터를 가진 당겨진 유리 모세혈관 중 하나를 적재한다.
로드된 모세관을 홀더에 부착하고 홀더의 다른 면을 튜브와 마우스피스에 연결합니다. 첫 번째 배아의 머리를 찾아 머리 옆에 광섬유 광원을 놓습니다. 안료 홍채를 기준점으로 사용하여, 유리 모세관의 끝으로 피부, 두개골 및 뇌 조직을 관통하고 구강 파이프팅을 사용하여 주사 용액의 3-5 마이크로리터를 대뇌 반구 중 하나의 심실로 전달합니다.
주입된 용액에는 0.1%의 빠른 녹색이 포함되어 있기 때문에 성공적인 주사로 인해 주입된 심실의 짙은 녹색 얼룩이 발생하여 이제 신장 모양구조로 볼 수 있습니다. 주사 후, 주사 부위 아래에 표적화될 영역 위에 양성 극을 가진 배아의 머리 위에 자궁위에 트위저 전극을 놓는다. 전극의 펄스 길이를 50밀리초로 설정하고, 펄스 전압을 100볼트로, 펄스 간격을 1초로, 펄스 수를 5초로 설정합니다.
모든 매개 변수가 설정되면 Pulse를 누르고 따뜻한 PBS 를 전자화 배아에 여러 방울 빠르게 떨어 뜨립니다. 모든 배아가 전소되면 자궁을 복막 구멍으로 돌려보내 4-0 봉합사를 사용하여 복막으로 근육 층을 닫습니다. 비슷한 방식으로 피부를 닫고 알루미늄 스프레이로 상처를 덮습니다.
그런 다음 동물을 열원으로 케이지로 돌려보내고 완전한 재수질까지 모니터링합니다. 배아 일 37에서 전기 화 후 4 일, 표적 된 세포와 그들의 자손의 대부분은 여전히 발아 영역에 있으며 세포는 피질 플레이트 내에서 더 유저로 더 관찰되지 않습니다. 전구 체형은 PCNA와 같은 사이클링 세포의 마커에 대한 면역 불면에 의해 검사될 수 있지만, 미토시스를 겪고 있는 전조의 하위 집합은 인-히스톤 3와 같은 마커에 의해 표시될 수 있다.
산후 날 0에서, 전기 기화 후 8 일, 표적 세포의 자손은 모든 조직학적 층으로 확산. 전사 인자 마커의 조합을 사용하여, 다른 기저 전구 체 집단이 드러날 수 있다. 예를 들어, Sox2는 기저 방사형 신경교를 포함하는 증식 선조 세포의 마커입니다.
그리고 T 박스 뇌 단백질 2 신경 질 기저 선조의 마커, 주로 중간 선조. 산후 날(16)에 의해, 표적 세포의 대다수는 세포와 glia로 분할하고 분화하는 것을 중단하고, 페렛 산후 날 16 의 특징적인 접이식 패턴을 전시하는 신피질. 페렛 배아의 자궁 전기화는 유전자의 기능을 연구하는 매우 강력한 방법입니다.
그것은 우리가 인간 특정 유전자를 포함하여 진화에 있는 신피질의 확장에 연루된 유전자를 공부하는 것을 허용했습니다. 그리고 이 강력한 방법을 사용하여, 우리는 실제로 인간 신피질의 진화확장이 어떻게 작동했는지에 대한 주요 특징을 알아낼 수 있었습니다.
Summary
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여기에 제시된 자궁 전기화에서 사용하는 배아 페렛 뇌에서 유전자 조작을 수행하는 프로토콜이 있다. 이 방법은 생체 내의 신피질에서 신경 전구 세포를 표적으로 하는 것을 허용합니다.
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Kalebic, N., Langen, B., Helppi, J., Kawasaki, H., Huttner, W. B. In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (159), e61171, doi:10.3791/61171 (2020).
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