चूहे में नियंत्रित सरवाइकल पंगु बनाना चोट

Medicine
 

Summary

एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाने के लिए एक उपन्यास तकनीक

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Zhang, Y. P., Walker, M. J., Shields, L. B., Wang, X., Walker, C. L., Xu, X. M., Shields, C. B. Controlled Cervical Laceration Injury in Mice. J. Vis. Exp. (75), e50030, doi:10.3791/50030 (2013).

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Abstract

आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों का इस्तेमाल इस तरह के एक रीढ़ की हड्डी की चोट (एससीआई) के रूप में कई न्यूरोलॉजिकल विकारों अंतर्निहित आणविक तंत्र की हमारी समझ को बढ़ाता है. एससीआई के एक पंगु बनाना मॉडल का उत्पादन किया जाता मुक्तहस्त मैनुअल नियंत्रण अक्सर एक क्रश या नील घटक और, इसलिए, एक उपन्यास तकनीक विकसित किया गया था के साथ जुड़े असंगत चोटों पैदा करता है. ग्रीवा पंगु बनाना एससीआई के हमारे मॉडल) कशेरुकी पहलू निर्धारण, 2 द्वारा) बढ़ाया रीढ़ की हड्डी जोखिम ग्रीवा कशेरुका स्थिरीकरण 1 शामिल द्वारा मुक्तहस्त विधि के साथ निहित समस्याओं का समाधान हो गया है, और 3) रीढ़ की हड्डी की एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पंगु बनाना का निर्माण एक oscillating ब्लेड के साथ प्रयोग जुड़े नील बिना गहराई में ± 0.01 मिमी की शुद्धता. इस तरह के एक स्केलपेल या कैंची का मुक्तहस्त प्रयोग के रूप में एक एससीआई पंगु बनाना बनाने के मानक तरीकों की तुलना में हमारे विधि एक सुसंगत घाव का उत्पादन किया गया. इस विधि corticosp की axonal उत्थान पर अध्ययन के लिए उपयोगी हैinal, rubrospinal, और पृष्ठीय आरोही हिस्से.

Introduction

आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की उपलब्धता एससीआई के तंत्र में एक भूमिका निभाते हैं कि विशेष जीन के प्रभाव की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. पंगु बनाना एससीआई इस चोट 8 निम्नलिखित प्रभावी उपचार प्रदान कर सकता है कि चिकित्सीय एजेंट या अणुओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल एक महत्वपूर्ण मॉडल है. चूहों में पंगु बनाना चोट के निर्माण के दौरान spinous प्रक्रियाओं का निर्धारण होने के कारण रीढ़ की हड्डी निर्धारण 5,11 को बनाए रखने के साथ शामिल पतली और नाजुक spinous प्रक्रियाओं लोभी करने में कठिनाई imprecise है. केवल 0.2 मिमी (माउस रीढ़ की हड्डी के व्यास का 10%) की पंगु बनाना की गहराई में परिवर्तनशीलता डेटा के भ्रामक व्याख्या का कारण बनता है. रीढ़ की हड्डी पंगु बनाना घाव की प्रकृति और सीमा ठीक 10 परिभाषित किया जाना चाहिए. इस चुनौती से निपटने के लिए, हम कशेरुकी स्थिरीकरण से मिलकर एक उपन्यास तकनीक विकसित और Louisville चोट सिस्टम उपकरण से जुड़ी गढ़े ब्लेड का इस्तेमाल किया है (लिसा) एक पंगु बनाना एससीआई 7,14 निर्माण करने के लिए. इस चोट के कारण पंगु बनाना प्रक्रिया के दौरान ऊतक विरूपण बचा है कि एक तेज दोलन ब्लेड का उपयोग करके बनाया गया था. पंगु बनाना की गहराई पंगु बनाना गहराई नियंत्रण जो सूक्ष्म ड्राइवरों का उपयोग करके 0.01 मिमी की एक सटीकता के लिए सटीक था. काटना ब्लेड वांछित पंगु बनाना समोच्च 9 बनाने के लिए विशिष्ट आकार और चौड़ाई के लिए कस्टम बना रहे हैं. हम 1) ग्रीवा रीढ़ प्रदर्शन, 2 की विधि) एक द्विपक्षीय पहलू निर्धारण डिवाइस का उपयोग कशेरुकी स्थिरीकरण की तकनीक, और एक हिल ब्लेड का उपयोग कर एक ग्रीवा पंगु बनाना चोट के 3) सृजन का प्रदर्शन.

Protocol

1. रीढ़ स्थिरता के पशु तैयारी और अनुप्रयोग

माउस ग्रीवा रीढ़ पेट के बल के रूप में पार्श्व दृश्य से देखा अवतल है. सी 3 से T1 को spinous प्रक्रियाओं छोटे और नाज़ुक हैं और आमतौर पर 3,4 वर्णित के रूप में इसलिए, कशेरुकी स्थिरीकरण के लिए उपयुक्त नहीं हैं. हम रीढ़ स्थिरीकरण पार्श्व पहलू निर्धारण द्वारा प्रदर्शन किया जा सलाह देते हैं. नियतन डिवाइस पार्श्वतः प्रत्येक पहलू को दबाना है कि माउस और दो समायोज्य स्टेनलेस स्टील हथियारों का समर्थन करने के लिए एक यू के आकार का धातु चैनल के होते हैं. इस लक्ष्य बांस की उत्कृष्ट स्थिरीकरण प्रदान करता है. रीढ़ की हड्डी निर्धारण के बाद, रीढ़ थोड़ा रीढ़ की हड्डी के बेहतर प्रदर्शन प्रदान करने के लिए ग्रीवा रीढ़ वक्रता समतल करने के लिए उठाया है.

  1. संदंश, microscissors के 2 जोड़ी, एक 30 जी सुई, सिवनी और सुई धारक, त्वचा क्लिप, और क्लिप applicator की 2-3 जोड़े: निम्नलिखित शल्य चिकित्सा उपकरणों जीवाणुरहित. रीढ़ स्टेबलाइजर कीटाणुरहित. AnesKetamine / Xylazine (100 मिलीग्राम / 10 मिलीग्राम / किग्रा) की intraperitoneal कॉकटेल का उपयोग कर माउस thetize. माउस की गर्दन से बाल दाढ़ी.
  2. एक povidone आयोडीन समाधान और 70% शराब के साथ त्वचा की सफाई के बाद, एक हीटिंग पैड के साथ गरम ऑपरेटिंग मेज पर माउस ले जाते हैं. कॉर्निया सुखाने को रोकने के लिए नेत्र मरहम के साथ पशु की आंखों को कवर किया.
  3. संज्ञाहरण (माउस एक पूंछ चुटकी का जवाब नहीं है जब तक पहुँच) के शामिल होने के बाद, कम ग्रीवा रीढ़ की वसा पैड को डब से एक पीछे ग्रीवा midline त्वचा चीरा बनाते हैं. आवर्धन के तहत, सी 2 में trapezius मांसपेशियों के बीच एक midline चीरा प्रदर्शन और semispinalis कैपिटिस मांसपेशियों विभाजित. Submuscular वसा पैड की पहचान सही परत में विच्छेदन की सुविधा.
  4. एक विश्वसनीय मील का पत्थर के रूप में कार्य करता है जो टी 2 spinous प्रक्रिया के लिए दुमदारी midline पेशी विच्छेदन बढ़ाएँ. टी 2 बांस से जुड़ी मांसपेशियों में कटौती और टी 2 की उपास्थि हिस्से को हटा देंspinous प्रक्रिया.
  5. सूक्ष्म कैंची की एक जोड़ी का उपयोग टी 2 laminae के माध्यम से सी 2 से paraspinal मांसपेशियों काटना. स्नायु विच्छेदन spinous प्रक्रियाओं से सटे शुरू होता है और पहलू जोड़ों को द्विपक्षीय स्तर पर फैली हुई है. रक्तस्राव को कम करने के लिए spinous प्रक्रियाओं और laminae (Periosteal परत में) के लिए तुरंत आसन्न मांसपेशियों को अलग करें. पार्श्व पहलुओं के उजागर होने के बाद, लिसा चरण के यू के आकार चैनल पर माउस जगह.
  6. द्विपक्षीय स्तर पर उजागर पहलुओं नीचे स्टेनलेस स्टील हथियार देते हैं. हथियारों की जगह में हैं, रीढ़ को स्थिर करने के लिए स्टील हथियारों के अंगूठे शिकंजा कस. इस लक्ष्य बांस की फर्म निर्धारण का कहना है और उत्कृष्ट प्रदर्शन प्रदान करता है. हथियारों की रीढ़ की सटीक क्षैतिज अभिविन्यास प्रदान करने के लिए समायोजित किया जा सकता है.
  7. ड्यूरा अंतर्निहित पर्दाफाश करने के लिए C5 और C6 के बीच लिगामेंटम flavum काटकर अलग कर देना. Interlaminar अंतरिक्ष के बीच, microscissors के लिए रखा जाता है जिसके माध्यम से एक छोटे durotomy बनाने के लिए एक 30 जी सुई का उपयोगdurotomy हूं. रीढ़ की हड्डी अब नियंत्रित पंगु बनाना घाव गुजरना करने के लिए तैयार किया जाता है.

2. लिसा डिवाइस का उपयोग सरवाइकल स्पाइनल कॉर्ड पंगु बनाना

  1. ग्रीवा रीढ़ की हड्डी बढ़ने की चौड़ाई विभिन्न स्तरों पर भिन्न होता है. एक 2.3 मिमी फ्लैट ब्लेड का उपयोग सी 5 -6 में एक पृष्ठीय hemisection घाव करें और रीढ़ की हड्डी की पूरी चौड़ाई को कवर करने के कंपन का आयाम निर्धारित किया है. ब्लेड ललित विज्ञान उपकरण इंक (फोस्टर शहर, सीए) से प्राप्त की है और रीढ़ की हड्डी को पंगु बनाना के लिए संशोधित कर रहे हैं. कम आयाम के स्तर की हड्डी पंगु बनाना में आसानी कम होगा ही, ≥ 0.5 मिमी पर ब्लेड दोलन के आयाम बनाए रखें.
  2. लिसा मंच पर रीढ़ स्थिरता और माउस रखें. ब्लेड गति के तीन श्रेणियों में सक्षम सूक्ष्म चालकों द्वारा नियंत्रित अपनी स्थिति के साथ लिसा से जुड़ा हुआ है. लिसा और उनके कार्यों के घटक चित्रा 1 में वर्णित हैं.
  3. पावर पर ब्लेड हिल स्विच. Magnif तहतउजागर रीढ़ की हड्डी हिल ब्लेड के नीचे सीधे तैनात है कि इतनी ication, माउस ले जाते हैं.
  4. दोलन ब्लेड की ओर माउस समर्थन मंच तरक्की. ब्लेड मुश्किल से रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय नस छू लेती है जब "0" स्थिति दर्ज की गई है. "0" स्थिति के सापेक्ष रीढ़ की हड्डी पंगु बनाना की गहराई मापने.
  5. सूक्ष्म चालक नियंत्रण द्वारा मंच स्थिति तरक्की: सूक्ष्म चालक दस्ता के एक 360 डिग्री बारी 0.25 मिमी से मंच उठ. इस प्रकार, एक 0.75 एमएम पृष्ठीय hemisection घाव सूक्ष्म चालक दस्ता 3 बार बदल कर बनाया जाता है. घाव की सटीकता ± 0.01 मिमी है. ब्लेड रीढ़ की हड्डी तोड़ डालना शुरू होता है, खारा सिंचाई के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र चिकना. रीढ़ की हड्डी के काटने गहराई खड़ी सूक्ष्म चालक द्वारा नियंत्रित और दृश्य मार्गदर्शन की स्वतंत्र है.
  6. पूर्व निर्धारित गहराई तक पहुँच गया है, हिल स्विच बंद कर देते हैं. आदर्श रूप में, दोलन ब्लेड एल में तैनात हैऊतक विरूपण के प्रमाण के बिना esion खाई. काटने ब्लेड से मंच के निचले हिस्से और कपास क्यू युक्तियों का उपयोग शल्य चिकित्सा क्षेत्र से रक्त और खारा हटा दें. Hemostasis <1 मिनट में सहज होता है.
  7. रीढ़ स्टेबलाइजर से माउस रिलीज. 6-0 रेशम सीवन और त्वचा बंद का उपयोग कर paraspinal मांसपेशियों लगभग स्टेनलेस स्टील मिशेल क्लिप का उपयोग घाव.

3. पशु की देखभाल

  1. Subcutaneously चेतना जबकि पर्याप्त जलयोजन बनाए रखने और एक हीटिंग पैड पर वसूली पिंजरे में माउस के लिए जगह खारा 1-2 मिलीलीटर की कुल इंजेक्षन.
  2. पानी और नरम भोजन इच्छानुसार प्रदान करें और 48 घंटे बाद operatively के लिए दर्दनाशक दवाओं प्रशासन. रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय hemisection निम्नलिखित मूत्राशय की देखभाल के लिए कोई जरूरत नहीं है.

Representative Results

लक्ष्य बांस का स्थिरीकरण माउस रीढ़ की हड्डी की सटीक घावों पैदा करने में बहुत महत्व है. हमारी रीढ़ स्थिरीकरण डिवाइस कम spinous प्रक्रियाओं और माउस ग्रीवा रीढ़ के उदर अग्रकुब्जता की संरचनात्मक मुद्दों पर काबू. ग्रीवा कशेरुक अच्छी तरह से हमारे ग्रीवा रीढ़ स्टेबलाइजर (चित्रा 2) का उपयोग कर सामने आ रहे हैं. युक्ति स्थिर हमारे माउस रीढ़ ग्रीवा रीढ़ की हड्डी प्रक्रियाओं के लिए रीढ़ की हड्डी तैयार करने के लिए एक विश्वसनीय तकनीक है. लिसा का उपयोग कर घाव की गहराई 0.01 मिमी 6,13 करने के लिए सटीक है. सटीक पंगु बनाना घाव / ऊतक इंटरफेस (चित्रा 3) में कोई कुचलन का कारण बनता है. पृष्ठीय hemisection घावों की सटीक एक 0.9 मिमी गहरी पंगु बनाना सिर्फ रीढ़ की हड्डी 1 के रोग वर्गों द्वारा पुष्टि की प्रत्येक नमूना में केंद्रीय नहर से आगे बढ़ाया जिसमें axonal उत्थान पर एक अध्ययन में C57BL 6 / चूहों में प्रदर्शन किया गया. इन पशुओं के सभी की हरकत की वसूलीइस रीढ़ की हड्डी पंगु बनाना चोट के बाद एड.

चित्रा 1
चित्रा 1. (ए) लिसा मंच पर रखा रीढ़ स्थिरता प्राप्त करने में माउस. हिल ब्लेड पंगु होने की रीढ़ की हड्डी की ओर निर्देशित है. माइक्रो चालक नियंत्रण मंच के नीचे स्थित हैं और उपयुक्त साइट में माउस की स्थिति के लिए तैयार कर रहे हैं. खड़ी सूक्ष्म चालक घाव गहराई को नियंत्रित करता है, और झुकने घुंडी पंगु बनाना का कोणीयकरण को रोकने के लिए रीढ़ की हड्डी की क्षैतिज विमान को नियंत्रित करता है. पर स्विच बंद कंपन मोटर को नियंत्रित करता है, और एक और दस्ता अपनी आयाम समायोजित कर देता है. (बी) एक 0.75 एमएम पृष्ठीय hemisection पंगु बनाना घाव बरकरार लामिना मेहराब के नीचे काटा.

चित्रा 2
चित्रा 2. (ए) एक यू के आकार का चैनल और दो ​​हथियार और कनेक्टर्स से मिलकर माउस रीढ़ स्टेबलाइजर. माउस ग्रीवा एससीआई के लिए इस्तेमाल किया सी गर्त में और वक्ष एससीआई के लिए टी गर्त में रखा गया है. (बी) ग्रीवा रीढ़ पार्श्व पहलुओं के तहत हथियार रखने और फिर अंगूठे शिकंजा बंद करके उतारना चाहते है. ड्यूरा हड्डी के किसी भी हटाने के बिना सी 5-6 के laminae, सी 6, 7, और C7-T1 के बीच संपर्क में है.

चित्रा 3
चित्रा 3. 0.5 की गहराई, 0.8, 1.1, और बाण के समान दृश्य (दाग cresyl वायलेट और eosin) में मनाया 1.4 मिमी से कम चार पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी lacerations इस तकनीक का उपयोग परिशुद्धता के उच्च स्तर को दर्शाया गया है.

Discussion

रीढ़ की हड्डी को पंगु बनाना चोटों से पहले कशेरुकी स्थिरीकरण spinous प्रक्रियाओं का निर्धारण द्वारा प्राप्त किया गया है. माउस में T1 के माध्यम से सी 3 से नाज़ुक कम ग्रीवा spinous प्रक्रियाओं को clamps के ग्रीवा रीढ़ lordotic वक्र और लगाव दोनों प्रभावी रीढ़ स्थिरीकरण रोका जा सके. इसके अलावा, मैनुअल नियंत्रण घाव 6 की गहराई में परिवर्तनशीलता बनाता है कि महत्वपूर्ण ऊतक विकृति का कारण बनता है के तहत उपयोग एक रेजर ब्लेड या microscissors का उपयोग करें. इस विशेष रास्ते की axonal उत्थान का अध्ययन किया जाता है, विशेष रूप से जब डेटा के अशुद्ध अर्थ हो सकता है. पृष्ठीय corticospinal पथ पूरी तरह से lesioning के समय transected नहीं किया गया था अगर उदाहरण के लिए, बख्शा पृष्ठीय corticospinal एक्सोन पुनर्जीवित एक्सोन के रूप में गलत व्याख्या की जा सकती है. इन चुनौतियों का एक ही स्तर और रीढ़ की हड्डी की सटीक lesioning में पहलुओं के निर्धारण के साथ एक रीढ़ स्थिरीकरण डिवाइस का उपयोग करके दूर किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, आह का उपयोग करigh आवृत्ति दोलन ब्लेड आसन्न रीढ़ की हड्डी कुचल या contusing बिना एक तेज पंगु बनाना पैदा करता है. इस विधि चूहों 6 में वक्ष रीढ़ की हड्डी lacerations का निर्माण करने के बाद संशोधनों के साथ चूहों 9,12,14 में रीढ़ की हड्डी पंगु बनाना चोटों के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया है. वर्तमान संचार में, हम माउस में विश्वसनीय ग्रीवा पंगु बनाना घावों बनाने की विधि का वर्णन है.

रीढ़ की हड्डी की अग्रपश्च व्यास माउस में <2 मिमी है insofar के रूप में, पंगु बनाना घाव का सटीक गहराई एक विश्वसनीय प्रयोगात्मक मॉडल बनाने में महत्वपूर्ण हैं. घाव गहराई में कम से कम परिवर्तनशीलता काफी अक्षतंतु उत्थान के साथ ही बड़ा और व्यवहार के अध्ययन का आकलन करने के प्रयोगों के परिणामों को बदल देगा. हम काटने ब्लेड की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए उच्च परिशुद्धता माइक्रो चालकों का इस्तेमाल किया है क्योंकि इस पद्धति का उपयोग घाव गहराई की सटीकता ± 0.01 मिमी है. इस विधि में विसंगति कम हो गया हैएक पंगु बनाना एससीआई बनाने के अन्य मॉडलों में Herent. इस विधि ऐसे corticospinal पथ, rubrospinal पथ, और पृष्ठीय आरोही पथ के रूप में रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय छमाही में स्थित लंबे रीढ़ की हड्डी रास्ते की axonal उत्थान के अध्ययन में विशेष रूप से उपयोगी है. इस विधि के साथ, इन फाइबर इलाकों को पूरी तरह से हो सकता है और मज़बूती से transected कर सकते हैं. इस संबंध में, डेटा की व्याख्या की त्रुटियों जिससे एससीआई पर प्रायोगिक अध्ययन की रिपोर्टिंग की विश्वसनीयता में सुधार, कम कर रहे हैं.

संक्षेप में, हम माउस में ग्रीवा रीढ़ की हड्डी पंगु बनाना चोट के vivo मॉडल में एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बनाने के लिए एक उपन्यास तकनीक का वर्णन किया है. इस तकनीक को एक oscillating ब्लेड का उपयोग कर रीढ़ की हड्डी की ग्रीवा पहलुओं और पंगु बनाना का निर्धारण द्वारा रीढ़ स्थिरीकरण पर आधारित है. चूहों 6 में एक पृष्ठीय वक्ष रीढ़ की हड्डी पंगु बनाना मॉडल में इस पद्धति का उपयोग करके, हम पंगु बनाना गहराई, ऊतक विज्ञान, और के बीच एक तंग सहसंबंध का प्रदर्शनव्यवहार वसूली. इस तरह की तकनीक भी कई अन्य प्रयोगशालाओं 2,12 से विश्वसनीय होना पाया गया है.

Disclosures

  1. कई लेखकों (YPZ, Xmx, सीबीएस) लुइसविल Impactor सिस्टम, Inc में एक वित्तीय हित है
  2. लेखकों, यी पिंग झांग, लिसा इ ढाल, और क्रिस्टोफर बी शील्ड्स, नॉर्टन हेल्थकेयर, लुइसविले, केंटकी के कर्मचारी हैं. अन्य लेखकों में इंडियाना विश्वविद्यालय, इंडियानापोलिस, द्वारा नियोजित कर रहे हैं.
  3. लेखक इस लेख में इस्तेमाल अभिकर्मकों या उपकरणों का उत्पादन है कि किसी भी कंपनी से धन प्राप्त नहीं किया था.

Acknowledgments

इस उपकरण का विकास लिसा कं, केंटकी द्वारा समर्थित किया गया था. हम भी नॉर्टन हेल्थकेयर, लुइसविल, सीबीएस के लिए केंटकी, और एनआईएच NS050243, NS052290, और Xmx को NS059622 के चल रहे समर्थन को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mice vertebral stabilizer Louisville Impactor System Stabilize and expose the cervical vertebra
LISA vibraknife Louisville Impactor System Produce the laceration injury of the cervical spinal cord
Spring Scissors Fine Science Tools (USA) 15013-12 Skin and trapezius muscle incision
Spring Scissors Fine Science Tools (USA) 15023-10 Separate muscles from the laminae
Spring Scissors Fine Science Tools (USA) 15002-08 Incision of dura
Graefe forceps Fine Science Tools (USA) 11154-10 Retract skin
Dumont #7 forceps Fine Science Tools (USA) 11274-20 Muscle retraction (tip modified)(Fig. A)
Dumont SS forceps Fine Science Tools (USA) 11203-25 Fixation of vertebra (tip modified )(Fig.B)
30G needle Becton Dickenson 305106 Create a dural opening
6-0 suture Ethicon 8806H Close muscle and fascial layers
wound clip Fine Science Tools (USA) 12031-07 Skin closure
Tribrom–thanol (Avertin) Sigma-Aldrich 90710-10G Anesthetic agent

Louisville Impactor System, Inc, 210 E. Gray St., Suite 1102, Louisville, KY 40202, (502) 629-5510, E-mail: cbshields1@gmail.com

Fine Science Tools (USA), Inc, 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139, (800) 521-2109, E-mail: info@finescience.com

Becton Dickenson, 1 Becton Drive, Franklin Lakes, NJ USA 07417, (201) 847-6800 Ethicon, Route 22 West, Somerville, NJ 08876 1-877-ETHICON

Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO, USA, 63178 (314) 771-5765, E-mail: cssorders@sial.com

Figure A is the modified Dumont #7 forceps; B is the modified Dumont SS forceps.

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