पैथोजन vacuoles की शुद्धि से

Immunology and Infection

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Summary

इस लेख अलगाव और अक्षुण्ण की शुद्धि के लिए एक विधि का वर्णन

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Hoffmann, C., Finsel, I., Hilbi, H. Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes. J. Vis. Exp. (64), e4118, doi:10.3791/4118 (2012).

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Abstract

Protocol

1. LCV अलगाव के लिए तैयारी

  1. लीजोनेला pneumophila 5 / LCV अलगाव से पहले μg एमएल chloramphenicol (कैम) के चार दिन के साथ ग्लिसरॉल स्टॉक से 13,14 DsRed एक्सप्रेस CYE अगर प्लेट उत्पादन पर बाहर लकीर. 37 में बैक्टीरिया सेते हैं डिग्री सेल्सियस
  2. बीज बाहर 1 एक्स 10 7 डी. GFP-calnexin का या 75 सेमी 2 टिशू कल्चर के में RAW264.7 murine मैक्रोफेज उत्पादन discoideum एक दिन पूर्व संक्रमण बोतल. 20 μg / एमएल G418 के लिए डी के साथ 10 मिलीलीटर HL5 मध्यम का प्रयोग करें और 23 डिग्री सेल्सियस पर discoideum amoebae सेते हैं लिए RAW264.7 मेक्रोफेज 10 मिलीलीटर RPMI है 1640 10% (निष्क्रिय गर्मी) है FCS और 1% glutamine के साथ पूरक माध्यम का उपयोग करें, और 37 में कोशिकाओं को विकसित डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. संक्रमण और नमूना प्रति तीन कम से कम 75 सेमी 2 बोतल (कम से कम 6 x 10 7 कोशिकाओं) का प्रयोग करें.
  3. एल के साथ एक रात संस्कृति टीका लगाना CYE थाली से pneumophila. 3 ऐ मध्यम एमएल के साथ एक 15 एमएल टेस्ट ट्यूब ले लोऔर 5 μg / एमएल कैम. एक जीवाणु निलंबन के लिए 0.1 के एक आयुध डिपो 600nm उपज के 100 μl साथ टीका लगाना. 37 ° C पर 21-22 घंटे के लिए एक उपरि रोटेशन पहिया पर रातोंरात संस्कृति सेते हैं.

2. LCV अलगाव

  1. डी. के माध्यम बदलें discoideum कोशिकाओं को दूर करने के लिए एंटीबायोटिक है, जो निम्न संक्रमण के साथ हस्तक्षेप करेगा.
  2. रातोंरात संस्कृति के आयुध डिपो उपाय. बैक्टीरिया 3 ≥ के एक आयुध डिपो 600nm, जो 2 x 9 10 बैक्टीरिया / एमएल से मेल खाती है पर अपने चरम संक्रामकता तक पहुँच जाना चाहिए.
  3. एल के लगभग 500 μl जोड़कर कोशिकाओं को संक्रमित pneumophila 10 मिलीलीटर HL5 (डी. discoideum) मध्यम या 10 मिलीलीटर 1640 RPMI (मेक्रोफेज) में बढ़ कोशिकाओं को रातोंरात संस्कृति. इस संक्रमण के एक 50 की (MOI), बहुलता से मेल खाती है. बाद में, संक्रमण बैक्टीरिया की centrifugation द्वारा कोशिकाओं पर 500 × छ पर 10 मिनट के लिए सिंक्रनाइज़ है. Centrifugation पीछा किया हैडी. के एक ऊष्मायन द्वारा 25 डिग्री सेल्सियस और क्रमशः डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2, 37 में RAW264.7 मैक्रोफेज पर discoideum कोशिकाओं. 1 घंटे का समय संक्रमण centrifugation कदम भी शामिल है.
  4. संक्रमण के बाद मध्यम हटाने और कोशिकाओं को एक बार धोने से कोशिकी बैक्टीरिया को दूर करने के लिए. डी. के लिए बहुत ठंडा SorC बफर का प्रयोग करें discoideum और बहुत ठंडा पीबीएस RAW264.7 मैक्रोफेज के लिए. प्रत्येक फ्लास्क 3 एमएल एच एस बफर, protease inhibitors (Roche) के साथ पूरक जोड़ें और एक सेल खुरचनी का उपयोग कर से कोशिकाओं को इकट्ठा. एक 15 एमएल टेस्ट ट्यूब में इसी नमूने पूल.
  5. नमूना उपयोग एमएल 3 प्लास्टिक Luer ताला सीरिंज और स्टेनलेस स्टील की गेंद homogenizer के homogenization के लिए. सुनिश्चित करें कि आप बर्फ पर काम करते हैं. शुरू करने से पहले, आसुत जल के साथ गेंद homogenizer धोने, किसी भी डिटर्जेंट संक्रमण से बचने और यह बर्फ ठंड एच एस हवाई बुलबुले से छुटकारा पाने के बफर के साथ भरा. 8 माइक्रोन निकासी गेंद का प्रयोग करें.
  6. सिरिंज und के में पहले 3 एमएल भरें वें पर माउंटई homogenizer. नमूना आगे और पीछे homogenizer के माध्यम से नौ बार दबाएँ. सीरिंज बाद में एक्सचेंज नहीं homogenized - सामग्री के साथ संक्रमण से बचने के. लीजिए और एक 15 एमएल टेस्ट ट्यूब में homogenized नमूना पूल और सूक्ष्म विश्लेषण के लिए एक 150 μl नमूना ले. एक अलग नमूना के साथ आगे बढ़ने से पहले विघटित और गेंद homogenizer धो.
  7. 2% सीएस या FCS के साथ बर्फ पर एक प्रकार के बरतन पर 30 मिनट के लिए या एक पहिया उपरि कताई (10-20 आरपीएम) पर 4 बजे homogenate ब्लॉक डिग्री सेल्सियस
  8. के बाद अवरुद्ध क्षुद्र औद्योगिक विकास निगम (1:3000 मन्दन) के खिलाफ या किसी भी अन्य जीवाणु विशेष रूप से LCV झिल्ली के लिए बाध्य मार्कर के खिलाफ एक समानता के शुद्ध प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें. भंवर पहले यह homogenate जोड़ने प्रतिरक्षी समाधान. बर्फ पर एक प्रकार के बरतन पर 1 घंटे के लिए या एक पहिया उपरि कताई (10-20 आरपीएम) पर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना सेते हैं
  9. इस बीच में, Histodenz ढाल तैयार करते हैं. 15 एमएल ढाल प्रति टेस्ट ट्यूब और एक नमूने के तीन 75 सेमी 2 बोतल का उपयोग करें. देवदारअनुसूचित जनजाति, 35% Histodenz 5.75 एमएल ट्यूब को जोड़ने के लिए, और दूसरा, ध्यान से शीर्ष पर 10% Histodenz समाधान के 5.75 एमएल जोड़ें. बाद में ध्यान से 1 घंटे के लिए नीचे क्षैतिज ट्यूब रखना.
  10. Homogenate के अवरुद्ध अभिकर्मक और प्राथमिक एंटीबॉडी, 600 × छ 4 ° सी गोली नमूना 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र के साथ ऊष्मायन के बाद. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 1.5 एमएल एच एस बफर में गोली resuspend. एक 15 एमएल परीक्षण के ट्यूब ताजा नमूनों स्थानांतरण और सूक्ष्म विश्लेषण के लिए एक 40 μl नमूना बाद में ले.
  11. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ गोली सेते हैं - 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन - एमएसीएस बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी सूक्ष्म (01:25 मन्दन) मोती इस बीच में, एमएसीएस चुंबकीय धारक पर कॉलम डाला और उन्हें 0.5 एमएल एच एस बफर के साथ संतुलित करना.
  12. बाद में, स्तंभ के लिए नमूने लागू होते हैं. बाद के सूक्ष्म विश्लेषण के लिए के माध्यम से प्रवाह के 150 μl लीजिए. स्तंभ 0.5 एमएल एच एस बफर के साथ तीन बार धोयें.
  13. से स्तंभ निकालेंस्क्वरटिंग तत्काल वह चुंबक और प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक 0.5 एमएल एच एस बफर के साथ LCVs. सूक्ष्म विश्लेषण के लिए एक 20 μl नमूना ले लो. इम्युनो - चुंबकीय जुदाई द्वारा शुद्धि कदम 1 प्रति उपज की उम्मीद है × 7 10 डी. संक्रमित discoideum लगभग 1 कोशिकाओं × 10 6 बरकरार LCVs, जो के बारे में सात गुणा प्रवाह के माध्यम से 13 के साथ तुलना कर रहे हैं प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक में समृद्ध है.
  14. Histodenz ढाल ट्यूब एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में वापस डाल दिया और ध्यान से शीर्ष पर प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक लोड. 3350 × छ पर ट्यूब 4 में 1 घंटे के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
  15. Centrifugation के बाद 1.5 एमएल भिन्न एक लंबे गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग करके टेस्ट ट्यूब के नीचे से शुरू ले लो. कुल मिलाकर आठ भिन्न, ट्यूब के नीचे से प्रत्येक इकट्ठा. नहीं दिखाई परतों में निरंतर Histodenz ढाल में मनाया जाता है. LCVs के उच्चतम उपज ~ 2 के अनुपात में आम तौर पर 4 अंश में उम्मीद × 10 5 1 प्रति बरकरार LCVs × 10 7 में13 amoebae fected. LCVs की मामूली मात्रा भी भिन्न 3 और 5 में मौजूद हैं, क्रमशः. इस प्रकार, शुद्ध LCVs की कुल उपज ~ 10 × 6 × 7 10 प्रति 6 बरकरार LCVs संक्रमित 1 डी. discoideum कोशिकाओं 13. LCVs की वसूली के कमरे के तापमान (आर टी) में किया जा सकता है, और कई घंटे के लिए LCVs स्थिर दिखाई देते हैं.

3. एकत्र नमूनों की सूक्ष्म विश्लेषण

  1. पाली एल Lysine लेपित coverslips के साथ एक 24 अच्छी तरह से फ्लैट नीचे ऊतक संस्कृति की थाली तैयार है.
  2. हर - LCV शुद्धि प्लस 24 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक घनत्व ढाल अंश के 150 μl के दौरान लिया नमूना विंदुक. प्रत्येक अच्छी तरह से 0.5 एमएल एच एस बफर जोड़ने के लिए उच्च Histodenz एकाग्रता कमजोर. बाद में, 600 × छ पर 10 मिनट के लिए 4 पर थाली अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटाने और आर टी पर 20 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde की (पीएफए) के साथ नमूनों को ठीक. निर्धारण के बाद नमूने में दो बार धोना. हमेंडी. के लिए ई SorC discoideum और RAW264.7 मैक्रोफेज के लिए पीबीएस.
    1. GFP-calnexin से नमूने डी. व्यक्त माउंट discoideum, LCV कांच जैसे Vectashield का उपयोग करने के रूप में स्लाइड पर सीधे अलगाव के दौरान विभिन्न चरणों में ले लिया.
    2. नमूने, LCV अलगाव के दौरान विभिन्न चरणों में ले लिया है RAW264.7 मैक्रोफेज से आरटी पर 10 मिनट के लिए अवरुद्ध समाधान (1% पीबीएस में बीएसए) के साथ, सेते हैं. एक विरोधी SIDC प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए LCVs दाग और आरटी पर एक गीला कक्ष में 1 के लिए सेते हैं (संबंध शुद्ध खरगोश विरोधी SIDC, बफर अवरुद्ध में 1:1000). बाद में, के नमूने पीबीएस के साथ तीन बार धो. आरटी पर एक गीला और अंधेरे कक्ष में 30 मिनट के लिए, एक माध्यमिक एंटीबॉडी (1:200 समाधान अवरुद्ध में जैसे विरोधी खरगोश Cy5) के साथ सेते हैं. अंत में, नमूने पीबीएस के साथ तीन बार धोने और उन्हें कांच जैसे Vectashield का उपयोग करने स्लाइड पर माउंट.
  3. आकृति विज्ञान, और GFP-calnexin से अलग LCVs की अखंडता और मात्रा व्यक्त डी. जिलेया RAW264.7 मैक्रोफेज से coideum एक प्रतिदीप्ति पर्याप्त फिल्टर के साथ सुसज्जित खुर्दबीन से विश्लेषण कर रहे हैं.

4. प्रतिनिधि परिणाम

गुणवत्ता और इम्युनो - आत्मीयता जुदाई और घनत्व ढाल centrifugation द्वारा LCV शुद्धि की उपज प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवि (1) द्वारा पीछा किया जा सकता है. LCV डी. से अलगाव के दौरान एकत्र नमूनों की एक सिंहावलोकन discoideu मीटर या मैक्रोफेज (छवि 2) दिखाया गया है. एल की homogenate pneumophila संक्रमित phagocytes बरकरार LCVs से पता चलता है, लेकिन यह भी सेल मलबे और बाह्य बैक्टीरिया का एक बहुत कुछ है. नमूना pelleting छवि homogenate के लिए समान है, कभी कभी एक बिट में denser. चूंकि बरकरार LCVs स्तंभ रहना चाहिए, प्रवाह के माध्यम से ज्यादातर कोशिकी बैक्टीरिया और सेल मलबे शामिल है. स्तंभ से नमूना eluting के बाद, प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक बड़ी मात्रा में बरकरार LCVs हैं. हमारे हाथ में, LCV purificati पर डी. के लिए और अधिक प्रभावी प्रतीत होता है मैक्रोफेज के लिए की तुलना में discoideum. डी. में discoideum रोगज़नक़ vacuoles राउंडर दिखाई देते हैं और पृथक LCVs की उपज है मैक्रोफेज छवि (3) के साथ तुलना में 10 से अधिक बार अधिक है. बरकरार मैक्रोफेज में अलग एंटीबॉडी के साथ दाग LVCs भी अधिक अनियमित आकार दिखाई देते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 LCV अलगाव की योजनाबद्ध सिंहावलोकन. ए) इम्युनो - चुंबकीय जीवाणु प्रेरक प्रोटीन SIDC के खिलाफ एक एंटीबॉडी आत्मीयता - शुद्ध का उपयोग कर, LCV झिल्ली के लिए विशेष रूप से स्थानीयकृत जुदाई द्वारा LCVs के अलगाव. एक माध्यमिक एमएसीएस सूक्ष्म मनका युग्मित एंटीबॉडी और एक चुंबक के लिए सेल मलबे से LCVs अलग किया जाता है. बी) इम्युनो चुंबकीय जुदाई LCVs के बाद आगे Histodenz घनत्व ढाल centrifugation द्वारा शुद्ध कर रहे हैं. LCVs 4 अंश में समृद्ध कर रहे हैं.

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चित्रा 2 नमूने LCV शुद्धि के दौरान एकत्र की. Homogenate, गोली से चित्र केवल प्रवाह के माध्यम से और डी से प्रोद्धावन में प्रयोग किया जाने वाला घोलक discoideum या मैक्रोफेज चित्रित कर रहे हैं. नमूने एल दिखाने के डी. में pneumophila DsRed एक्सप्रेस (लाल) के उत्पादन discoideum GFP calnexin (हरी, ऊपरी पैनल) संकेत या एक एंटीबॉडी विरोधी क्षुद्र औद्योगिक विकास निगम (सियान, कम पैनल) के साथ दाग मैक्रोफेज में उत्पादन. बार्स, 10 माइक्रोन.

चित्रा 3
चित्रा 3 डी से LCVs शुद्ध. discoideum या मैक्रोफेज. नमूने एल Histodenz घनत्व ढाल centrifugation के बाद दिखाने के अंश 4 (ए) डी में pneumophila DsRed एक्सप्रेस (लाल) उत्पादन discoideum उत्पादन GFP calnexin संकेत (हरा) या (बी) एक एंटीबॉडी विरोधी क्षुद्र औद्योगिक विकास निगम (सियान) के साथ दाग मैक्रोफेज में. बार्स, 10 माइक्रोन.

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Discussion

पहले प्रकाशित तरीकों के विपरीत, इस प्रोटोकॉल दो कदम, पहले एक इम्युनो चुंबकीय दृष्टिकोण से LCVs की जुदाई, और दूसरा, घनत्व ढाल centrifugation द्वारा LCVs की शुद्धि पर आधारित है. LCV अलगाव प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, जब या तो fluorescently लेबल बैक्टीरिया और GFP उत्पादक कोशिकाओं या एंटीबॉडी धुंधला प्रयोग किया जाता है आसानी से पीछा किया जा सकता है. यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक सरल, विधि सीधे आगे है, जो उच्च शुद्धता के साथ LCVs के संवर्धन में परिणाम है. महत्वपूर्ण बात है, homogenization में बफर में protease अवरोध करनेवाला RAW264.7 मैक्रोफेज के लिए आवश्यक है, लेकिन डी. discoideum 13 के लिए वैकल्पिक.

सिद्धांत रूप में, प्रोटोकॉल अन्य रोगज़नक़ों या मेजबान कोशिकाओं के लिए अपनाया जा सकता है, एक विशिष्ट चुनिंदा स्थानीयकृत मार्कर के रूप में लंबे समय के रूप में मौजूद है, जो जुदाई कदम के लिए आवश्यक है. आदर्श रूप में, अलग मार्कर जीवाणु मूल के है, रिक्तिका झिल्ली के लिए पहुँचाया, एकएन डी चुनिंदा वहाँ स्थानीयकृत. अन्य मेजबान सेल के डिब्बों के साथ रोगज़नक़ रिक्तिका के सह शुद्धि अवांछित में एक मेजबान सेल मार्कर होने की संभावना परिणाम का लक्ष्य निर्धारण.

एक बार रोगज़नक़ रसधानी की एक विशिष्ट मार्कर की पहचान की है, एक उपयुक्त पॉलीक्लोनल या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी करने के लिए उठाया है. एकाग्रता और अवरुद्ध अभिकर्मक, हर प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए के रूप में अवरुद्ध है FCS से अन्य अभिकर्मकों अधिक उपयुक्त हो सकता है (जैसे बीएसए, डे lipidated दूध, अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अवरुद्ध अभिकर्मकों).

एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु रोगज़नक़ के संक्रमणशीलता है. बैक्टीरिया संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया उनके सबसे अधिक संक्रामक चरण में होना चाहिए एल. pneumophila, जैसे, post-exponential/early स्थिर तरल संस्कृति में विकास के चरण के लिए हो जाएगा की जरूरत है. इन शर्तों के तहत, जीवाणु भी आकृति विज्ञान (~ 2 x 0.5 माइक्रोन) वर्दी, CYE अगर प्लेट पर हो बैक्टीरिया का विरोध कर रहे हैं. इसके अलावा antibiotiसंभवतः सेल संस्कृति माध्यम में इस्तेमाल किया सीएस कम संक्रामकता और बैक्टीरिया को नुकसान से बचने के संक्रमण से पहले हटा दिया जाना चाहिए. तेज दक्षता पर एक नकारात्मक प्रभाव से बचने के लिए, phagocytes के संक्रमण के समय लगभग 80% की एक confluency नहीं है (अधिक) तक पहुंच जाना चाहिए. अंत में, यद्यपि 1 घंटे की एक ऊष्मायन अवधि एल के लिए मानक संक्रमण समय है pneumophila, LCVs के बजाय एक समरूप और मजबूत जनसंख्या उपज है, अन्य समय अंक LCV गठन पर 13 प्रोटिओमिक या जैव रासायनिक अध्ययन के लिए चुना जा सकता है.

एक बार इसके बाद के संस्करण की विधि एक दिया सेल रोगज़नक़ मेजबान जोड़ी के लिए स्थापित है, यह भी संभव है उत्परिवर्ती जीवाणु उपभेदों और / या डी. सहित विभिन्न मेजबान कोशिकाओं, का परीक्षण करने के लिए discoideum विलोपन म्यूटेंट परिभाषित. सामान्य में, इस प्रोटोकॉल के साथ शुद्ध रोगज़नक़ vacuoles माइक्रोस्कोपी (प्रतिदीप्ति और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी), जैव रासायनिक assays के (पश्चिमी धब्बा) सहित विभिन्न तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है के रूप में हम,प्रोटिओमिक्स और lipidomics रूप में करेंगे. बाद के तरीकों के लिए, यह सलाह दी जाती है के प्रोटिओमिक्स / lipidomics विश्लेषण बफर स्थितियों, नमूना मात्रा और शुद्ध रोगज़नक़ vacuoles के बहाव के प्रसंस्करण के आरोप में व्यक्ति के साथ समन्वय.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

हमारी प्रयोगशाला में अनुसंधान मैक्स वॉन Pettenkofer संस्थान, लुडविग Maximilians विश्वविद्यालय म्यूनिख, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (DFG, 1511/3-1 HI) और Bundesministerium फर Bildung und Forschung (BMBF) "चिकित्सा संक्रमण जीनोमिक्स पहल द्वारा समर्थित किया गया था ( 0315834C).

References

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