Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten

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Summary

Eine Technik, die Verwendung hochauflösende intavital 2-Photonen-Mikroskopie direkt visualisieren und quantifizieren gloemrular Filtration in Oberfläche Glomeruli. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Bestimmung der Durchlässigkeit Eigenschaften von Makromolekülen in normalen und erkrankten Staaten.

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Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. J. Vis. Exp. (74), e50052, doi:10.3791/50052 (2013).

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Abstract

Nierenerkrankungen mit Urin Verlust großer wesentlichen Makromoleküle, wie zB Serumalbumin, sind seit langem vermutlich durch Veränderungen in der Permeabilitätsbarriere podocytes umfasst, vaskuläre Endothelzellen und einer Basalmembran zusammen arbeiten verursacht werden. Daten aus unserem Labor mittels intravitaler 2-Photonen-Mikroskopie zeigte eine durchlässiger glomerulären Filtrationsrate Barriere (GFB) als bisher unter physiologischen Bedingungen haben, mit Abruf von gefilterten Albumin vorkommende in einem frühen Untergruppe von Zellen, die sogenannten proximalen Tubuluszellen (PTC) 1,2, 3.

Zurück Techniken verwendet, um Nierenfiltration studieren und zur Gründung der Charakteristik der Filtration Barriere beteiligt micropuncture des Lumen dieser frühen Rohrsegmente mit der Probenahme und Analyse Fluidgehalt 4. Diese Studien bestimmt Albumin-Konzentration in der luminalen Flüssigkeit praktisch nicht existent; entsprechend engzu dem, was in der Regel im Urin nachgewiesen. Allerdings ergab die Charakterisierung von Dextran Polymere mit definierter Größe durch diese Technik die von ähnlicher Größe wie Serumalbumin hatte höheren Ebenen in der röhrenförmigen Lumen und Urin, was darauf hindeutet, erhöhte Durchlässigkeit 5.

Hier ist eine detaillierte Beschreibung der Technik verwendet, um direkt zu visualisieren und quantifizieren glomerulären fluoreszierenden Albumindurchlässigkeit in vivo. Dieses Verfahren ermöglicht die Erkennung von gefilterten Albumin über den Filtrationsbarriere in Bowman-Raum (die erste Kammer des Urin-Filtration) und erlaubt auch die Quantifizierung von Albumin Reabsorption von proximalen Tubuli und Visualisierung der nachfolgenden Albumin Transzytose 6. Das Fehlen von fluoreszierenden Albumin entlang später Rohrsegmente auf dem Weg zu der Blase wie die Effizienz des Abrufs Weg in den früheren proximalen Tubulus-Segmente. Darüber hinaus, um, wenn diese Technik angewendet wurde, bestimmen Permeabilitätvon Dextranen mit einer ähnlichen Größe wie Albumin praktisch identisch Permeabilitäten wurden 2 angegeben. Diese Beobachtungen unterstützen direkt die Notwendigkeit, den Fokus vieler Nierenerkrankungen mit Proteinurie Krankheiten enthalten Änderungen in proximalen Tubulus Zelle Rückgewinnung erweitern.

Protocol

Ein. Konjugation von Rattenserumalbumin zu Sulfo-Rhodamin 101 Sulfonsäurechlorid (Texas Red)

  1. Man löst 100 mg Rattenserumalbumin (RSA) in 6.667 ml von 100 mM Natriumhydrogencarbonat pH 9,0; Endkonzentration 15 mg / ml in einem 50 ml konischen Röhrchen.
  2. Platz Lösung in Eis / Wasser Becherglas und kühl, zwischen 0 bis 4 ° C.
  3. In 200 ul hochwertigen wasserfreien Dimethylformamid (DMF) zu einer 10 mg-Ampulle von Texas Red Sulfonsäurechlorid (TRSC); Vortex auf Medium für 15 sek.
  4. Vortex RSA Lösung auf mittlere und fügen Sie die gelösten TRSC.
  5. Wrap 50 ml konischen in Folie (Parafilm kann verwendet werden, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten werden gebildet), statt horizontal im Eiskübel w / Eis nur und auf Wippe Lösung langsam rühren (Bildung von Blasen zu vermeiden), erlauben Reaktion bei 0 weiter bis 4 ° C für 1 Stunde.
  6. Mache 5 L von 0,9% iger Kochsalzlösung, und befeuchten Sie ein 50 kDa Molekulargewicht off Kammer geschnitten, die entweder a) Dialysemembran mit Clips sein kann, b) dialysis-Schlauchmaterial nach einem Schwimmer-a-analysator, oder c) Slide-a-lysator Kassette (alle geeignet für die Entfernung unkonjugierten TRSC).
  7. Platz Reaktionsmischung im Dialysekammer und Platz in der 5 L Kanister w / der 0,9% iger Kochsalzlösung, Dialyse über Nacht bei 4 ° C mit einem leichtem Rühren mit einem Rührstab.
  8. Ändern Sie den 5 L Dialysierlösung morgens und am späten Nachmittag bis eine Inkubation über Nacht Ergebnisse in praktisch keiner Farbänderung (Dies dauert in der Regel 48 ~ hr mit mindestens 4 Austausch). Zusätzlich mit der MWCO von 50 kDa, so nah an der MW von RSA, 66 kDa, es ist möglich, niemals eine klare Lösung, dies hängt von der Verteilung der Porengröße der Membran; 60 Stunden und 5 Austausch ist mehr als ausreichend Zeit.
  9. Measure Volumen und teilen die Einwaage von 100 mg von der Lautstärke auf ungefähre Konzentration von TR-RSA geben, in der Regel Konzentrationen reichen von 10 bis 13 mg / ml. Die endgültige Farbstoff: Albumin-Verhältnis sollte ~ 4:1 1 Fluorophor je 15,00 sein0 Dalton Protein MW. Lagerung bei 4 ° C; NIE frieren die TR-RSA-Lösung, wie sie sich die Fragmentierung, die auftreten können Permeabilitätswerte verändern wird.

2. Vorbereiten des Inverses Mikroskop Bühne Imaging / Microscope Einstellungen

  1. Platz ~ 4-7 Stücke Autoklavenband (etwa ¾ "long) perfekt übereinander in einem 50-mm-Schale mit 40 mm Deckglas Boden (Deckglas unteren Schale) gestapelt. Diese sollten näher zu einem der Ränder angeordnet werden, so dass die Rand des Bandes wird mit dem Rand der Krümmung der Niere zu machen, aber nicht blockieren Ziel Lichtweg (1A und 1B), größere Ratten mehr Raum zwischen dem Band und der Rand Schale erfordern.
  2. Platz 2 Repti-therm Pads neben der Bühne neben dem 50 mm-Schale (Abbildung 1A). Legen Sie eine Erwärmung Wassermantel Decke über der Bühne.
  3. Maximieren Sie die Effizienz beim Erfassen von Bildern durch die Gewährleistung der Objektivrevolver hat eine 10x Luft or 20x (Luft oder Wasser Immersion) und eine höhere angetriebene Wasserimmersionsobjektiv, um Bilder für die Quantifizierung zu sammeln.
  4. Bei der Bebilderung der effizienteste Weg, um Wasser zu den Zielen hinzuzufügen ist, um sie zur Seite drehen und Wasser unter Verwendung einer 1 ml-Spritze mit einem langen Stück PE-200 Rohr, das die Spitze der Ziele erreichen kann.
  5. Stellen Sie die Intensität der Anregung 10watt Laser zu ~ 15-20% mit den Graufilter auf der Software. Die Gallium-Arsenid-Phosphid nichtdescannten Photodetektoren auf 750 eingestellt, um grün-Emissionen und 625 sammeln, um rot-Emissionen zu sammeln. Blau-Emission (wie Nuklearfarbstoff Hoechst 33342) gesammelt unter Verwendung eines Standard-non descanned multialkaline Detektor mit einem Wert zwischen 750-800.
  6. Um die korrekte Erhebung der geringen Intensität Emissionen innerhalb der Bowman-Raum zu gewährleisten, stellen Sie sicher, die unteren Grenzen der Detektoren so eingestellt sind, wie diese Werte nicht zu auszuschließen. Visuelle Warnung Marker zeigt an, ob die Empfindlichkeitist zu niedrig, und diese Werte werden eine Intensität von Null gegeben.
  7. Legen Sie eine 1-ml-Spritze mit ~ 5-8 mg des fluoreszierenden Albumin-Lösung mit 0,9% steriler Kochsalzlösung verdünnt, um das Gesamtvolumen auf 1 cc.

3. Freilegen der Nieren in einer Münchner Wistar Ratte für Intravital 2-Photon Imaging

  1. Beginnen Sie mit einem Pre-narkotisierten Ratten mit Pentabarbitol (50 mg / ml Lösung, 120 μl/100 g Körpergewicht), Inactin (130 mg / ml Lösung, 120 μ/100 g Körpergewicht) oder Isofluran (5% Induktion, 1.5 auf 2,5% Wartung), eine innewohnende venösen Zugang Linie (entweder Vena femoralis oder venöse) und die linke Flanke von knapp unterhalb des Brustkorbs bis knapp über den linken Oberschenkel rasiert.
  2. Legen Sie die Ratte flach auf der rechten Seite, so dass die linke, rasiert Seite nach oben; sicherzustellen, dass es flach auf dem Tisch, mit seiner Haltung länglich und nicht geduckt, mit den Vorderpfoten berühren einander und hinteren Pfoten berühren einander (Abbildung 2A). Sehr vorsichtig abtasten, um die Niere zu bestimmen, wo sie legt natürlich im Retroperitoneum und zeichnen Sie eine gerade Linie parallel zum Körper (vom Brustkorb bis zum Oberschenkel) mit einem Sharpie (2A) fühlen.
  3. Pick-up die Haut mit einem Paar Hakenpinzette, und nehmen Sie die Haut entlang der gezeichneten Linie mit einem Paar hemostats, um das Gewebe zu vernichten und zu verhindern, Blutungen. Schneiden Sie entlang der Schnitt mit einem Paar chirurgische Schere. Zerkleinern der Außenhaut und die Muskelschichten vor dem Schneiden wird drastisch reduziert und in der Regel beseitigt Blutungen.
  4. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die äußere Muskelschicht, die dünn ist.
  5. Für den Einschnitt in das innere Muskelschicht, die das Bauchfell freilegt, re-tasten die Niere zu schätzen. Pinch einen Einschnitt Linie kleiner als der Niere; Sicherstellung der Schnitt ist nur über die Niere. Es ist am besten, um diesen Schnitt zu klein und es bei Bedarf vergrößert. Wenn dies wird zu groß, wird Naht erforderlich.Dieser letzte Schnitt ist kritisch, zu weit in jede Richtung über die Stabilität auf der Bühne beeinflussen und induzieren entweder Bewegungsartefakte von der Atmung (best case-Szenario) oder die Nieren Stiel und negativ die renale Perfusion (worst case scenario) dehnen.
  6. Suchen Sie die Niere (wie in 2B gezeigt) und Griff die umliegende Fett mit einer Pinzette, arbeiten in Richtung der unteren Pol der Niere in der Hand über Hand-Mode.
  7. Sobald die unteren Pol der Niere erreicht ist, ziehen die Niere durch den Einschnitt zwar sehr leicht zusammendrücken unterhalb der Niere zu exteriorisieren. Wenn der Schnitt ist zu klein, zerdrücken die Muskelschicht und geschnitten, um es zu erweitern, wiederholen Sie den Vorgang, um Nieren exteriorisieren.

4. Platzieren des München Wistar Ratte auf der Bühne für Imaging

  1. Zeigen die Niere zum Rand des Deckglases Schale mit der Niere leicht gedreht in Richtung der dorsalen (Rückseite) der Ratte so der Bauchseite der Niere is in Kontakt mit der unteren Schale Deckglas (Abbildung 1A). Fügen Sie einen erwärmten, sterile 09.% Iger Kochsalzlösung in die Schale.
  2. Schauen Sie durch den 10x oder 20x-Objektiv und überprüfen Sie die Bewegung. Wenn eine Bewegung erkannt wird, rollen die Ratte über etwas so der Brustkorb ist weit weg von dem Deckglas unteren Schale, sicherzustellen, dass die Niere ist wie an den Rand der Schale zu schließen, ohne Dehnung der renalen Stiel (Abbildung 1B).

5. Aufnehmen von Bildern zu Renal Permeabilität von Albumin Quantify

  1. Berechnung der glomerulären Permeabilität (Glomeruluar Siebkoeffizienten; GSC) jeder Makromolekül erfordern unter Bezugnahme Hintergrund Bilder der einzelnen Glomeruli vor der Infusion des fluoreszierenden Moleküls. Wenn Ihr Mikroskop mit einem motorisierten Bühne fähig Kennzeichnung Standorte ausgestattet ist, finden und in der Mitte einzelne Glomeruli mit der unteren angetriebenen Ziel und markieren jeden Standort. Ein Dual-Pass Fluorescein / Rhodamin Epifluoreszenz filter ist ideal für dieses Verfahren zwar entweder Emission Filter funktionieren wird (Phasenkontrast oder andere Nicht-Fluoreszenz-Lichtquellen, wird nicht funktionieren). Glomeruli wird als leere kreisförmige Strukturen von proximalen Tubuli mit einer inhärenten gelb-orange autoflourescence wenn durch die Dual Tiefpassfilter angesehen umgeben erscheinen.
  2. Wenn Ihr Mikroskop keinen motorisierten Tisch, scannen die Niere in einem Raster-Muster mit der Low-Power-Ziel und eine rudimentäre Karte, wo die einzelnen Glomeruli befinden; sich auf die natürlichen Sehenswürdigkeiten wie große oberflächliche Blutgefäße oberhalb der Nierenkapsel entfernt Fett oder Patches.
  3. Schalten Sie den Revolver an die höhere Macht Wasserimmersionsobjektiv und nehmen 3D-Datensätze der einzelnen Glomeruli sicherstellen, dass die Kapillarschlingen und Bowman-Raum sind deutlich sichtbar. Mit einem Pseudo-Palette (etwas anderes als B / W) wird dazu beitragen, diese Strukturen zu visualisieren.
  4. Fokussierung in auf einer oberflächlichen Blutgefäße langsam in t ziehener fluoreszierende Albumin dafür, dass Zeit gegeben wird, um für die systemische Verteilung zu ermöglichen. Bei Substanzen mit niedrigem GSC ist es wichtig, die Intensitätswerte in dem Plasma zu maximieren, jedoch nicht auf ein Niveau, das die Photodetektoren in dem Mikroskop zu erreichen sättigen. Dies erhöht Nachweisbarkeit filtriert Moleküle. Hinweis: Es ist in der Regel ein 5-7 sec Ablauf zwischen dem Zeitpunkt der fluoreszierenden Albumin zur Zeit eingeführt wird, erscheint es auf dem Bildschirm (Erwerb Vollbilder bei ~ 1 Bild / Sekunde).
  5. Lassen Sie ca. 10 min, um eventuelle kleine Molekulargewicht Fragmente vor dem Erwerb 3D-Volumen bei 1 &mgr; m-Abständen zur Berechnung Albumin GSC verwendet werden löschen. Typischerweise wird die Simonsen Stamm von München Wistarratten weit weniger Oberfläche Glomeruli hat, so dass alle, die visualisiert werden kann abgebildet und quantifiziert werden. Die Frömter Stamm weist eine weitaus größere Zahl, so dass wir die Zahl quantifiziert, um ~ 10 zu begrenzen.
  6. Am Ende der Studie wurde die Ratte ist über eine Überdosis des anesthet euthanasiertic verwendet in der Studie. Ein Dual pneumothoracotamy wird durchgeführt, um Sterbehilfe zu versichern.

6. Berechnung GSC für Leuchtstofflampen Albumin aus 3D-Volumes

  1. Mit Metamorph Bildverarbeitungssoftware laden Sie die 3D-Datensätze für die einzelnen Glomeruli, sowohl die Hintergrund-Set und Set genommen nach der Infusion des fluoreszierenden Albumin.
  2. In dem Band mit dem fluoreszierenden Albumin suchen eine oberflächliche Capillarschlinge mit genügend Platz leeren Raum zwischen den definierten Rändern und dem Rand der Bowman-Kapsel.
  3. Im Hintergrund das gleiche Volumen lokalisieren Brennebene, die alle visuellen Hinweisen der eiweißhaltigen Bild enthalten sollte. Wählen Sie eine Region innerhalb des Capillarschlinge von Interesse und beachten Sie die durchschnittliche Intensität Lesen. Weiter wählen Sie eine Region innerhalb der Bowman-Raum und notieren Sie die durchschnittliche Intensität Lesen. Diese werden als Hintergrund-Werte verwendet werden.
  4. Zur Quantifizierung, wählen Sie das ähnlich Region innerhalb der Bowman-Raum in der Albumin-containing Bild. Tun Sie dies für mindestens zwei anderen Regionen, um einen Durchschnittswert für die durchschnittliche Intensität innerhalb Bowman-Raum zu nehmen.
  5. Wählen Sie die Capillarschlinge mit dem hellsten Plasma Intensität und zeichnen Sie eine Region um ihn herum. Weiter mit dem Schwellenwert-Funktion, markieren die hellen Werte innerhalb des zirkulierenden Plasma, die Vermeidung der dunkle Streifen, die zirkulierenden RBC werden. Beachten Sie die durchschnittliche Intensität Werte des ausgewählten Plasma Raum. Es ist wichtig, bevorzugt aus den hellen Bereichen des Plasmas, weil Faktoren im Blut nur dazu dient, um zu bewirken, und Unterschätzung der Plasma Fluoreszenz Ebenen.
  6. Mit einem Microsoft Excel-Tabelle die Werte, um die GSC wo berechnen:

Abbildung 1

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Representative Results

Abbildung 3 zeigt ein Beispiel eines Bildes von einer Oberfläche eines Glomerulus München Wistar Frömter Ratte und welche Schritte unternommen wurden, um die Durchlässigkeit von fluoreszierenden Albumin bestimmen gemacht. Der GSC Wert für Albumin von 0,0111 für diese einzelnen Glomerulus fallen in den Bereich in dieser Sorte von München Wistar Ratten, wenn in der Fed Zustand 3 gesehen abgeleitet. Die Stabilität in diesen Bildern zu sehen ist auf die sorgfältige Planung und Ausführung von Befehlen in den Abbildungen 1 und 2 dargestellt. Wie bereits erwähnt, ist die Platzierung des Einschnitts in exteriorisieren die Niere verwendet der wichtigste Schritt in der Herstellung von stabilen Bildern, die frei von Bewegungsartefakten.

Abbildung 1
Abbildung 1. Ein detailliertes schematisches Positionieren einer Orientierungder Ratte am Mikroskop Bühne vor der Bildgebung. Gently lag der Rattennieren Seite nach unten (wie in A gezeigt) über die Repti Therm-Heizkissen mit der Niere die Verlegung in das Deckglas Gericht. Rollen Sie die Niere nach außen (*), so dass der Bauchseite das Deckglas Boden berührt und Kontakt mit dem Autoklaven Band (AT) gemacht. Zur Minimierung der Atmung induzierte Bewegung, rollen die Ratte vor (**), so dass der Brustkorb heraus ist der Bereich unmittelbar über dem Deckglas Gericht. Füllen Sie die Schale mit steriler 0,9% iger Kochsalzlösung und mit Wasser bedecken Jacke. Verwenden Sie ein Thermometer zur rektalen Temperatur zu überwachen und drehen Sie die Repi-Therm-Pads ein-und ausschalten, wie gebraucht. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Abbildung 2. . Exteriorisation der Niere in München Wistar Ratte vor der Platzierung auf Mikroskoptisches Ein narkotisierten Ratte wird mit dem linken Größe bis platziert; Bereich zwischen dem Brustkorb und Oberschenkel rasiert (grau dargestellt, A). Sobald sequentiellen Einschnitte vorgenommen werden, durch die Haut, äußeren dann innere Muskelschicht geschnitten, wie durch die Linie Durchlaufen der Niere in A gezeigt. Die Niere mit zugehörigen Nierenkapsel Fett sichtbar sein (B). Unter Verwendung einer Pinzette wird das Fett eingeklemmt in einer Hand-over-Hand-Mode, bis die unterste Stange erreicht wird (BE). Drücken Sie vorsichtig die Fläche unter der Niere beim Ziehen auf das Fett zu exteriorisieren. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Abbildung 3. Eine Ebene Bilder von 3D-Volumen, die einen Glomerulus eines Münchner Wistar Ratte gemacht. Panels A & B Show Hintergrund-Bilder und eine gemacht ~ 12 min nach Infusion von Texas Red Rat Serum Albumin (TR-RSA) in schwarz und weiß. Beachten Sie die fehlende erkennbare Intensität Kapillarschlingen (CL) oder Bowman-Raum (BowSp) im Hintergrund Bild (A). Tafel C zeigt einen Bereich von der Platte genommen A in Pseudocolor besser visualisieren die niedrige Intensität Hintergrundbelastung von Gewebe. Hier wird ein kleiner Bereich in einer Kapillare Schleife (mehr Region) und in der Bowman-Raum zu dem bereits bestehenden Fluoreszenzintensität Ebenen, die von den Werten nach der Infusion von fluoreszierenden Albumin subtrahiert werden muss, gezeichnet worden. Panels D und E sind zu nehmenn von der Platte B und in Pseudocolor gezeigt. Drei kleine Bereiche von Interesse in die Bowman-Raum erstellt werden, um die durchschnittliche Intensität des Fluoreszenzlichts Albumin, die über die Filtration Barriere (D) bewegt hat berechnen. Mittlere Intensität Werte für die einzelnen Regionen wurden in den markierten Bereich innerhalb der "Show Region Statistics" Dialogfeld (Panel D ') berichtet. Um die im Blutplasma Intensität Werte innerhalb Kapillarschlingen (CL, in Panel E) berechnen eine große Region wird über die hellsten Capillarschlinge und der hellen Werte entlang gezogen das markierte mit einem Schwellwert-Funktion (siehe einem Orange Pixel). Nur die Intensität der Pixel in orange hervorgehoben wird, unabhängig von der Form oder Größe der umliegenden Region gemeldet werden. Panel-E 'zeigt die rohen durchschnittliche Intensität Werte der Albumin innerhalb der Kapillarschlingen; beachten geprüft "Use Schwelle für Intensity Measurements" Box, die istüberprüft. Panel F zeigt den Verlauf der Werte nach rechts beginnend mit den Hintergrund-Werte für die Kapillar-Loops und Bowman-Raum, der von der Rohdaten in den Bildern subtrahiert werden Form belassen. Ist die korrigierte Werte abgeleitet werden, wird die Bowman-Raum Intensitätswert der Capillarschlinge Intensitätswert der glomerulären Siebkoeffizienten, die ein Verhältnis von Durchlässigkeit zu ergeben unterteilt; impermeant Moleküle einen Wert von Null (0), während solche, die frei sind gefiltert einen Wert von eins (1). Bar = 20 um. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 4
Abbildung 4. Die Aufnahme von fluoreszierenden gefiltert Albumin tritt vorwiegend in den frühen Segment der proximalen Tubuli, die S1. Panel A zeigt einen Querschnitt aus einem Glomerulus und S1-Segment gemacht ~ 20 min nach der Infusion der anfänglichen Texas Red RSA Bolus. Die Eröffnung der Bowman-Raum und begeisterte Aufnahme des Albumin (rot) zeigen in der S1-Segment. Tafel B zeigt eine flache 20 um 3D-Projektion des gleichen Datensatzes. Tafel C zeigt eine 3D-Projektion mit einer geringeren Leistung 20x-Objektiv etwa 60 min nach der Infusion. Beachten Sie die gleichen Glomerulus in Platten gesehen A & B in C (*) und den höheren Ebenen von Albumin Retrieval in diesem Segment im Vergleich zu anderen Segmenten gesehen proximalen Tubulus gezeigt. Bar = 20 um. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

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Discussion

Die Schritte hervorgehoben hier darstellen, was wir diejenigen, die eine konsistente und genaue Durchlässigkeit Werte erzeugen wird, weil sie die folgenden Fallstricke zu umgehen fühlen:

  1. Streuung: Die Verwendung eines roten emittierende Fluorophore ermöglichen eine effizientere Sammlung von Leichtverpackungen seit längerer Wellenlänge Photonen weniger anfällig zu streuen sind. Mit entweder grün oder blau emittierende Fluorophore einführen größere Variation in der GSC wegen der erhöhten Variabilität der Intensität Werte aus den Kapillarschlingen und Bowman-Platz 3.
  2. Bild Tiefe: Obwohl tiefe 3D-Datensätze sind in der Regel gesammelt (oft zwischen 30-45 Mikron insgesamt Tiefe); die oberen 10-15 Mikron stellen die am besten geeigneten Fokustiefen zu GSC Werte zu bestimmen. Wieder mit tieferen Tiefen kommt eine Abnahme der Empfindlichkeit und eine Erhöhung der Variabilität aufgrund der Streuung der emittierten Photonen. Noch wichtiger ist jedoch die Verdrängung von Kapillarschlingen die d tritteeper innerhalb der Glomeruli. Hier werden Kapillarschlingen bis dicht an den Rand der Bowman-Kapsel umgebenden Bowman Raum geschoben. Dies erhöht die Chancen von versehentlich Auswählen eines Bereichs direkt über einem der zahlreichen Podozyten, die Kapillarschlingen umgeben. Dies führt zu einer Unterschätzung des GSC führen, weil die wahre, höhere Intensität des gefilterten Albumin nicht gemeldet werden. Beschriftungsfeld, B und D in Fig. 3 und die große Menge an Raum zwischen dem Rand der Kapillarschlingen und dem Rand der Bowman-Raum 3.
  3. Sampling: Auswahl mehrerer Regionen innerhalb Bowman Raum sichert die beste Annäherung der Erfassung gefiltert Albumin Ebenen. Es ist auch wichtig, um Bereiche wie die 11 und 12-Uhr-Position oberhalb der Kapillare Schleifen zu vermeiden. Fokussierung durch das 3D-Volumen zeigt eine Reihe von Kapillarschlingen gefangen fast quer unterhalb der Bildebene. Dieser Bereich würde ein falsch erhöhten Wert von GSCÜberschätzung der gefilterten Albumin. Umgekehrt ist es wichtig, die hellste Teil des Plasmas innerhalb Kapillarschlingen wählen am besten bestimmen, die tatsächlichen Mengen an zirkulierendem fluoreszierende Albumin. Hier unterschätzen diese Levels erhöht auch GSC durch die Verringerung der Wert des Nenners in der Gleichung.

Validierung dieser Technik erfolgt durch Abbilden einer frei filtriert Verbindung mit einem GSC von einem (1). Hier Bedenken, dass konsequent unterschätzen Albumin im Plasma, aufgrund der optischen Einschränkungen verantwortlich für überschätzt Albumindurchlässigkeit sind 3 aufgehoben. Zusätzlich mit einem GSC-Wert für eine 70kDa Dextran, die praktisch identisch mit dem durch die Messung Urin Freiraum / Plasmaspiegel und micropuncture beweisen intravital 2-Photonen-Mikroskopie ist in der Lage korrekt Bestimmung der Durchlässigkeit von fluoreszierenden Makromoleküle 2 erhalten wird bestimmt. Schließlich ist die Fähigkeit, schnell zu visualisieren the Glomerulus und röhrenförmigen Segmente entlang dem Filtrat Weg, mit einem hohen Grad an Auflösung, 2-Photonen-Mikroskopie steht einzigartigen Position, um die Bedeutung der glomerulären Filtrationsrate Barriere und PT bei der Bestimmung protienuria und Albuminurie quantifizieren.

Die hierin beschriebenen Protokolle basieren auf der Verwendung eines 2-Photon mit inverser Phase, die Vorteile hat in der Einfachheit der Operationen beteiligt und Ratte Platzierung auf der Bühne basiert. Informationen zur Verwendung eines 2-Photonen-System mit einem aufrechten Bühne finden Sie im Kapitel von Dunn et al. 7 in Current Protocols in Durchflusszytometrie (2007).

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich bei Dr. Silvia B Campos-Bilderback und George J Rhodes für den Abschluss chirurgische Verfahren, die Platzierung von venösen Zugang Linien danken. Sie möchte auch Sara E Wean für die Aufrechterhaltung der Munich-Wistar Kolonien, bestehend aus den beiden Simonsen und Frömter Stämme danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope Olympus America Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90
Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser Spectra-Physics Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm
Gallium arsenide phosphide photodetectors Hamamatsu Corp Note: Front or Side mounted configurations available.
Metamorph Image processing Software Molecular Dynamics Note: Version 6.1r1
Microsoft Excel Microsoft Corportation 2007 version
Handling Forceps Electron Microscopy Sciences Cat# 78266-04
Mayo Dissecting Scissors Electron Microscopy Sciences Cat# 72962
CA Micro scissors Model 1C300 Electron Microscopy Sciences Cat# 78180-1C3
Kelly Hemostatic Forceps (straight) Electron Microscopy Sciences Cat# 72930
Water Jacket Blanket + Heating Pad Gaymar T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC
Repti-Therm Under Tank Heater ZooMed RH-4
Texas Red Sulfonyl Chloride Invitrogen/Molecular Probes Cat# T-353
Rat Serum Albumin Sigma Aldrich Cat# A-6272
High Quality Anhydrous DMF Sigma Aldrich Cat# 270547
Strate-Line Autoclave Tape Fisher Scientific Cat# 11-889-1
Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip) Electron Microscopy Sciences Cat# 70665-07

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Russo, L. M., et al. The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states. Kidney International. 71, 504 (2007).
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  6. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy. Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).
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