म्यूनिख Wistar चूहों में 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग फ्लोरोसेंट अणुओं की ग्लोमेरुलर पारगम्यता बढ़ाता

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Summary

2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी उच्च संकल्प intavital उपयोग एक तकनीक सीधे कल्पना और सतह ग्लोमेरुली में gloemrular निस्पंदन यों को. इस विधि में सामान्य और रोगग्रस्त दोनों राज्यों में बड़े अणुओं की पारगम्यता विशेषताओं के प्रत्यक्ष निर्धारण के लिए अनुमति देता है.

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Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. J. Vis. Exp. (74), e50052, doi:10.3791/50052 (2013).

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Abstract

Protocol

1. Sulfo-Rhodamine 101 Sulfonyl क्लोराइड (टेक्सास रेड) को Albumin चूहा सीरम का संयुग्मन

  1. अंतिम एकाग्रता एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 15 मिलीग्राम / एमएल, 100 मिमी सोडियम बिकारबोनिट पीएच 9.0 का चूहा में (आरएसए) सीरम albumin 6.667 मिलीग्राम से 100 मिलीग्राम भंग.
  2. जगह बर्फ / पानी बीकर में समाधान और 0 से 4 डिग्री सेल्सियस के बीच शांत करने के लिए
  3. 15 सेकंड के लिए मध्यम पर भंवर, टेक्सास रेड Sulfonyl क्लोराइड (TRSC) की एक 10 मिलीग्राम शीशी को उच्च गुणवत्ता निर्जल डाइमिथाइल Formamide (DMF) के 200 μl जोड़ें.
  4. भंवर आरएसए माध्यम पर समाधान और भंग TRSC जोड़ें.
  5. पन्नी में लपेटें 50 मिलीलीटर शंक्वाकार (बनाई है Parafilm के एक तंग सील आश्वस्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है), क्षैतिज डब्ल्यू / बर्फ ही और जगह (बुलबुले के गठन से बचने) धीरे समाधान आंदोलन घुमाव पर बर्फ बाल्टी में जगह, प्रतिक्रिया 0 पर जारी करने की अनुमति से 4 डिग्री सेल्सियस 1 घंटे के लिए.
  6. 0.9% खारा समाधान के 5 एल करें, और क्लिप के साथ या तो एक) डायलिसिस झिल्ली हो सकता है जो कक्ष काट एक 50 केडीए आणविक वजन, ख) डी गीलाएक नाव एक से Lyzer, या ग) स्लाइड एक Lyzer कैसेट (विसंयुग्मित TRSC को दूर करने के लिए सभी उपयुक्त) में के रूप में alysis ट्यूबिंग.
  7. 5 एल कंटेनर w / 0.9% नमकीन घोल में डायलिसिस कक्ष और जगह में रखें प्रतिक्रिया मिश्रण, एक हलचल पट्टी का उपयोग कर एक कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात dialyze.
  8. वस्तुतः कोई रंग बदलने में एक रात ऊष्मायन परिणाम (यह आम तौर पर कम से कम 4 एक्सचेंजों के साथ ~ 48 घंटे लगते हैं) जब तक सुबह और देर से दोपहर में 5 एल डायलिसिस समाधान बदलें. इसके अतिरिक्त, 50 केडीए की MWCO आरएसए, 66kDa की मेगावाट के करीब होने के साथ, यह एक स्पष्ट समाधान का उत्पादन कभी नहीं करने के लिए संभव है, इस झिल्ली के छेद के आकार में वितरण पर निर्भर हो जाएगा, 60 घंटे और 5 एक्सचेंजों है पर्याप्त समय की तुलना में अधिक है.
  9. उपाय मात्रा और टी.आर. आरएसए की अनुमानित एकाग्रता देने के लिए मात्रा से 100 मिलीग्राम की प्रारंभिक वजन को विभाजित है, आम तौर पर सांद्रता सीमा 10-13 से मिग्रा / मिली. अंतिम डाई: एल्बुमिन अनुपात 15,00 ~ 4:1, 1 फ्लोरोफोरे होना चाहिएप्रोटीन मेगावाट की 0 Daltons. 4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस, हो सकता है कि विखंडन के परिणामस्वरूप पारगम्यता मूल्यों में परिवर्तन के रूप में होगा, टी.आर. आरएसए समाधान फ्रीज कभी नहीं.

2. इमेजिंग / माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के लिए उल्टे माइक्रोस्कोप स्टेज की तैयारी

  1. प्लेस ~ आटोक्लेव टेप के 4-7 टुकड़े (लगभग ¾ "लंबे समय तक) पूरी तरह से एक 40 मिमी coverslip नीचे (coverslip के नीचे पकवान) के साथ एक 50 मिमी पकवान के अंदर एक दूसरे पर खड़ी है. इन किनारों में से एक के करीब रखा जाना चाहिए ताकि टेप के किनारे गुर्दे की वक्रता की बढ़त के साथ संपर्क बनाने के लिए, लेकिन उद्देश्य प्रकाश पथ (आंकड़े 1 ए और 1 बी) ब्लॉक नहीं होगा, बड़ा चूहों पकवान के टेप और धार के बीच अधिक स्थान की आवश्यकता होगी.
  2. 50 मिमी पकवान (चित्रा 1 ए) के साथ मंच के बगल में जगह 2 Repti-थेर्म पैड. मंच पर एक वार्मिंग पानी जैकेट कंबल रखें.
  3. उद्देश्य बुर्ज आश्वस्त छवियों का संग्रह एक 10x हवा ओ है जब क्षमता को अधिकतमआर 20x (हवा या पानी विसर्जन) उद्देश्य और quantitation के लिए छवियों को इकट्ठा करने के लिए एक उच्च शक्ति पानी विसर्जन उद्देश्य.
  4. इमेजिंग के दौरान उद्देश्यों के लिए पानी जोड़ने के लिए सबसे कारगर तरीका ओर करने के लिए उन्हें बारी बारी से और उद्देश्यों के शीर्ष तक पहुँच सकते हैं कि पीई-200 ट्यूबिंग का एक लंबा टुकड़ा के साथ एक 1 सीसी सिरिंज का उपयोग पानी जोड़ने के लिए है.
  5. सॉफ्टवेयर पर तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग ~ 15-20% तक 10watt लेजर की उत्तेजना तीव्रता निर्धारित करें. गैलियम आर्सेनाइड फास्फाइड गैर descanned photodetectors के लाल उत्सर्जन को इकट्ठा करने के लिए हरी उत्सर्जन, और 625 इकट्ठा करने के लिए 750 की तैयारी में हैं. ब्लू उत्सर्जन (जैसे परमाणु दाग ​​Hoechst 33342) के रूप में 750-800 के बीच एक सेटिंग के साथ एक मानक nondescanned multialkaline डिटेक्टर का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं.
  6. बोमन अंतरिक्ष के भीतर कम तीव्रता के उत्सर्जन में समुचित संग्रह आश्वासन, डिटेक्टरों की निचली सीमा इन मूल्यों को छोड़ने के लिए नहीं के रूप में तो स्थापित कर रहे हैं सुनिश्चित करें. दृश्य चेतावनी मार्कर संकेत जाएगा अगर संवेदनशीलतासेटिंग बहुत कम है और इन मूल्यों को शून्य के एक तीव्रता मूल्य दिया जा रहा है.
  7. 1 सीसी की कुल मात्रा को लाने के लिए 0.9% बाँझ खारा के साथ पतला फ्लोरोसेंट एल्बुमिन समाधान की ~ 5-8 मिलीग्राम के साथ एक 1 सीसी सिरिंज लोड.

3. Intravital के लिए एक म्यूनिख Wistar चूहा में किडनी उजागर 2 फोटॉन इमेजिंग

  1. Pentabarbitol (50 मिलीग्राम / एमएल समाधान, 120 μl/100 जी शरीर के वजन), Inactin (130 मिलीग्राम / एमएल समाधान, 120 μ/100 जी शरीर के वजन), या isofluorane (5% प्रेरण, 1.5 का उपयोग कर एक पूर्व संवेदनाहृत चूहे के साथ आरंभ ) 2.5% रखरखाव के लिए, एक निबाह शिरापरक पहुँच लाइन (या तो गले या ऊरु शिरापरक), और बायीं ओर बस ribcage के नीचे करने के लिए सिर्फ बाईं जांघ के ऊपर से काटे.
  2. इसलिए अपनी सही पक्ष पर फ्लैट चूहे रखें कि बाएं, मुंडा ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है, अपनी मुद्रा लम्बी और (चित्रा सामने पंजे एक दूसरे को छू एक दूसरे को और पीछे के पंजे को छूने के साथ, झुके नहीं के साथ यह मेज पर फ्लैट है सुनिश्चित करें 2 क). बहुत धीरे यह स्वाभाविक retroperitoneum भीतर देता है जहां निर्धारित और एक sharpie का उपयोग कर शरीर (जांघ को ribcage से) (2A चित्रा) के समानांतर एक सीधी रेखा आकर्षित करने के लिए गुर्दे महसूस करने के लिए टटोलना.
  3. दांतेदार संदंश की एक जोड़ी के साथ त्वचा उठाओ, और ऊतक को कुचलने और रक्तस्राव रोकने के लिए hemostats की एक जोड़ी का उपयोग कर तैयार की रेखा के साथ त्वचा चुटकी. शल्य कैंची की एक जोड़ी का उपयोग चीरा के साथ कट. पहले काटने के लिए बाहरी त्वचा और मांसपेशियों की परतों कुचल नाटकीय रूप से कम है और आम तौर पर खून बह रहा है को समाप्त होगा.
  4. पतली है जो बाहरी मांसपेशी परत के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
  5. पेरिटोनियम बेनकाब करेंगे जो भीतर की मांसपेशी परत में चीरा के लिए, आकार का अनुमान लगाने के गुर्दे फिर से टटोलना. गुर्दे से छोटी एक चीरा लाइन चुटकी, चीरा आश्वस्त सिर्फ गुर्दे खत्म हो गया है. यह इस चीरा बहुत छोटा है और यदि आवश्यक हो तो यह बड़ा बनाने के लिए सबसे अच्छा है. यह भी बड़ा बना दिया है, तो suturing की आवश्यकता होगी.यह पिछले चीरा महत्वपूर्ण है, बहुत दूर किसी भी दिशा में अधिक मंच पर स्थिरता को प्रभावित और प्रेरित श्वास (बेहतरीन परिदृश्य) से या तो गति कलाकृतियों या गुर्दे की डंडी और प्रतिकूल कम गुर्दे छिड़काव (सबसे खराब स्थिति) खिंचाव जाएगा.
  6. हाथ फैशन पर एक हाथ में गुर्दे के नीचे ध्रुव की दिशा में काम कर रहे हैं, गुर्दे के रूप में (चित्रा 2B में दिखाया गया है) और पकड़ संदंश का उपयोग आसपास वसा का पता लगाएँ.
  7. गुर्दे के निचले छोर तक पहुँच जाता है एक बार बहुत धीरे अमल में लाना गुर्दे नीचे फैलाएंगे, जबकि धीरे चीरा के माध्यम से गुर्दे खींच. चीरा बहुत छोटा है, मांसपेशियों की परत को कुचलने और इसे चौड़ा करने के लिए कटौती, गुर्दे अमल करने के लिए प्रक्रिया को दोहराने.

4. इमेजिंग के लिए स्टेज पर म्यूनिख Wistar चूहा रखकर

  1. गुर्दे के साथ coverslip पकवान के किनारे की ओर गुर्दे की जगह थोड़ा चूहे के पृष्ठीय (पीछे की ओर) की ओर घुमाया गुर्दे के उदर पक्ष तो मैंएस coverslip के नीचे पकवान (चित्रा 1 ए) के साथ संपर्क कर रही है. डिश के लिए एक गर्म, बाँझ 09.% खारा समाधान जोड़ें.
  2. 10x या 20x उद्देश्य के माध्यम से देखो और गति के लिए जाँच करें. प्रस्ताव मिला है तो छाती दूर दूर coverslip के नीचे पकवान से है तो, थोड़ा अधिक चूहे रोल, गुर्दे के रूप में गुर्दे की डंडी (चित्रा 1 बी) खींचने के बिना पकवान के किनारे के करीब है सुनिश्चित करें.

5. Albumin के गुर्दे पारगम्यता यों छवियाँ हासिल

  1. केशिकागुच्छीय पारगम्यता (Glomeruluar sieving गुणांक, GSC) की गणना के किसी भी macromolecule की पूर्व फ्लोरोसेंट अणु के अर्क को व्यक्तिगत glomeruli के संदर्भ पृष्ठभूमि छवियों को लेने की आवश्यकता होगी. अपने खुर्दबीन अंकन स्थानों में सक्षम एक motorized मंच से सुसज्जित है, तो पाते हैं और कम शक्ति उद्देश्य का उपयोग केंद्र व्यक्ति ग्लोमेरुली और प्रत्येक स्थान चिह्नित. एक दोहरी पास Fluorescein / Rhodamine epifluorescence filया तो उत्सर्जन फिल्टर (चरण विपरीत या रोशनी की अन्य गैर प्रतिदीप्ति सूत्रों काम नहीं करेगा) काम करेंगे, हालांकि आतंकवाद से इस प्रक्रिया के लिए आदर्श है. Glomeruli दोहरी पास फिल्टर के माध्यम से देखा है जब एक अंतर्निहित पीला, नारंगी autoflourescence होने समीपस्थ नलिकाओं से घिरे खाली परिपत्र संरचनाओं के रूप में दिखाई देगा.
  2. आपके खुर्दबीन एक motorized मंच नहीं है, कम शक्ति के उद्देश्य से एक रेखापुंज पैटर्न में गुर्दे स्कैन और व्यक्तिगत glomeruli स्थित हैं जहां के एक अल्पविकसित नक्शा बनाने, जैसे गुर्दे कैप्सूल ऊपर स्थित बड़ी सतही रक्त वाहिकाओं के रूप में प्राकृतिक स्थलों पर भरोसा या वसा पैच.
  3. उच्च शक्ति पानी विसर्जन उद्देश्य के लिए बुर्ज स्विच और केशिका छोरों और बोमन अंतरिक्ष स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं सुनिश्चित करते हुए प्रत्येक ग्लोमेरुली की 3 डी डेटा सेट ले. एक pseudocolor पैलेट (बी / डब्ल्यू के अलावा अन्य कुछ) का उपयोग कर इन संरचनाओं कल्पना करने में मदद मिलेगी.
  4. एक सतही रक्त वाहिनियों पर ध्यान केंद्रित धीरे टी में पानी में डालनावह फ्लोरोसेंट एल्बुमिन बनाने यकीन है कि समय प्रणालीगत वितरण के लिए अनुमति देने के लिए दिया जाता है. कम GSC साथ अणुओं के लिए यह प्लाज्मा में तीव्रता मूल्यों को अधिकतम करने के लिए, लेकिन माइक्रोस्कोप में फोटो डिटेक्टरों तर जाएगा कि के स्तर तक पहुँचने के लिए आवश्यक नहीं है. इस फ़िल्टर की अणुओं की detectability बढ़ जाती है. नोट: यह (1 फ्रेम / सेकंड ~ पर पूर्ण फ्रेम प्राप्त) स्क्रीन पर दिखाई देता है फ्लोरोसेंट एल्बुमिन समय के लिए पेश किया जाता है समय के बीच एक 5-7 सेकंड चूक आम तौर पर वहाँ है.
  5. लगभग 10 मिनट के लिए किसी भी संभावित छोटे आणविक वजन टुकड़े एल्बुमिन GSC की गणना में इस्तेमाल किया जाएगा 1 माइक्रोन अंतराल पर 3 डी संस्करणों को प्राप्त करने से पहले खाली करने के लिए अनुमति देने के लिए अनुमति दें. आमतौर पर, म्यूनिख Wistar चूहों की Simonsen का तनाव अब तक कम सतह ग्लोमेरुली है, कल्पना की जा सकती है कि सभी imaged और मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. हम ~ 10 के लिए मात्रा निर्धारित संख्या की सीमा तो Frömter तनाव एक तक अधिक से अधिक संख्या है.
  6. अध्ययन के अंत में चूहे anesthet की अधिक मात्रा के माध्यम से euthanized हैआईसी अध्ययन में इस्तेमाल किया. एक दोहरी pneumothoracotamy इच्छामृत्यु बीमा करने के लिए किया जाता है.

6. 3 डी संस्करणों से फ्लोरोसेंट Albumin लिए GSC गिना जा रहा है

  1. Metamorph इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर का प्रयोग पृष्ठभूमि दोनों सेट, प्रत्येक ग्लोमेरुली के लिए 3 डी सेट डेटा लोड और फ्लोरोसेंट एल्बुमिन के निषेचन के बाद लिया सेट.
  2. इसके परिभाषित मार्जिन और बोमन कैप्सूल के किनारे के बीच पर्याप्त जगह खाली जगह के साथ एक सतही केशिका पाश का पता लगाने फ्लोरोसेंट एल्बुमिन युक्त मात्रा में.
  3. पृष्ठभूमि मात्रा में एल्बुमिन युक्त छवि के सभी दृश्य cues शामिल करना चाहिए जो एक ही फोकल हवाई जहाज़ का पता लगाने. ब्याज की केशिका पाश के भीतर एक क्षेत्र का चयन करें और औसत तीव्रता पढ़ने ध्यान दें. अगला बोमन अंतरिक्ष के भीतर एक क्षेत्र का चयन करें और औसत तीव्रता पढ़ने ध्यान दें. ये पृष्ठभूमि मूल्यों के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा.
  4. Quantitation के लिए, एल्बुमिन ग में बोमन अंतरिक्ष के भीतर समान क्षेत्र का चयन करेंछवि ontaining. बोमन अंतरिक्ष में औसत तीव्रता के लिए एक औसत मूल्य लेने के लिए कम से कम दो अन्य क्षेत्रों के लिए यह करो.
  5. प्रतिभाशाली प्लाज्मा तीव्रता के साथ केशिका पाश चुने और इसके चारों ओर एक क्षेत्र आकर्षित. सीमा समारोह का उपयोग अगला, आरबीसी के घूम रहे हैं कि अंधेरे धारियाँ परहेज, घूम प्लाज्मा भीतर उज्ज्वल मूल्यों पर प्रकाश डाला. चयनित प्लाज्मा अंतरिक्ष की औसत तीव्रता मूल्यों ध्यान दें. रक्त के भीतर कारकों ही कारण है और प्लाज्मा प्रतिदीप्ति के स्तर के मूल्यवान समझना के लिए की सेवा करेंगे, क्योंकि यह अधिमान्यतया प्लाज्मा के उज्ज्वल क्षेत्रों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  6. एक माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल स्प्रेडशीट जहां GSC गणना करने के लिए मान दर्ज करें प्रयोग:

चित्रा 1

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Representative Results

चित्रा 3 एक म्यूनिख Wistar Frömter चूहा और फ्लोरोसेंट एल्बुमिन की पारगम्यता निर्धारित करने के लिए उठाए गए कदमों की एक सतह ग्लोमेर्युल्स से ली गई एक छवि का एक उदाहरण दिखाता है. 0.0111 के एल्बुमिन के लिए GSC मूल्य म्यूनिख Wistar चूहों जब खिलाया हालत में 3 की इस तनाव में देखा सीमा के भीतर इस व्यक्ति ग्लोमेर्युल्स गिरावट के लिए निकाली गई. इन चित्रों में देखा स्थिरता सावधान योजना और आंकड़े 1 और 2 में दर्शाया निर्देशों के कार्यान्वयन की वजह से है. जैसा कि पहले कहा, गुर्दे exteriorizing में इस्तेमाल चीरा की नियुक्ति के प्रस्ताव विरूपण साक्ष्य से मुक्त स्थिर छवियों के निर्माण में सबसे महत्वपूर्ण कदम है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक अभिविन्यास स्थिति की एक विस्तृत योजनाबद्धइमेजिंग के लिए पहले खुर्दबीन मंच पर चूहे की. धीरे गुर्दे coverslip के पकवान में बिछाने के साथ Repti थेर्म हीटिंग पैड पर नीचे चूहे गुर्दे की ओर (के रूप में एक में दिखाया गया है) रखना. उदर पक्ष coverslip के नीचे से छू और संपर्क आटोक्लेव टेप (एटी) के साथ किया जाता है ताकि (*) गुर्दे की बाहर की ओर रोल. प्रेरित गति से साँस लेने में कम से कम करने के लिए, छाती तुरंत coverslip के पकवान ऊपर क्षेत्र से बाहर है कि इतना (**) आगे चूहे रोल. पानी जैकेट के साथ बाँझ 0.9% खारा और कवर के साथ पकवान भरें. मलाशय के तापमान पर नजर रखने और जरूरत के रूप में पर और बंद REPI थेर्म पैड बारी करने के लिए एक थर्मामीटर का उपयोग करें. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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चित्रा 2. . पहले खुर्दबीन मंच पर नियुक्ति के लिए म्यूनिख Wistar चूहा में गुर्दे की बाह्यीकरण एक संवेदनाहृत चूहा अपने बाएं आकार के साथ रखा गया है, रिब पिंजरे और जांघ के ऊपरी हिस्से के बीच क्षेत्र (ए, भूरे रंग में दिखाया गया है) के बाल काटे. एक बार अनुक्रमिक चीरों एक में गुर्दे गुजर लाइन द्वारा दिखाया के रूप में त्वचा, बाहरी तब भीतरी मांसपेशी परत के माध्यम से कटौती करने के लिए बना रहे हैं. संबद्ध पेरी गुर्दे वसा के साथ गुर्दे (बी) दिखाई जानी चाहिए. कम सबसे ध्रुव (इ) तक पहुँच जाता है संदंश की एक जोड़ी का उपयोग, वसा एक हाथ से अधिक हाथ फैशन में pinched है. अमल में लाना वसा पर खींच रहा है, जबकि धीरे गुर्दे के तहत क्षेत्र निचोड़. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

052/50052figure3.jpg "alt =" चित्रा 3 "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" 5.5in "के लिए: src =" / files/ftp_upload/50052/50052figure3highres.jpg "/>
चित्रा 3. एक म्यूनिख Wistar चूहा की एक ग्लोमेर्युल्स दिखा 3 डी संस्करणों से लिया ही विमान छवियों. पैनलों और बी शो पृष्ठभूमि छवियों और एक काले और सफेद में albumin सीरम टेक्सास लाल चूहा (टी.आर. आरएसए) के ~ 12 मिनट पोस्ट निषेचन लिया. एक पृष्ठभूमि छवि (ए) में कमी प्रत्यक्ष केशिका छोरों की तीव्रता (सीएल) या बोमन अंतरिक्ष (BowSp) नोट. पैनल सी pseudocolor में एक बेहतर ऊतक के कम तीव्रता पृष्ठभूमि के स्तर कल्पना करने के लिए पैनल से ली गई एक क्षेत्र से पता चलता है. इधर, एक छोटे से क्षेत्र में एक केशिका पाश (अब क्षेत्र) में और फ्लोरोसेंट एल्बुमिन की निषेचन के बाद प्राप्त मूल्यों से घटाया जाना चाहिए जो पहले से मौजूद फ्लोरोसेंट तीव्रता के स्तर का अनुमान लगाने के लिए बोमन अंतरिक्ष के भीतर तैयार की है. पैनलों डी और ले रहे हैंएन पैनल बी से और pseudocolor में दिखाया गया है. बोमन अंतरिक्ष में तैयार ब्याज के तीन छोटे क्षेत्रों निस्पंदन बाधा (डी) के पार चला गया है कि फ्लोरोसेंट एल्बुमिन की औसत तीव्रता की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है. निजी क्षेत्रों के लिए औसत तीव्रता मूल्यों "दिखाएँ क्षेत्र सांख्यिकी" संवाद बॉक्स (पैनल डी ') के भीतर डाला क्षेत्र में सूचना मिली. केशिका छोरों के भीतर घूम प्लाज्मा तीव्रता मूल्यों (सीएल, पैनल में) की गणना करने के लिए एक बड़े क्षेत्र के साथ प्रतिभाशाली केशिका पाश और उज्ज्वल मूल्यों पर तैयार की है एक सीमा समारोह (एक नारंगी पिक्सल दिखाया गया है) का उपयोग करने पर प्रकाश डाला. केवल नारंगी में डाला पिक्सल की तीव्रता मूल्यों के आसपास के क्षेत्र का आकार या आकार की परवाह किए बिना सूचित किया जाएगा. पैनल ई 'केशिका छोरों के भीतर एल्बुमिन के कच्चे औसत तीव्रता मूल्यों से पता चलता है, वह है कि जाँच "तीव्रता माप के लिए इस्तेमाल थ्रेसहोल्ड" ध्यान दें बॉक्सजाँच की. पैनल एफ मूल्यों की प्रगति सही छवियों के भीतर प्राप्त कच्चे मूल्यों से घटाया जाता है जो केशिका लूप्स और बोमन अंतरिक्ष, के लिए पृष्ठभूमि मूल्यों के साथ शुरू करने के लिए छोड़ दिया फार्म से पता चलता है. आज़ादी से छान रहे हैं उन है कि, जबकि impermeant अणुओं शून्य (0) के एक मूल्य है, सही मूल्यों प्राप्त कर रहे हैं एक बार, बोमन अंतरिक्ष तीव्रता मूल्य पारगम्यता का अनुपात है जो ग्लोमेरुलर Sieving गुणांक उपज के लिए केशिका लूप तीव्रता मूल्य से विभाजित है एक (1) के एक मूल्य है. बार = 20 माइक्रोन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
4 के बाहर चित्रा. फ़िल्टर्ड फ्लोरोसेंट एल्बुमिन की तेज मुख्य रूप से होती है मुझेएन समीपस्थ नलिकाओं, एस 1 के प्रारंभिक खंड. पैनल एक प्रारंभिक टेक्सास लाल आरएसए सांस की ~ 20 मिनट पोस्ट निषेचन लिया ग्लोमेर्युल्स और S1 खंड के एक क्रॉस सेक्शन से पता चलता है. उद्घाटन बोमन अंतरिक्ष और एल्बुमिन की शौकीन चावला तेज (लाल) S1 के सेगमेंट में दिखा रहा है. पैनल बी एक ही डेटा सेट के एक उथले 20 माइक्रोन 3 डी प्रोजेक्शन से पता चलता है. पैनल सी एक कम बिजली 20x उद्देश्य लगभग 60 मिनट बाद के अर्क का उपयोग कर एक 3 डी प्रोजेक्शन से पता चलता है. पैनल में देखा ही ग्लोमेर्युल्स नोट सी (*) और अन्य समीपस्थ छोटी नली क्षेत्रों की तुलना में है कि क्षेत्र में देखा एल्बुमिन पुनर्प्राप्ति के उच्च स्तर में दिखाया गया है एक और बी. बार = 20 माइक्रोन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

यहाँ पर प्रकाश डाला कदम हम वे निम्नलिखित नुकसान को दरकिनार क्योंकि सुसंगत और सटीक पारगम्यता मूल्यों का उत्पादन होगा कि लोगों को हो क्या महसूस प्रतिनिधित्व करते हैं:

  1. छितराया: अब तरंगदैर्य फोटॉनों तितर बितर करने के लिए कम होने का खतरा है, क्योंकि एक लाल उत्सर्जन fluorophores के उपयोग के प्रकाश का अधिक कुशल संग्रह के लिए अनुमति देते हैं. या तो हरे या नीले उत्सर्जन fluorophores का उपयोग क्योंकि केशिका छोरों और बोमन अंतरिक्ष 3 से तीव्रता मूल्यों में वृद्धि की परिवर्तनशीलता के GSC में अधिक से अधिक भिन्नता का परिचय देंगे.
  2. छवि गहराई: गहरी 3 डी डेटा सेट आमतौर पर (अक्सर कुल गहराई में 30-45 माइक्रोन के बीच) एकत्र कर रहे हैं हालांकि, ऊपरी 10-15 माइक्रोन GSC और मूल्यों को निर्धारित करने के लिए सबसे उपयुक्त फोकल गहराई का प्रतिनिधित्व करते हैं. फिर गहरी गहराई के साथ संवेदनशीलता में कमी और उत्सर्जित फोटॉनों के बिखराव के कारण परिवर्तनशीलता में वृद्धि हुई है. इससे भी महत्वपूर्ण बात तथापि घ होता है कि केशिका छोरों की भीड़ हैग्लोमेर्युल्स भीतर eeper. इधर, केशिका छोरों बोमन अंतरिक्ष आसपास के बोमन कैप्सूल की बढ़त को बारीकी से धक्का दे दिया जाता है. यह अनजाने में सीधे केशिका छोरों कि चारों ओर कई podocytes में से एक से अधिक क्षेत्र का चयन करने की संभावना बढ़ जाती है. फ़िल्टर की albumin का सच, उच्च तीव्रता रिपोर्ट नहीं की जाएगी क्योंकि यह GSC के एक मूल्यवान समझना के लिए नेतृत्व करेंगे. चित्रा 3 और केशिका छोरों के किनारे और बोमन अंतरिक्ष 3 के किनारे के बीच अंतरिक्ष वर्तमान की बड़ी राशि में नोट पैनल बी और डी.
  3. नमूना: बोमन अंतरिक्ष के भीतर कई क्षेत्रों का चयन फ़िल्टर्ड एल्बुमिन के स्तर का पता लगाने का सबसे अच्छा सन्निकटन का आश्वासन दिया. यह ऐसी केशिका छोरों ऊपर 11 और 12 बजे की स्थिति के रूप में क्षेत्रों से बचने के लिए भी महत्वपूर्ण है. 3 डी की मात्रा के माध्यम से ध्यान केंद्रित बस फोकल हवाई जहाज़ से नीचे लगभग transversely पकड़ा केशिका छोरों का एक सेट का पता चलता है. इस क्षेत्र में एक झूठा ऊंचा GSC मूल्य से देना होगाफ़िल्टर्ड एल्बुमिन overestimating. इसके विपरीत, यह सबसे अच्छा फ्लोरोसेंट एल्बुमिन घूम के सच का स्तर निर्धारित करने के लिए केशिका छोरों के भीतर प्लाज्मा के प्रतिभाशाली भाग का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ इन स्तरों underestimating भी समीकरण में भाजक के मूल्य कम करके GSC और वृद्धि होगी.

इस तकनीक की मान्यता इमेजिंग एक (1) के एक GSC साथ एक स्वतंत्र रूप से फ़िल्टर्ड परिसर से होता है. इधर, लगातार एल्बुमिन पारगम्यता overestimating के लिए जिम्मेदार होने के ऑप्टिकल सीमाओं के कारण एल्बुमिन प्लाज्मा स्तर, underestimating 3 निरस्त माना जाता है कि चिंताओं. इसके अतिरिक्त, मूत्र निकासी / प्लाज्मा स्तर और micropuncture intravital 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी सही ढंग से फ्लोरोसेंट अणुओं 2 की पारगम्यता का निर्धारण करने में सक्षम है साबित मापने के द्वारा प्राप्त करने के लिए लगभग समान है कि एक 70kDa dextran के लिए एक GSC मूल्य निर्धारित कर रही है. अंत में, की क्षमता तेजी वें कल्पना करने के लिएई ग्लोमेर्युल्स और संकल्प के एक उच्च डिग्री, 2 फोटॉन माइक्रोस्कोपी खड़ा विशिष्ट protienuria और अन्नसारमेह का निर्धारण करने में glomerular निस्पंदन बाधा और पीटी का महत्व यों की ओर अग्रसर साथ छानना मार्ग के किनारे ट्यूबलर क्षेत्रों,.

इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल शल्य शामिल प्रक्रियाओं और मंच पर चूहे की नियुक्ति की सादगी में लाभ है, जो एक औंधा चरण के साथ एक 2 फोटॉन प्रणाली के उपयोग पर आधारित हैं. Cytometry में वर्तमान प्रोटोकॉल (2007) में डन एट अल. 7 अध्याय का उल्लेख करने के एक ईमानदार मंच के साथ एक 2 फोटॉन प्रणाली के उपयोग पर जानकारी के लिए.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

लेखकों शिरापरक पहुँच लाइनों की नियुक्ति से जुड़े सर्जिकल प्रक्रियाओं को पूरा करने के लिए डीआरएस सिल्विया बी कैम्पोस-Bilderback और जॉर्ज जे रोड्स को धन्यवाद देना चाहूंगा. उन्होंने यह भी Simonsen और Frömter उपभेदों दोनों से मिलकर म्यूनिख Wistar कालोनियों को बनाए रखने के लिए सारा ई छुड़ाना धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope Olympus America Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser Spectra-Physics Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors Hamamatsu Corp Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software Molecular Dynamics Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel Microsoft Corportation 2007 version
Handling Forceps Electron Microscopy Sciences Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors Electron Microscopy Sciences Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300 Electron Microscopy Sciences Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight) Electron Microscopy Sciences Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad Gaymar T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater ZooMed RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride Invitrogen/Molecular Probes Cat# T-353
Rat Serum Albumin Sigma Aldrich Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF Sigma Aldrich Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape Fisher Scientific Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) Electron Microscopy Sciences Cat# 70665-07

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References

  1. Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states. Kidney International. 71, 504 (2007).
  2. Russo, L. M., et al. Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 20, (3), 489 (2009).
  3. Sandoval, R. M., et al. Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats. Journal of the American Society of Nephrology. 23, (3), 447 (2012).
  4. Tojo, A., Endou, H. Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique. American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).
  5. Asgeirsson, D., et al. Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation. Acta Physiologica. 191, (3), 237 (2007).
  6. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).
  7. Dunn, K. W., et al. Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy. Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).

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