جيل من العضلية الإنسان: البروتوكول التمايز من خالية من الطاعم المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

الخلايا الجذعية المحفزة، إما خلايا الجنينية الجذعية المحفزة أو المستحثة (آي بي إس)، تشكل مصدرا قيما للخلايا متمايزة الإنسان، بما في ذلك العضلية. هنا، سوف نركز على الاستقراء القلب من خلايا الجذع، والتي تبين كيفية استخدامها للحصول العضلية الإنسان وظيفية من خلال بروتوكول مضغي الشكل القائم على الجثث.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Di Pasquale, E., Song, B., Condorelli, G. Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (76), e50429, doi:10.3791/50429 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

من أجل التحقيق في الأحداث التي وقعت القيادة القلب والتنمية لتحديد الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى أمراض عضلة القلب في البشر، فمن الضروري أولا لتوليد العضلية الإنسان وظيفية (CMS). ومن شأن استخدام هذه الخلايا في اكتشاف المخدرات ودراسات علم السموم تكون أيضا مفيدة للغاية، مما يسمح للجزيئات الدوائية جديدة لعلاج اضطرابات القلب يمكن التحقق من صحة ما قبل سريريا على خلايا المنشأ البشرية. من المصادر المحتملة للCMS، الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (آي بي إس) هي من بين الأكثر واعدة، لأنها يمكن أن تستمد مباشرة من الأنسجة للمريض في متناول الجميع وتكون لديها قدرة ذاتية تثير جميع أنواع الخلايا في الجسم 1. وقد اقترحت عدة طرق للتمييز بين خلايا الجذع في CMS، بدءا من الهيئات مضغي الشكل الكلاسيكي (EBS) نهج التجميع إلى بروتوكولات محددة الصفات كيميائيا 2،3. في هذه المقالة نقترح بروتوكول المستندة EBS، وتظهر كيف أن هذا methoويمكن استخدام D لتوليد بكفاءة وظيفية CM-مثل خلايا من خلايا الجذع خالية من وحدة التغذية.

Introduction

تاريخيا، وقد استند التحقيق في الآليات الجينية والجزيئية القيادة التنمية البشرية ومرض على توليد النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا. ومع ذلك، تفشل العديد من الظواهر البشرية لتكراره بنجاح في الفئران، وذلك أساسا بسبب الاختلافات البيولوجية القائمة بين هذين النوعين. من ناحية أخرى، والوصول إلى الأنسجة البشرية قد تكون محدودة وغالبا لا تسمح ما يكفي من المواد التي يمكن الحصول عليها لإجراء دراسات تجريبية متعمقة. مجال البيولوجيا القلب والأوعية الدموية يعاني من كل هذه القيود: علم وظائف الأعضاء من قلب الإنسان يختلف كثيرا عن أن من الفأرة، وكمية كبيرة من أنسجة القلب يمكن الوصول إليها إلا بعد الوفاة أو أثناء عملية جراحية في القلب. العثور على مصدر الأمثل للتمايز وظيفي الإنسان مضادة وبالتالي تصبح موضوعا مركزيا في علم الأحياء القلب والأوعية الدموية، وأحرز الكثير من الجهد لمعالجة هذه المسألة. وقد اقترحت أنواع الخلايا المختلفة، وأناالتسبب myoblasts الهيكل العظمي والخلايا الجذعية المحلية القلب، العظام والخلايا وحيدات النوى نخاع، أسلاف البطانية، والخلايا الجذعية الوسيطة. ومع ذلك، الحصول على بيانات باستخدام هذه الخلايا لم تكن متسقة 4.

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESC) أولا (5) واكتشاف حجر الأساس لمشروع يسببها الجذعية (آي بي إس) الخلايا المحفزة بواسطة ياماناكا وطومسون 6،7 بدا في وقت لاحق لتقديم الحلول: هذه الخلايا لها القدرة على النمو إلى أجل غير مسمى والقدرة على إعطاء ترتفع إلى جميع مشتقات الخلية من الطبقات الجرثومية الثلاث، بما في ذلك اتفاقية الأنواع المهاجرة. استخدام خلايا الجذع يقدم المزيد من المزايا: مشتق من خلايا بالغة ذاتي، وأنها تحمل نفس الجينوم كما الفرد أو المريض من التي تشتق منها. وبالتالي يسمح بتطوير نماذج في المختبر أن تسهيل التحقيق في الأمراض وآليات التنمية الجينية البشرية. في فضيلة من هذه الخاصية، يمكن خلايا الجذع أيضا سمشاكل vercome المتعلقة الرفض المناعي والقضايا الأخلاقية 8. لهذه الأسباب، على الرغم من المجالس الاقتصادية والاجتماعية لا تزال تمثل المعيار الذهبي في مجال بيولوجيا الخلايا الجذعية، والباحثين في جميع أنحاء العالم تتجه الآن نحو مزيد من تكنولوجيا خلايا الجذع.

ويجري الآن توظيف خلايا الجذع لنموذج المرض البشري في المختبر لمختلف الظروف، بما في ذلك اضطرابات القلب والأوعية الدموية الخلقية 9،10. في الآونة الأخيرة، وقد تم تنفيذ تطبيق الجذع خلية النمذجة المرض لالأحادية الجين اضطرابات القلب (أي متلازمات QT طويلة، كاتيكولاميني متعددة الأشكال تسرع القلب البطيني) وأمراض في القلب العيوب التي هي جزء من النمط الظاهري المعقدة (مثل ليوبارد ومتلازمات تيموثي، تمدد عضلة القلب). وأكدت هذه التقارير أن الخلايا المحفزة المريض محددة أن يتم التمييز في مضادة عرض الخصائص المظهرية والوظيفية مشابهة لهذا المرض في الجسم الحي.

ومع ذلك، هناكلا تزال العديد من التحديات لتحسين فعالية تحريض خلايا الجذع في النسب القلب. جيل عفوية اتفاقية الأنواع المهاجرة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان عبر تشكيل التجميعية دعا الهيئات مضغي الشكل (EBS) أثبتت نجاح 17. منذ هذا الاكتشاف، تم اقتراح العديد من الطرق الأخرى. وقد عززت العديد من الجماعات كثيرا من كفاءة بروتوكول التمايز وانتقلوا نحو الكواشف ثقافة محددة كيميائيا وخالية من المنتجات الحيوانية (انظر التمثيل الصامت، C.، وآخرون، بحوث تداول (2012) لإجراء استعراض شامل لجميع الأساليب القائمة 3 ).

ومع ذلك، فإن الأسلوب الكلاسيكي على أساس تجميع EB لا يزال يمثل الأكثر استخداما لإجراء الدراسات الفنية والتحقيق في آليات المرض. ويستند لدينا البروتوكول المقترح على تجميع خلايا الجذع في EBS والثقافة في وجود حمض الاسكوربيك والمصل، وهو ما ثبت لتعزيز عملية تمايز القلب وصتؤثر sitively نضوج هذه الخلايا 18،19. في هذه المقالة سوف تذهب من خلال هذه المنهجية بالتفصيل وسوف تظهر كيفية استخدام خالية من تغذية خطوط الخلايا المحفزة لتوليد المريض محددة IPS-مشتقة اتفاقية الأنواع المهاجرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. صيانة خالية من الطاعم والركض من الجذع خطوط الخلايا البشرية

  1. إعداد الأطباق على Matrigel المغلفة. ذوبان الجليد قارورة واحدة من الإنسان ماتريكس ESC-المؤهلين على الجليد لمدة ساعة واحدة وتمييع في 25 مل DMEM-F12 المتوسطة. إضافة 1 مل لكل 35 مم لوحة (أو المبالغ المعادلة في المساحة بالمتر المربع إذا تم استخدام الأطباق الأخرى)، وحفظ كل شيء على الجليد والتأكد من أن جميع لوحات وأنابيب هي مرحلة ما قبل المبردة. تغطية لوحات بورق الألمنيوم.

ملاحظة: تركيزات الأسهم Matrigel تختلف من دفعة واحدة. يشار إلى تعليمات التخفيف على ورقة البيانات.

  1. الحفاظ على لوحات على الجليد بين عشية وضحاها وإزالته من الجليد في اليوم التالي. يمكن أن تظل لوحات في الثلاجة مدة تصل إلى أسبوع واحد قبل استخدام.
  2. إعداد المتوسطة كاملة mTESR1 (أو ذوبان الجليد قارورة من Nutristem المتوسطة) وH-ESM (متوسطة ESC الإنسان) وفقا للجدول أدناه.
    H-ESM CONC نهائي ل 500 مل
    خروج المغلوب استبدال المصل (KSR) 20٪ 100 مل
    GlutaMAX 100X 2 مم 5 مل
    MEM غير الضرورية، الأحماض الأمينية 0.1 ملي 5 مل
    البنسلين الستربتوميسين 100 U / مل - 0.1 ملغ / مل 5 مل
    2 المركابتويثانول 0.1 ملي 900 ميكرولتر
    B27 الملحق - دون فيتامينا 10 مل
    N2 الملحق 5 مل
    خروج المغلوب DMEM - 370 مل

    ويمكن تخزين المتوسطة السهم عند 4 درجة مئوية لمدة لا يزيد عن 2 أسابيع. لإعداد المتوسطة النمو الشامل، يضاف جمعية جيل المستقبل الأساسية قبل احتساب فقطالتغذية الإلكترونية في تركيز النهائي من 20 نانوغرام / مل.

ملاحظة: أكمل H-ESM مشروطة الخلايا الليفية الماوس الجنينية يمكن أن تستخدم بدلا من mTESR1 أو Nutristem لخلايا الجذع.

  1. وضع لوحات مغلفة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إلى 2 ساعة قبل الركض.
  2. وينبغي passaged الخلايا تقريبا كل 5 أيام، حتى إن لم تكن قد وصلت التقاء. المستعمرات لا ينبغي أن لمس.
  3. استبدال المتوسطة النمو مع 1 مل من dispase (1 ملغ / مل، ويحل من ملغ / مل الأسهم 10 في PBS).
  4. إزالة التمييز المناطق التي انسحبت الزجاج ماصات باستور. وتشمل المجالات التي يجب إزالة الهياكل الحفرة تشبه أو الكيسي في وسط المستعمرات، وأية مناطق حيث أصبحت الخلايا فصلها عن المستعمرات وبالارض ويبدو أن تهاجر إلى الخارج.
  5. احتضان عند 37 درجة مئوية تحت غطاء الثقافة حتى تصبح حدود مستعمرة أكثر إشراقا وتبدأ في فصل (عادة حوالي 5-7 دقائق). Discarد dispase. تغسل مع 1 مل H-ESM وتجاهل.
  6. في 1 مل H-ESM، استخدام رافعة للخلية (ملعقة تشبه مكشطة) إلى المستعمرات الحصاد وجمع في 15 مل أنبوب إيبندورف. شطف مع 1 مل H-ESM وإضافة إلى الأنبوب. تدور في إطار التعاون الإقليمي 1،000 لمدة 4 دقائق وإزالة طاف.
  7. بيليه resuspend في 1 مل المتوسطة النمو قبل حرارة (إما mTESR1 أو Nutristem). تجنب تفتيت كتل كثيرا - ماصة صعودا وهبوطا أقل من 6-8X. تحديد عدد الخلايا يجب أن يكون مطلي وإزالة الخلايا لا لزوم لها (عادة 1:04 أو 1:05 تمييع)، على سبيل المثال لوحات 2 في 01:05، إزالة 600 ميكرولتر، ثم يضاف 1.6 مل المتوسطة الطازجة.
  8. إزالة Matrigel من لوحات. الخلايا مكان قطرة قطرة، وتوزيع بالتساوي على طبق من ذهب. تجنب هز أنبوب بشكل مفرط، وهذا سوف يسبب الخلايا على التحرك نحو الوسط.
  9. غسل أنبوب مع 1 مل المتوسطة والفجوة بين لوحات. الحجم النهائي في كل لوحة يجب أن يكون 1.5 -2 مل.
  10. تغيير متوسطة كل يوم، باستثناء يوم بعد الركض. على الرغم من أنهمثالية لتغيير اليومية المتوسطة، وهذا قد يتغير أحيانا على تردد مرة واحدة كل يومين إذا مرت لا يزيد عن 2-3 أيام منذ صدور آخر دون التأثير المحتمل تعدد القدرات أو تمايز.
  11. إذا يجب تجميد خط الخلية، اعادة تعليق بدلا من ذلك في 1-2 مل mFreSR تجميد المتوسطة باستخدام 2 مل ماصة ومكان 1 مل / cryovial. مكان قارورة في cryobox في -80 درجة مئوية، ونقل إلى النيتروجين السائل في 3-4 أيام.

ملاحظة: يجب إجراء تسليخ مجهري يدوي من خلايا الجذع تحت stereomicroscope. في المختبر الإخصاب (التلقيح الاصطناعي) محطة العمل (على سبيل المثال على محطة العمل IVF من KSystem) متكاملة مع stereomicroscope يسمح التلاعب في الخلايا في ظروف معقمة في حين يتم الاحتفاظ بها على مساحة سطح ساخن. إذا كان هذا غير متوفر، وهو stereomicroscope يمكن نقلها تحت التدفق المنتظم لالصفحي هود.

2. مضغي الشكل الهيئات تجميع والقلب Inductioن

  1. إعداد EBM-20 المتوسطة وفقا للجدول أدناه.
    EBM-20 CONC نهائي ل 500 مل
    مصل بقري جنيني (المنشأ أمريكا الجنوبية) 20٪ 100 مل
    الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM 0.1 ملي 5 مل
    البنسلين - الستربتوميسين 100U/ml - 0.1 ملغ / مل 5 مل
    GlutaMAX 100X 0.1 ملي 5 مل
    2 المركابتويثانول 50uM 450 ميكرولتر
    DMEM/F12 - 385 مل

    استخدام FBS من أمريكا الجنوبية الأصل هو أمر حاسم لتحديد كفاءة التمايز: توظيف أنواع أخرى من الأمصال قد تؤثرعملية التمايز. لإعداد كاملة EBM-20، حمض الاسكوربيك الاعلان (AA) إلى التركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل. ويمكن تخزين متوسطة النمو الكامل في 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن أسبوع واحد.
  2. الحصاد الجذع المستعمرات كما هو موضح أعلاه (الخطوات 1،6-1،9).
  3. Resuspend بلطف في 1 مل EBM-20 مع 2 مل ماصة. تجنب تفتيت كتل كثيرا - ماصة صعودا وهبوطا لا يزيد عن 2-3X، والتحقق من حجم المستعمرات تحت stereomicroscope. لوحة على لوحات مرفق منخفضة للغاية في نسبة 1:1 (على سبيل المثال لمم طبق 35، واستخدام 1 بئر من لوحة 6 جيدا). شطف أنبوب مع 1 مل EBM-20 وإضافة إلى لوحة.

ملاحظة: حجم المستعمرات تؤثر على عملية التمايز، والسيطرة على كفاءة وتوقيت الاستقراء القلب. وقد ثبت تجميع متجانس الحجم EBS للحد من تقلب وحظ خلال التمايز.

  1. في اليوم 3، تغيير EBM-20 مرة باستخدام مجهر لتجنب إعادةmoval من EBS. الحفاظ على ماصة على مقربة من حافة لوحة، وإزالة المتوسطة.
  2. في يوم 7، والتبديل EBS لوحات المغلفة مع 0.1٪ الجيلاتين وضعت سابقا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إذا لزم الأمر، يمكن إزالة الجيلاتين وترك لوحات تحت غطاء الثقافة خلية O / N. إضافة 35-40 EBS لكل 35 مم طبق.
  3. تحقق EBS لضرب مناطق وتغير EBM-20 مرتين في الأسبوع. وضع علامة خارج حيث توجد مناطق الضرب على الجزء العلوي من غطاء الطبق، لتسهيل توطين هم تحت stereomicroscope. يجب أن تظهر مجالات المقاولات بعد حوالي 10-20 يوما.
  4. عندما المناطق مع انكماش عفوية تظهر، قم بالتبديل إلى متوسطة EBM-2 (إعداد وEBM-20، مع FBS 2٪ بدلا من ذلك) وعزلهم كما هو موضح أدناه في القسم 3.
  5. مواصلة تحقق مناطق أخرى لضرب وتغيير متوسطة مرتين في الأسبوع حتى تكون هناك حاجة لمزيد من الضرب المناطق التجارب.

ملاحظة: كفاءة عملية التمايز تعتمد بشكل كبير علىعدة عوامل، والأكثر أهمية من التي هي خطوط الخلايا المحددة ودفعة من المصل المستخدمة للحث على تمايز القلب. للحصول على أعلى كفاءة، خطوط الخلايا اختبار لإمكانية cardiomyogenic ودفعات مختلفة من المصل.

3. ضرب مناطق العزلة والثقافة

  1. معطف لوحات ال 12 جيدا (4 سم 2 مساحة) أو لوحات في المصالح مع 5 ميكروغرام / سم 2 فبرونيكتين، مخففة في برنامج تلفزيوني لجعل حجم ما يكفي لتغطية كامل سطح تماما (300 مجموع ميكرولتر لكل بئر في لوحات 12 أيضا). الحفاظ على كشف غطاء محرك السيارة في خلية ثقافة والسماح ليجف. لوحات يمكن أن تكون ملفوفة وتخزينها في 4 درجات CO / N.
  2. إزالة منطقة الضرب باستخدام الزجاج سحبت ماصة باستير ومشرط، حسب الحاجة. نقل لوحات فبرونيكتين المغلفة مع 1 مل ماصة.
  3. إضافة 1 مل EBM-2.
  4. شطب لوحة للإشارة إلى المناطق التي أزيلت الخلايا وتغيير المتوسطة. يمكن أن تظل لوحات لمدة تصل إلى 1 في الشهر، كما قد تبدأ مناطق أخرى بالأكل في وقت لاحق.

ملاحظة: إذا كان هناك حاجة إلى كتل أصغر الضرب، ماصة منطقة explanted صعودا وهبوطا عدة مرات تحت stereomicroscope، حتى يكسر إلى قطع أصغر. وهذا سيؤدي في مجموعات من بضع خلايا في الضرب (انظر فيلم 3).

  1. تغيير متوسطة مرتين في الأسبوع لتصبح جاهزة للتحليل.

ملاحظة: العضلية الحصول عليها من هذا البروتوكول تمتلك الخصائص المورفولوجية والوظيفية الجنين مثل؛ نضوج نحو النمط الظاهري الكبار مثل ويمكن الحصول من خلال زيادة الوقت في الثقافة لمواصلة تمييز هذه الخلايا.

4. واحد ضرب زنازين العزل وتحليل

  1. معطف الشرائح 2 غرفة (4 سم 2 منطقة) أو دعامات مناسبة أخرى مع 5 ميكروغرام / سم 2 فبرونيكتين المخفف في برنامج تلفزيوني كافية لتغطية سطح ثقافة بأكملها. إذا تم استخدام الدعم الزجاج، ومعطف مع laminin وفبرونيكتين (5 ميكروغرام / سم <سوب> 2 لكل منهما).
  2. إزالة ضرب المنطقة مع ماصة باستير / مشرط من لوحات من الباب 3.
  3. باستخدام ماصة 1 مل، نقل الخلايا إلى أنبوب مل تحتوي على 500 ميكرولتر 15 كولاجيناز الثاني (480 U / مل في برنامج تلفزيوني مع المغنيسيوم والكالسيوم)، واحتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية، والهز الأنبوب مرة واحدة خلال فترة الحضانة.
  4. ماصة صعودا وهبوطا مع ماصة 200 ميكرولتر. إذا تبقى أي كتل، ونقل إلى طازجة كولاجيناز الثاني وكرر الخطوة 4.3.
  5. كرر الخطوة 4.4 حتى يتم ترك أي كتل كبيرة.
  6. تعطيل كولاجيناز مع 3 مل EBM-2 (لا AA). ويمكن بعد ذلك غادر أنبوب تحت غطاء محرك السيارة في رفوف ساخنة حتى أنابيب أخرى جاهزة. الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 1،000 لمدة 4 دقائق.
  7. بيليه resuspend في 1 مل 0.25٪ التربسين / EDTA (المخفف من الأسهم بنسبة 0.5٪ في برنامج تلفزيوني 1X)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. الجمع بين أجزاء من الهضم من نفس العينة الأولي.
  8. تعطيل التربسين مع 4 مل EBM-2 (لا AA). تمر الخلايا من خلال إبرة 18G على 2.5 مل حقنة لا أكثر رهان 7X. الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي 1،000 لمدة 4 دقائق.
  9. Resuspend الخلية بيليه في 1 مل EBM-2 لكل بئر وصفيحة. الخلايا يمكن استخدامها لتحليل وظيفي والصرفية بعد 2-3 أيام الطلاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في دراساتنا ولدت لنا مضادة من عدة خطوط الخلايا المحفزة. وقد تم توليد هذه السطور مبدئيا على طبقة المغذية MEF لكنها وضعت على الفور على Matrigel باستخدام وسيلة تعريف (إما mTESR1 أو Nutristem). واستخدمت مختلف المقايسات للتحقق من الحفاظ على الخصائص المورفولوجية، والتعبير عن علامات نموذجية من الخلايا المحفزة (OCT-4، SSEA4 وTRA1-60) واستقرار الجينوم الخاصة بهم (الشكل 1).

واندلعت الاستقراء في النسب القلب عن طريق تجميع خلايا الجذع في EBS والثقافة في وجود نوع معين من المصل وAA (أرقام 2A و 2B). تمثل مجالات المقاولات 20-35٪ من المجموع، اعتمادا على خط الخلية المستخدمة (الشكل 2C وفيلم 1). التعاقد مضادة معزولة من هذه المناطق بواسطة الهضم الأنزيمي (فيلم 2): أعرب عن البروتينات الهيكلية cardiomyocyte نموذجي (تروبونين القلب، وALPHA؛ أكتين الساركومير، الميوسين السلاسل الثقيلة وα β)، والبروتينات تقاطع الفجوة (connexin-43)، والقنوات الأيونية الرئيسية (أرقام 2D-2F). وكشف تحليل الكهربية من هذه الخلايا يبلغ عدد سكانها غير متجانسة تضم الخلايا العقدية مع، الأذيني، وملامح البطين (البيانات لا تظهر، بريوري، SG، وآخرون، J. كلين. الاستثمار.، في الصحافة، 14،15،20).

الشكل 1
الشكل 1. تغذية خالية من الجذع صيانة الخلايا لا يؤثر تعدد القدرات. AB) المستعمرات الجذع نمت على Matrigel الاحتفاظ الإنسان ESC مثل التشكل، مع حواف مرحلة مشرق ونويات بارز. CD) تحليلات المناعي تظهر خلايا الجذع التعبير عن عامل النسخ OCT-4 بشكل صحيح (C)ومستضد TRA1-60 السطح (أشرطة النطاق: 50 ميكرون). (D) (E) أكد تحليل Cytofluorimetric التعبير عن مستضدات نموذجي تعدد القدرات السطحية (SSEA-4 وTRA1-60). يظهر استراتيجية المعزولة من قبل مبعثر اليسرى. (F) تحليل النمط النووي الممثل من خلايا الجذع نمت على Matrigel. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. تمايز وظيفي IPS-مشتقة اتفاقية الأنواع المهاجرة. A) تمثيل تخطيطي للبروتوكول تمايز. B) الهيئات مضغي الشكل تجميع عناصره من خلايا الجذع. C) تمثيل مساحة الانكماش. D) RT-PCR المعرضجي التعبير عن بعض القنوات الأيونية القلب محددة من قبل مصلحة السجون المستمدة كتل الضرب (CACNA1A - قناة الكالسيوم، والجهد تعتمد، ألفا 1A الوحيدات؛ SCN5A - قناة الصوديوم، الجهد بوابات، نوع V، ألفا الوحيدات؛ KCNQ1 - الجهد والبوتاسيوم قناة بوابات، KQT مثل فصيلة، عضو 1) وكلا الشكلين من الميوسين السلسلة الثقيلة (MHC-A و-B MHC). هناك تعبير تم كشفها في خلايا الجذع، في حين كدنا] من خلايا قلب الجنين كان يستخدم كعنصر تحكم إيجابية. وقد استخدم HGPRT كما الجين التدبير المنزلي. EF) تلوين المناعي تظهر واحدة IPS-مشتقة مضادة معربا عن الهيكلية بروتين الأكتين α-الساركومير للقلب التروبونين I (TNNI)، وتقاطع connexin القلب محددة 43 (CNX-43). أشرطة النطاق: 50 ميكرون. تم الحصول على الصور باستخدام Axiovision زايس مضان المجهر المقلوب وتحليلها مع يماغيج. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

<STRONG> الفيلم 1. المقاولات منطقة المستمدة من خلايا الجذع. انقر هنا لمشاهدة الفيلم.

فيلم 2. متعاقد واحد IPS-مشتقة CMS، تم الحصول عليها من الهضم الأنزيمي من منطقة التعاقد. انقر هنا لمشاهدة الفيلم.

فيلم 3. كتلة المقاولات الصغيرة، التي تم الحصول عليها عن طريق تشريح الميكانيكية جزئية. انقر هنا لمشاهدة الفيلم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخلايا الجذعية المحفزة لديها القدرة على التفريق بصورة عفوية إلى CMS، ولو مع انخفاض كفاءة والتباين الشديد بين السطور. ولذلك فقد ركزت تطوير طرق تحريض رواية على تحسين كفاءة العملية والتحرك نحو بروتوكولات أكثر تحديدا. ومع ذلك، فإن معظم هذه الأساليب التمايز جديدة معقدة جدا، وتتطلب ظروف معقدة والثقافة، ومراقبة دقيقة من توقيت وتركيز الكواشف، والمعاملة مع السيتوكينات وعوامل النمو مكلفة. أيضا، والاختلافات في مستويات الذاتية إشارات خلوى من مختلف خطوط الخلايا المحفزة تجعل من الصعب توحيد تركيزات خلوى، والتي غالبا ما يجب تعديلها لمستويات مناسبة لكل خط الخلية.

نضوج الحصول IPS-مشتقة مضادة يمثل أيضا جانبا بالغ الأهمية في الاعتبار عند محاولة التفريق القلب من خلايا الجذع لنمذجة مرض والتطبيقات اكتشاف المخدرات. وdifferentiatأيون من المجالس الاقتصادية والاجتماعية والبشرية خلايا الجذع عادة يثير مضادة مع أي النمط الظاهري الجنين دون بنية ناضجة تماما. هل هذا صحيح بشكل خاص عندما تستخدم نهج أحادي الطبقة، ونتيجة لذلك وهذه هي أكثر ملاءمة لتوليد، تضخيم، وعزل فئات معينة من السكان السلف القلب 2،3.

في هذا السيناريو، "الكلاسيكية" EBS طريقة التجميع، والتي لا تزال تستخدم على نطاق واسع لأغراض النمذجة المرض، ويبدو لتناسب بشكل أفضل احتياجات التجريبية. هذا الأسلوب واضح ومباشر، واقتصادا، عمليا بسهولة، ومناسبة لجميع الخطوط. ليست هناك حاجة لعوامل النمو إضافية أو السيتوكينات، أو لعملية الهضم وحيدة الخلية، والتي غالبا ما لا يمكن تحمله بشكل جيد للغاية من قبل خلايا الجذع؛ أيضا، فإنها تتطلب علاجات إضافية مع مثبطات ROCK 21. وعلاوة على ذلك، فإن التجميع في EBS يشبه العملية التنموية الطبيعي للخلية المحفزة، مع EBS توفير بيئة 3 الأبعاد والفقرةإشارات crine التي هي أكثر مماثلة إلى الظروف الفسيولوجية. وعلاوة على ذلك، فقد تبين إضافة AA باستمرار لتعزيز التمايز القلب من خلايا الجذع، وأيضا لتحسين النضج الهيكلي والوظيفي الخاصة بهم 18،19. اختيار الجذع خطوط الخلايا يعتمد على إمكاناتهم قلبية، جنبا إلى جنب مع اختيار أنسب دفعة من المصل، قد زيادة تحسين كفاءة توليد CM.

وأخيرا، فإن الطريقة المقترحة هنا أيضا لديه ميزة لا تتطلب الخلايا المغذية الماوس، مما يلغي إمكانية تلوث مع خلايا فأر وأيضا يبسط مزيد من الإجراءات الفنية للخلية الجذع الركض وتشكيل EBS. هذا الأسلوب يمنح العديد من المزايا، ويشكل تحسنا كبيرا خلال التقنيات السابقة، وفتح الطريق أمام القلب والأوعية الدموية تطبيقات الطب التجديدي في المستقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا المصالح المالية في الكشف عنها.

Acknowledgements

كان مدعوما من قبل جامعة BS من برنامج تدريب ميلان صيف بيكوكا بحوث الطلاب؛ وأيد البحوث من أموال الوزارة الإيطالية الصحة ووزارة التربية والتعليم الإيطالية، جامعة والبحوث وFONDAZIONE Humanitas إلى GC، ونحن بفضل مايكل VG لاترونيكو لقراءة نقدية لل مخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix BD Biosciences 354277 Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution Sigma F0896-2MG Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin Sigma L2020-1MG Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X Lonza BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X Bio Sera XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II Roche 4942078001 Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5% Sigma T3924
Collagenase type 2 Worthington 4176 Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12 Life Technologies 21331-020
Knockout DMEM Life Technologies 10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR) Life Technologies 10828-028 Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
F–tal Bovine Serum (origin South America) Invitrogen 10270-106 Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X Life Technologies 15140-122
GlutaMAX, 100X Life Technologies 35050-038
MEM NEAA, 100X Invitrogen 11140-135
N2 supplement, 100X Life Technologies 17502-048
B27 supplement, 50X Life Technologies 12587-010
2-mercapt–thanol Invitrogen 31350-010
Gelatin, from porcine skin Sigma G1890-100G Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1 Stem Cell Technologies 5850 Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF Stemgent from Biological Industries 05-100-1A Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR Stem Cell Technologies 5853
Ascorbic acid Sigma A4544-25G Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
Plasticware
35 mm culture dishes Becton Dickinson 353001
Cell scraper Corning Incorporated 3008
12-well plates Becton Dickinson 353043
Permanox 2-well chamber slides Thermo Fisher Scientific 177437
Glass 2-well chamber slides Thermo Fisher Scientific 177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface Corning Incorporated 3471
18G needle Becton Dickinson 304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm VWR International 612-1702
2.5 ml syringe Becton Dickinson 300188
Equipments
IVF Workstation KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function. Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, 326-335 (2011).
  3. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
  4. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132, 537-543 (2008).
  5. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  6. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  7. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  8. Yamanaka, S. A fresh look at iPS cells. Cell. 137, 13-17 (2009).
  9. Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders. Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).
  10. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  11. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2012).
  12. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).
  13. Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471, 230-234 (2011).
  14. Itzhaki, I., et al. Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells. Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).
  15. Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).
  16. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).
  17. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).
  18. Cao, N., et al. Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells. Cell Research. 22, 219-236 (2012).
  19. Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107, 1912-1916 (2003).
  20. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).
  21. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics