Author Produced

Utføre Vaginal lavage, Crystal Violet Staining, og vaginal cytologisk Taksering Mouse brunst Staging Identifikasjon

Biology
JoVE Journal
Biology
AccessviaTrial
 

Summary

Her beskriver vi hvordan du kan identifisere stadium av murine reproduktive (proestrus, estrus, metestrus eller diestrus) med enkle, ikke-invasiv innsamling og cytologisk vurdering av vaginal smear prøver. Vi videre beskrive hvordan vaginal cytologi reflekterer sirkulerende hormonelle nivåer underliggende overgang gjennom murine reproduktive syklus.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification. J. Vis. Exp. (67), e4389, doi:10.3791/4389 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En rask metode for å bedømme reproduktiv status hos gnagere er nyttig ikke bare i studiet av reproduktive dysfunksjon, men er også nødvendig for produksjon av nye musemodeller av sykdom og undersøkelser i hormonell regulering av vev degenerasjon (eller regenerering) etter patologisk utfordring. Murine reproduktive (eller estrous) syklus er delt inn i 4 stadier: proestrus, estrus, metestrus og diestrus. Definerte svingninger i sirkulerende nivåer av ovarian steroider 17-β-østradiol og progesteron, de gonadotropiner luteiniserende og follikkelstimulerende hormoner, og luteotropic hormonet prolaktin signal overgang gjennom disse reproduktive stadier. Endringer i celle typologi innenfor murine vaginal kanalen gjenspeiler disse underliggende endokrine hendelser. Daglig vurdering av den relative andel av kjerneholdige epitelceller, cornified squamous epitelceller, og leukocytter stede i vaginale utstryk kan brukes til å identifisere murine estrousstadier. Graden av invasivitet imidlertid ansatt i å samle inn disse prøvene kan endre reproduktiv status og lokke fram en betennelsesreaksjon som kan forvirre cytologisk vurdering av utstryk. Her beskriver vi en enkel, ikke-invasiv protokoll som kan brukes til å bestemme fasen av brunst av en kvinnelig mus uten å endre sin reproduktive syklus. Vi detalj hvordan å skille mellom de fire stadier av brunst ved innsamling og analyse av dominerende celle typologi i vaginal smears og vi viser hvordan disse endringene kan tolkes i forhold til endokrine status.

Protocol

1. Forbereder Reagenser

  1. For steril vaginal lavage, autoklaveres dobbelt destillert vann (DDH 2 O) og oppbevar i en tett lukket beholder ved romtemperatur inntil nødvendig.
  2. For cytologisk vurdering, tilsett 0,1 g krystallfiolett pulver til 100 ml av DDH 2 O. Bland godt. Krystallfiolett farging (0,1%) kan lagres i en tett lukket beholder ved romtemperatur inntil det er behov.

2. Samle Vaginal Cells (Vaginal lavage)

  1. Plasser en latex pære på enden av en steril 200 pl spissen og utarbeide ca 100 mikroliter sterilt DDH 2 O ved hjelp av overganger på spissen som en volum retningslinje.
  2. Løft musen ut av buret hennes og plassere henne på buret hopper (lokk) med hennes hind / bakenden mot deg.
  3. Ta godt tak i halen og løfter bakenden. Musen vil nå ha bare hennes forbeina fatte beholderen. På dette punktet musen kan urinere. Hvis så, Vent til vannlating stopper. Skulle det være urin igjen ved inngangen til vaginal kanalen, kan det være lurt å skylle åpningen med overflødig DDH 2 O ved hjelp av en separat tips (dvs. ikke din prøvetaking tips).
  4. Plasser enden av DDH 2 O-fylt spissen på åpningen av vaginal kanalen ta vare å ikke trenge gjennom åpningen som vaginal (og cervical) stimulering kan indusere pseudopregnancy i rotter 1,2. Nyere rapporter tyder på mus mindre utsatt for denne effekten likevel forsiktighet bør tas for å minimere graden av invasivitet i gjentatte analyser 3.
  5. Forsiktig trykke lyspæren til å utvise en fjerdedel til halvparten av volumet av vann (~ 25-50 pl) ved åpningen av vaginal kanalen. Væsken vil spontant Aspirer i kanalen uten tips innsetting. Sakte slipper press på pære. Fluidet vil trekke tilbake i spissen. Unngå å slippe press for raskt å forhindre aspirasjon av væskeinn pæren. En filtrert spissen kan være nyttig for dette formål.
  6. Gjenta forrige trinn 4-5 ganger ved hjelp av den samme spissen, pære, og fluidet for å oppnå et tilstrekkelig antall celler i en enkelt prøve.
  7. Plasser fluidet på glass lysbilde, og tillate smøre tørke helt ved romtemperatur. Når tørr, kan disse estrous smears være farget umiddelbart eller oppbevares og farget på et senere tidspunkt.

3. Cytologisk Farging med Crystal Violet * 4

  1. Plasser tørre lysbilde i en Coplin krukke (eller annen sammenlignbar farging fartøy) inneholdende krystallfiolett flekken i 1 min.
  2. Fjern til en andre Coplin jar inneholder DDH 2 O. Vask sliden med DDH 2 O i 1 min. Gjenta.
  3. Fjerne overflødig DDH 2 O fra kantene av lysbilde med et lys-duty vev vindusvisker, unngå kontakt med farget utstryk.
  4. Pipetter ca 15 pl glyserol oppå smear og dekseletslip. Alternativt, kan andre histologiske montering reagenser anvendes for å oppnå en mer varig, ikke-diffuserende flekken.

* Fargingen metoden beskrevet her er den enkleste prosedyren som kan bli utført i ethvert laboratorium. Andre metoder kan gi ytterligere detaljer. For eksempel bruker Papanicolaou flekker, kan modenhet av kjerneholdige epitelceller skilles med mindre modne celler farget turkis og mer modne celler rosa-eller oransje-farget. Disse forskjellene kan brukes til iscenesette tidlige eller sene proestrus. 4

4. Vaginal Cytologi

  1. Undersøke smøre under lett mikroskop for å fastslå celletyper stede. Mikroskopisk undersøkelse bør gjøres umiddelbart etter farging som krystallfiolett sprer fra cellene over tid ved bruk av glyserol for coverslipping. Photomicrographs bør tas på tidspunktet for analyse for å dokumentere cytologi.
  2. Start med å undersøke entire smear en lavere forstørrelse. Velg en representant område og flytte til et høyere forstørrelse. Du vil se cornified squamous epitelceller, leukocytter, og / eller kjerneholdige epitelceller (representative resultater, Figur 1A-C). Forholdet mellom celler til stede vil tillate deg å bestemme estrous stadium av musen på tidspunktet for prøvetaking (representative resultater, figur 1D-G) og hennes umiddelbare hormonelle status (diskusjon, figur 2).

5. Representant Resultater

Cytologi: Tre primære celletyper kan påvises i vaginale smear prøvene: (1) kjerneholdige epitelceller (figur 1A), (2) cornified squamous epitelceller (figur 1B), og (3) leukocytter (figur 1C). Kjerneholdige epitelceller har en lett farget cytoplasma, mørkere farget plasmamembranen, og en oval kjerne ( (figur 1B). Polymorfonukleære leukocytter kan skilles fra epitelceller ved deres uregelmessige form, mørkfargede polymorf atomkjerner, og liten størrelse (figur 1C, svarte pilene). Bør urin forurensning være tilstede i smøre, blir urinsyrekrystaller lett oppdages av deres krystallinske strukturer ulikt eventuelle forventede celletyper (figur 3). Skulle dette skje, og obskure påvisning av dominerende celletype, bør smøre kastes og ikke brukes til iscenesettelsen formål.

Iscenesettelse: Den relative forholdet mellom celletyper observert i smears kan brukes til å identifisere scenen i brunst av musen på dagen for prøvetaking (Figur 1D-G). Under proestrus, cellene er nesten utelukkendeklynger av runde, velformet kjerneholdige epitelceller (figur 1D, representant celle angitt med hvit pil). Under estrus, er cellene hovedsakelig cornified squamous epitelceller, som finnes i tettpakkede klynger (figur 1E, representant celle angitt med pilspiss). Under metestrus, små mørkfargede leukocytter dominerer (figur 1F, representant celle angitt med svart pil). Cornified squamous epitelceller kan observeres, ofte i fragmenter, (figur 1F, representant celle angitt med svart pilspiss). Under diestrus, kan sjeldne cornified squamous epitelceller fortsatt være til stede (Figur 1G, representant celle angitt med svart pilspiss), men leukocytter fortsatt dominerer (figur 1G, representant celle angitt med svart pil). Metestrus kan skilles fra diestrus av utseendet på kjerneholdige epitelceller i diestrus ( g> Figur 1G, angitt representant celle ved hvit pil).

Figur 1
Figur 1. Cytologisk vurdering av vaginal utstryk kan brukes til å identifisere estrous stadium Tre viktigste celletyper oppdages i vaginale smear prøvene:. (A) kjerneholdige epitelceller, (b) cornified squamous epitelceller, og (c) leukocytter. Forholdet mellom disse celletypene stede i smøre kan brukes til å identifisere mus i (D) proestrus, (E) estrus, (F) metestrus, eller (G) diestrus som beskrevet i representative resultater. Svarte pilspisser i E, F og G punktet til representative cornified squamous epitelceller. Svarte pilene i C, F og G punktet til representative leykocytes. Hvite piler i D og G høydepunkt representant kjerneholdige epitelceller.

. Jpg "alt =" Figur 2 "/>
Figur 2. Vaginal smøre cytologi reflekterer underliggende endokrine hendelser. Detaljer er også i diskusjon. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. Urinsyrekrystaller kan være tilstede etter krystallfiolett farging av urin-kontaminerte prøver. (A) Krystaller er transparente og kan være av ulike størrelser (piler og innrammet region forstørret i (B)). Ingen celler er til stede i dette området. Bør urinsyre krystall forurensninger innenfor felt brukt for cytologisk farging være tilstede, kan det være vanskelig å nøyaktig identifisere celletyper tilstede og smøre bør kasseres. Skala barer = 50 mikrometer.

Discussion

Disse endringene i celle typologi er tegn på underliggende endokrine hendelser. Den proestrus fase av brunst tilsvarer den menneskelige follikkelfase av menstruasjonssyklusen 5 og er definert av en pre-ovulasjon økning i sirkulerende 17-β-østradiolnivåer 6, så vel som en liten bølge i prolaktin 7 (figur 2, proestrus, venstre panel). Økningen i 17-β-østradiol stimulerer indirekte gonadotropinfrigjørende hormon nevroner i hypothalamus og septum som, i sin tur, aktiverer responsive celler i fremre hypofyse å frigi luteiniserende hormon og follikkelstimulerende hormon til sirkulasjonen 8,9 (Figur 2 , proestrus, venstre panel). I vaginal smears tatt fra dyr i proestrus, cellene er nesten utelukkende ovale kjerneholdige epitelceller (figur 1D, Figur 2, proestrus, høyre panel). Toppen i follikkelstimulerende Hormen nivåer signaler eggløsning og oppføring i estrus 10,11. Under estrus, 17-β-østradiol nivåer nedgang og prolaktin nivå topp 6,7 (Figur 2, estrus, venstre panel). Vaginal smears er preget av nesten eksklusive påvisning av uregelmessig-formet cornified squamous epitelceller ofte i klumper (figur 1E, figur 2, estrus, høyre panel). Inntreden i metestrus sammenfaller med en kontinuerlig økning i progesteron hormonnivået 6 og tilsvarer begynnelsen av menneskets lutealfasen 12 (figur 2, Metestrus, venstre panel). Som progesteron nivået begynner å stige, og det er en liten økning i 17-β-østradiolnivåer i respons til corpus luteum aktivering 6,13,14 (Figur 2, Metestrus, venstre panel). Celletyper stede i vaginal smears i denne fasen er fragmenterte, cornified epitelceller og mindre mørkere farget leukocytter (Figure 1F, figur 2, Metestrus, høyre panel). Endelig oppstår inngåelse diestrus hos mus og sirkulerende progesteronnivåer 6 topp, tilsvarende den menneskelige sent lutealfasen 12. Regresjon av corpus luteum fører til en senere kraftig nedgang i progesteron nivå 15,16 (figur 2, Diestrus, venstre panel). Leukocytter dominerer i smears under diestrus. Frekvensen av cornified epitelceller reduseres og kjerneholdige epitelceller begynner å påvises like før overgangen til proestrus (figur 1G, figur 2, Diestrus, høyre panel).

Oppsummert kan denne enkle, rutinemessige protokollen brukes til å beregne daglige hormonelle svingninger og etablere estrous stadium i eksperimentelle mus uten å endre reproduktiv status hvis følgende forholdsregler er tatt. Prøvetaking skal utføres ikke mer enn en gang daglig ved hjelp av ikke-invasive protokoll described her i forhold til gjentatte penetrasjon av vaginal kanalen, aspirasjon, og agitasjon. Dette kan forårsake vaginal irritasjon resulterer i en inflammatorisk respons 17 resulterer i leukocytter og andre celletyper å være tilstede i utstryk som kan forvirre cytologisk vurdering. Dessuten, selv i koloni-huset kvinner, er det normalt å se utvidede diestrus og estrus stadier i forskjellige mus også induksjon av anestrous 18 og denne identifikasjonen er nyttig i tolkningen av hormonelle effekt i reproduktiv, kjønn og sykdom studier. Variasjon i sykluslengde er også introdusert med alder og etter boliger forskjeller innenfor kolonier (individ eller gruppe-bolig) av kvinner 7,19-21. Kvinner som lever i kvinnedominerte bare kolonier kan opphøre sykling og skriv en tilstand av langvarig diestrus 18,22,23 selv sykling kan gjenopprettes ved eksponering for bur forbehandlet med mannlig urin for å lokke fram sykling 24,25. Derfor, for å etablere individual sykluslengder for en gitt mus, anbefales det at de ikke-invasive nærmere beskrevet her utføres daglig, med omsorg, inntil to komplette sykluser er observert.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt. Alle eksperimenter på dyr ble utført i henhold til de retningslinjer og regler fastsatt av University of Ottawa Animal Care Committee og den kanadiske Council on Animal Care.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Marc Leonard fra Carleton Immersive Media Studio for ekspert teknisk bistand i videoproduksjon og redigering og Dr. Martin Bertrand fra Carleton Immersive Media Studio / Neural Regeneration Laboratorium for visuell modell assistanse. Forfatterne takknemlig erkjenne ekspertråd av Dr. Marilyn keaney og alle hennes dedikerte ansatte ved Universitetet i Ottawa Animal Care og veterinærtjenester. Dette arbeidet ble finansiert av Canadian Institute of Health Research (CIHR, MOP 62826) til SALB, den CIHR Institute of Aging og strategisk initiativ i Helse / CIHR Training Program i Nevrodegenerative Lipidomics (TGF 96121) til SALB og SF, Canadian Foundation for innovasjon til SF, Ontario Innovation Trust til SF, og Autodesk Forskning til SF. ACM mottar en CIHR Banting og Best doktor prisen. NV får en post-profesjonell fellesskap fra Institute of Aging og CIHR Training Program i nevrodegenerative Lipidomics.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sterile 200 μl pipette tips Diamed E340901
Latex bulb (1 ml) Fisher 03-488-21
Glass microscope slides Fisher 12-550-15
Crystal Violet stain (25 g) Fisher C581-25
Light-duty Tissue Wipers VWR 82003-820
Glycerol Fisher BP229-1
Microscope Cover Glass (22x30) Fisher 12-544A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adler, N. T., Zoloth, S. R. Copulatory behavior can inhibit pregnancy in female rats. Science. 168, 1480-1482 (1970).
  2. Adler, N. T., Resko, J. A., Goy, R. W. The effect of copulatory behavior on hormonal change in the female rat prior to implantation. Physiology. 5, 1003-1007 (1970).
  3. Yang, J. J., Larsen, C. M., Grattan, D. R., Erskine, M. S. Mating-induced neuroendocrine responses during pseudopregnancy in the female mouse. Journal of. 21, 30-39 (2009).
  4. Hong, H. Changes in the mouse estrus cycle in response to BRCA1 inactivation suggest a potential link between risk factors for familial and sporadic ovarian cancer. Cancer research. 70, 221-228 (2010).
  5. Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. The menstrual cycle: basic biology. Annals of the New York Academy of Sciences. 1135, 10-18 (2008).
  6. Walmer, D. K., Wrona, M. A., Hughes, C. L., Nelson, K. G. Lactoferrin expression in the mouse reproductive tract during the natural estrous cycle: correlation with circulating estradiol and progesterone. Endocrinology. 131, 1458-1466 (1992).
  7. Parkening, T. A., Collins, T. J., Smith, E. R. Plasma and pituitary concentrations of LH, FSH, and prolactin in aging C57BL/6 mice at various times of the estrous cycle. Neurobiology of aging. 3, 31-35 (1982).
  8. Sarkar, D. K., Chiappa, S. A., Fink, G., Sherwood, N. M. Gonadotropin-releasing hormone surge in pro-oestrous rats. Nature. 264, 461-463 (1976).
  9. Rajendren, G., Gibson, M. J. A confocal microscopic study of synaptic inputs to gonadotropin-releasing hormone cells in mouse brain: regional differences and enhancement by estrogen. Neuroendocrinology. 73, 84-90 (2001).
  10. Kumar, T. R., Wang, Y., Lu, N., Matzuk, M. M. Follicle stimulating hormone is required for ovarian follicle maturation but not male fertility. Nature. 15, 201-204 (1997).
  11. Montgomery, V., Loutradis, D., Tulchinsky, D., Kiessling, A. FSH-induced ovulation in intact and hypophysectomized mice. Journal of reproduction and fertility. 84, 1-6 (1988).
  12. Mihm, M., Gangooly, S., Muttukrishna, S. The normal menstrual cycle in women. Animal reproduction science. 124-229 (2011).
  13. Appelgren, L. E. Histochemical demonstration of drug interference with progesterone synthesis. Journal of reproduction and. 19, 185-186 (1969).
  14. Sander, V. A., Facorro, G. B., Piehl, L., de Celis Rubin, E., Motta, A. B. Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice. Reproduction. 138, 571-579 (2009).
  15. Stocco, C., Telleria, C., Gibori, G. The molecular control of corpus luteum formation, function, and regression. Endocrine reviews. 28, 117-149 (2007).
  16. Rudolph, M. Induction of overt menstruation in intact mice. PLoS One. 7, e32922 (2012).
  17. Yano, J., Lilly, E., Barousse, M., Fidel, P. L. Epithelial cell-derived S100 calcium-binding proteins as key mediators in the hallmark acute neutrophil response during Candida vaginitis. Infection and immunity. 78, 5126-5137 (2010).
  18. Whitten, W. K. Occurrence of anoestrus in mice caged in groups. The Journal of endocrinology. 18, 102-107 (1959).
  19. Lamond, D. R. Effect of stimulation derived from other animals of the same species on oestrous cycles in mice. The Journal of endocrinology. 18, 343-349 (1959).
  20. Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C. A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology. Biology of reproduction. 27, 327-339 (1982).
  21. Felicio, L. S., Nelson, J. F., Finch, C. E. Longitudinal studies of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: II. Cessation of cyclicity and the duration of persistent vaginal cornification. Biology of reproduction. 31, 446-453 (1984).
  22. Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. II. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 5, 213-215 (1956).
  23. Van Der Lee, S., Boot, L. M. Spontaneous pseudopregnancy in mice. Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).
  24. Armaiz-Pena, G. N. Estrous cycle modulates ovarian carcinoma growth. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 15, 2971-2978 (2009).
  25. Jemiolo, B., Harvey, S., Novotny, M. Promotion of the Whitten effect in female mice by synthetic analogs of male urinary constituents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4576-4579 (1986).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics