इन्फ्रारेड तंत्रिका उत्तेजना के तंत्र की जांच के लिए पूरे सेल पैच दबाना

Neuroscience

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Summary

इन्फ्रारेड तंत्रिका उत्तेजना श्रवण प्रणाली से जुड़े लोगों सहित तंत्रिका प्रकार की एक सीमा में बिजली की उत्तेजना के लिए एक विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया है. इस प्रोटोकॉल प्राथमिक श्रवण न्यूरॉन्स की एक संस्कृति में अवरक्त तंत्रिका उत्तेजना के तंत्र के अध्ययन के लिए एक पैच दबाना विधि का वर्णन करता है.

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Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation. J. Vis. Exp. (77), e50444, doi:10.3791/50444 (2013).

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Abstract

यह स्पंदित, अवरक्त प्रकाश लेजर लक्ष्य ऊतक के किसी भी आगे संशोधन की स्वतंत्र, तंत्रिका ऊतक में बिजली प्रतिक्रियाओं प्रकाश में लाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि हाल के वर्षों में प्रदर्शित किया गया है. इन्फ्रारेड तंत्रिका उत्तेजना श्रवण तंत्रिका में न्यूरॉन्स की उत्तेजना में दिखाया विशेष रुचि के साथ, vivo में परिधीय और संवेदी तंत्रिका ऊतक की एक किस्म में सूचित किया गया है. आईएनएस इन स्थितियों में काम करने के लिए दिखाया गया है हालांकि, जबकि, अवरक्त प्रकाश तंत्रिका उत्तेजना का कारण बनता है जिसके द्वारा तंत्र (या तंत्र) वर्तमान में अच्छी तरह से नहीं समझा गया है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल सुसंस्कृत प्राथमिक श्रवण न्यूरॉन्स में अवरक्त तंत्रिका उत्तेजना की जांच की सुविधा के लिए बनाया गया एक पूरे सेल पैच दबाना विधि का वर्णन करता है. अच्छी तरह से नियंत्रित परिस्थितियों में इन विट्रो में अवरक्त लेजर रोशनी के लिए इन कोशिकाओं की प्रतिक्रिया निस्र्पक करके, यह मौलिक physica की एक बेहतर समझ हासिल करने के लिए संभव हो सकता हैएल और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं अवरक्त तंत्रिका उत्तेजना अंतर्निहित.

Introduction

Neurophysiology और चिकित्सा बायोनिक्स के क्षेत्रों तंत्रिका ऊतक में प्रतिक्रियाओं का विद्युत चलाया उत्तेजना की अनुमति है कि तकनीक पर काफी भरोसा है. बिजली की उत्तेजना तंत्रिका उत्तेजना में स्वर्ण मानक रहता है तंत्रिका प्रतिक्रियाओं, और ऊतक 1 आसपास में वर्तमान के प्रसार के कारण उत्तेजना विशिष्टता की कमी जब रिकॉर्डिंग, यह इस तरह की उत्तेजना कलाकृतियों की उपस्थिति के रूप में कमियों के एक नंबर से ग्रस्त है.

पिछले दो दशकों ऑप्टिकली मध्यस्थता उत्तेजना तकनीक 2 के विकास को देखा है. इन तकनीकों में से कई या तो एक विशेष अणु के अलावा (जैसे बंदी अणुओं) 3 या एक अनुसंधान की स्थापना के बाहर आसानी से लागू कर रहे हैं, जिनमें से न तो आनुवंशिक हेरफेर के कुछ फार्म (जैसे optogenetics) 4, के माध्यम से, लक्ष्य ऊतक के संशोधन की आवश्यकता है. खास रुचि इसलिए अवरक्त तंत्रिका उत्तेजना (आईएनएस), whereb हैवाई तंत्रिका ऊतक स्पंदित अवरक्त लेजर प्रकाश से उत्साहित है. आईएनएस तंत्रिका ऊतक 2 के अति विशिष्ट, गैर संपर्क उत्तेजना को सक्षम करने से बिजली की उत्तेजना की कमियों के कई उबरने की क्षमता है. आईएनएस सफलतापूर्वक विवो में सेटिंग्स की एक किस्म में प्रदर्शन किया गया है, जबकि हालांकि, उत्तेजना की सटीक व्यवस्था अनिश्चित बनी हुई है.

हाल के कुछ प्रकाशनों 5-7 आईएनएस के पीछे तंत्र को उजागर करने की दिशा में प्रगति हुई है. पानी से लेजर प्रकाश के अवशोषण के कारण तेजी से गर्म एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं प्रकट होता है. हालांकि, इस से परे एक आम सहमति अभी तक पहुँच सकता है. शापिरो एट अल. 7 तेजी हीटिंग कोशिका झिल्ली और बाद विध्रुवण की समाई में एक परिवर्तन के लिए अग्रणी, कोशिका झिल्ली को आसन्न आरोप लगाया कणों के वितरण में गड़बड़ी का कारण बनता है जिससे एक बेहद सामान्य तंत्र का प्रस्ताव. इसके अलावा, अल्बर्ट एट अल. 5 कि लेस जोरआर प्रेरित हीटिंग आयनों कोशिका झिल्ली के माध्यम से पारित करने के लिए अनुमति देता है, तापमान संवेदनशील आयन चैनल (क्षणिक रिसेप्टर संभावित vanilloid चैनल) की एक विशेष वर्ग को सक्रिय करता है. इस स्तर पर यह पहचान करने के लिए अभी तक कर रहे हैं कि आगे कारक हैं कि क्या वास्तव में इन तंत्रों गठबंधन कैसे स्पष्ट नहीं है, या.

प्रकाशनों की एक छोटी संख्या (संदर्भ 5,7-9) इन विट्रो में आईएनएस की जांच की है हालांकि, इस क्षेत्र में प्रकाशित काम के विशाल बहुमत (जैसे संदर्भ 1,6,10-18) vivo में बाहर किया गया है. श्रवण न्यूरॉन्स की इन्फ्रारेड उत्तेजना कर्णावत प्रत्यारोपण 10,14-18 में संभावित अनुप्रयोगों के कारण विशेष हित के एक क्षेत्र में किया गया है. विवो प्रयोगों में विभिन्न सेटिंग्स में तकनीक इन विट्रो अध्ययन में afforded द्वारा नियंत्रण की वृद्धि हुई स्तर यांत्रिक के एक अधिक विस्तृत समझ के लिए नेतृत्व की उम्मीद है की प्रभावशीलता को सत्यापित करने के लिए महत्वपूर्ण हैंआईएनएस के लिए जिम्मेदार anism. इस रिपोर्ट में ये भी श्रवण प्रणाली से मौजूदा डेटा की बड़ी शरीर को जोड़ने जबकि मौलिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में पैच दबाना जांच के लिए सुसंस्कृत सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की तैयारी का वर्णन करता है.

पैच दबाना तकनीक एकल कक्षों में बिजली की गतिविधि की रिकॉर्डिंग का एक साधन उपलब्ध कराने और व्यक्ति अंतर्निहित धाराओं 19 के योगदान का अध्ययन, electrophysiological घटना की जांच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है. इस तकनीक ऐसी सुसंस्कृत सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स के रूप में प्राथमिक न्यूरॉन्स की इन विट्रो तैयारी में एक स्थिर करने के लिए लागू किया जाता है, यह गहराई तंत्रिका गतिविधि नियंत्रित और चालाकी है जिसके द्वारा तंत्र में अध्ययन करने का अवसर प्रदान करता है.

पैच दबाना माध्यम सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की बिजली के गुणों पर लेजर उत्तेजना के प्रभाव की जांच के लिए इस काम की रूपरेखा तरीकों में निर्दिष्ट प्रोटोकॉलरिकॉर्डिंग. दृष्टिकोण मानक खुर्दबीन विन्यास को संशोधित करने की आवश्यकता के बिना सुरक्षित संचालन के साथ ही आसान और अधिक repeatable संरेखण की इजाजत दी, बल्कि एक मुक्त अंतरिक्ष लेजर से एक फाइबर मिलकर लेजर पर आधारित है. इन प्रोटोकॉल के आधार पर, यह और अधिक स्पष्ट रूप से आईएनएस के पीछे तंत्र या तंत्र का निर्धारण करने के क्रम में प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला का संचालन करने के लिए संभव हो जाना चाहिए.

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Protocol

1. सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स की संस्कृति

  1. एक autoclave में छोटे गोल (जैसे 10 मिमी व्यास) कांच coverslips और घुमावदार संदंश जीवाणुरहित. निष्फल संदंश का उपयोग कर एक बाँझ 4 अंगूठी 35 मिमी पेट्री डिश या 4 अच्छी तरह से थाली के व्यक्तिगत कुओं में निष्फल coverslips स्थानांतरण. 48 घंटा करने के लिए एक मशीन में coverslip और जगह के ऊपर की सतह (37 डिग्री सेल्सियस) के लिए पाली एल ओर्निथिन (500 माइक्रोग्राम / एमएल) और माउस laminin (0.01 मिलीग्राम / एमएल) के 150 μl लागू करें. Coverslips के अच्छी तरह से नीचे से तैर नहीं करना सुनिश्चित करें.
  2. 47.5 मिलीलीटर neurobasal ए, 0.5 मिलीग्राम एन 2 पूरक, 1 मिलीलीटर B27 पूरक, 0.5 मिलीग्राम एल glutamine, और 0.5 मिलीलीटर पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन: हर तंत्रिका संस्कृति के लिए 50 मिलीलीटर बाँझ Neurobasal मीडिया (NBM) तैयार करें. नोट: पूरक जमे हुए किया जा सकता है, -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और आवश्यक दिन पर मीडिया में जोड़ा.
  3. पहले 20,21 वर्णित के रूप में प्रसवोत्तर दिन 4-7 चूहे पिल्ले से सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स अलग कर देना, हमेंएंजाइमी (0.025% trypsin और 0.001% DNase मैं) और यांत्रिक तकनीक दोनों आईएनजी. Whitlon एट अल. 22 और विएरा एट अल. 23 का संदर्भ लें modiolus अलगाव के एक प्रदर्शन के लिए सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन संस्कृति, या पार्कर एट अल. 24 की विस्तृत प्रक्रियाओं के लिए.
  4. Coverslips से किसी भी शेष poly-L-ornithine/laminin समाधान महाप्राण और NBM साथ संक्षिप्त धोने.
  5. एक मशीन (37 डिग्री सेल्सियस, 10% सीओ 2) में coverslips और जगह के लिए अलग सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन निलंबन के 150-200 μl जोड़ें. नोट: 20 से ऊपर coverslips के 8 चूहे पिल्ले के एक औसत कूड़े से तैयार किया जा सकता है.
  6. चार घंटे चढ़ाना न्यूरॉन्स के बाद, सेल मलबे को हटाने और 150-200 μl गर्म ताजा NBM के साथ बदलने के लिए समाधान aspirate. नोट: मीडिया निर्जलीकरण से बचने के लिए दैनिक पुनःपूर्ति आवश्यकता हो सकती है.
  7. Electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए जब तक आवश्यक है इनक्यूबेटर coverslips के लौटें. नोट: अलग सर्पिलनाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन संस्कृतियों चार घंटे हदबंदी के बाद और उसके बाद दो दिनों के लिए electrophysiological प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन विट्रो में समय परिणामों के विश्लेषण के दौरान ध्यान में रखा जाना चाहिए. हर 24-48 घंटा NBM की भरपाई होगी.

2. पैच दबाना रिकॉर्डिंग के लिए तैयारी

  1. समाधान तैयार
    1. Intracellular (micropipette का) समाधान: 115 मिमी कश्मीर gluconate, 7 मिमी KCl, 10 मिमी HEPES, 0.05 मिमी EGTA, 2 मिमी ना 2 एटीपी, MgATP 2 मिमी, 0.5 मिमी ना 2 जीटीपी (KOH के साथ 7.3 पीएच को समायोजित, 295 को समायोजित सुक्रोज के साथ mOsmol / किग्रा). एक बाँझ फिल्टर (0.2 माइक्रोन) के माध्यम से समाधान दर्रे और रिकॉर्डिंग के दिन तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करने के लिए 200 μl aliquots में विभाजित करते हैं.
    2. कोशिकी (स्नान) समाधान: 137 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 2 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी HEPES, 10 मिमी ग्लूकोज (NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें; sucrose के साथ 300-310 mOsmol / किलो के लिए समायोजित) . यह समाधान रिकॉर्डिंग के दिन किया जाता है.
  2. MΩ 2-6 की एक प्रतिरोध के साथ रिकॉर्डिंग micropipettes तैयार. और borosilicate ग्लास (1.0 मिमी बाहरी व्यास, 0.58 मिमी भीतरी व्यास, 75 मिमी लंबाई), हम एक सीओ 2 लेजर डांड़ी (Sutter उपकरण पी -2000) का उपयोग करें.
  3. लेजर तैयार. इस प्रोटोकॉल OptoTech पी / एल से ऐसे 1,870 एनएम इन्फ्रारेड तंत्रिका उत्तेजक के रूप में एक फाइबर युग्मित लेजर के साथ प्रयोग के लिए करना है हमारे प्रयोगों में प्रकाश डिलीवरी के लिए इस्तेमाल ऑप्टिकल फाइबर दोनों सिरों पर एक संख्यात्मक 0.22 के एपर्चर और एफसी पीसी connectors के साथ एक 200/220 माइक्रोन कोर / आवरण व्यास सिलिका फाइबर है (AFW टेक्नोलॉजीज MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). पैच तार दो फाइबर pigtails (यानी एक छोर पर connectorized और अन्य पर cleaved) के उत्पादन के लिए आधे में काट रहे थे. फाइबर कोर व्यास और लेजर प्रेरित तापमान परिवर्तन पर संख्यात्मक एपर्चर के प्रभाव थॉम्पसन एट अल द्वारा विस्तार से चर्चा की गई है. 25
    1. फोड़ना मानक तकनीक का उपयोग कर प्रकाश वितरण फाइबर की नोकऔर जिसके परिणामस्वरूप टिप एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप (यानी टिप फाइबर अक्ष को सीधा किया और दृश्य निरीक्षण पर फ्लैट दिखाई देनी चाहिए) के साथ अवलोकन से उच्च गुणवत्ता की है कि यह सुनिश्चित करें. कनेक्टर (जैसे Thorlabs ADAFC2) के माध्यम से एक उचित उपयोग कर उत्तेजना लेजर की फाइबर मिलकर उत्पादन करने के लिए प्रकाश वितरण फाइबर कनेक्ट करें.
    2. एक उपयुक्त साधन (एल एम -3 डिटेक्टर सिर के साथ जैसे सुसंगत FieldMate) का उपयोग कर प्रकाश वितरण फाइबर के cleaved सिरे से उत्पादन लेजर बिजली उपाय. यह लेजर शक्ति प्रकाश वितरण फाइबर cleaved है या एक महत्वपूर्ण समायोजन (जैसे एक प्रयोगशाला से दूसरे परिवहन) लेजर करने के लिए किया जाता है हर बार की जांच करने की सिफारिश की है.
    3. एक फाइबर चक या समकक्ष डिवाइस और जोड़ना उचित micropositioner को चक में प्रकाश वितरण फाइबर डालें. यह सही ऑप्टिकल फाइबर coverslip के साथ आता है कि θ कोण निर्धारित करने में सक्षम होने के लिए महत्वपूर्ण है. इस anglई प्रयोगात्मक व्यवस्था की एक तस्वीर लेने और कोण प्राप्त करने के लिए इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर (जैसे ImageJ) का उपयोग करके मापा जा सकता है. विशेष माइक्रोस्कोप में - कोण θ (या संभव कोण की रेंज) मुख्य रूप से प्रयोगात्मक व्यवस्था के स्थानिक सीमाओं द्वारा विवश है. हमारे प्रयोगों में θ के विशिष्ट मूल्यों (एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के आधार पर) 36 डिग्री के आसपास, लेकिन इष्टतम कोण (एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग उन जैसे) वैकल्पिक व्यवस्था के लिए काफी भिन्न हो सकती हैं.
    4. लेजर और चित्रा 2 में दिखाया गया है पैच दबाना डाटा अधिग्रहण प्रणाली (जैसे Digidata 1440A, आण्विक डिवाइसेज) के बीच कनेक्शन बनाते हैं. पैच दबाना डाटा अधिग्रहण प्रणाली से डिजिटल आउटपुट यह संभव डाटा अधिग्रहण प्रणाली की स्वतंत्र लेजर पल्स पैरामीटर निर्दिष्ट करने के लिए बना रही है, एक बाहरी समारोह जनरेटर के माध्यम से लेजर से जुड़ा होना चाहिए. वैकल्पिक रूप से इस उत्पादन को सीधे जोड़ा जा सकता हैलेजर ड्राइवर (पल्स लंबाई और पुनरावृत्ति दर डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित किए जाने की आवश्यकता होती है). या तो मामले में, लेजर ट्रिगर करने के लिए इस्तेमाल किया संकेत लेजर दालों का समय और लंबाई electrophysiological संकेत के साथ समवर्ती दर्ज किया जा सकता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए डाटा अधिग्रहण प्रणाली का एक इनपुट को वापस जोड़ा जाना चाहिए.

3. आईएनएस की जांच के लिए पैच दबाना रिकॉर्डिंग

  1. कोशिकी समाधान के साथ छिड़काव प्रणाली की उचित कंटेनर भरें और 1-2 मिलीग्राम / मिनट की दर से स्नान का छिड़काव प्रदान करने के लिए प्रवाह दर को समायोजित. हम समाधान की तेजी हीटिंग, और चूषण द्वारा खर्च समाधान निकालने के लिए एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप सक्षम करने के लिए एक लाइन में हीटर के साथ एक गुरुत्वाकर्षण खिलाया प्रणाली (हवा खींचने की बोतल, चुटकी वाल्व, और पीई टयूबिंग) का उपयोग करें.
  2. एक ईमानदार माइक्रोस्कोप की रिकॉर्डिंग कक्ष (स्नान) में संवर्धित कोशिकाओं के साथ एक coverslip रखें. एक उच्च बढ़ाई पानी विसर्जन उद्देश्य (ई का प्रयोग40X. जी.) और चरण विपरीत (जैसे अंतर हस्तक्षेप विपरीत या Dodt ढाल विपरीत), नेत्रहीन संस्कृति के भीतर सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स खोजें. चित्रा 1a में दिखाया गया है एक ठेठ सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन, एक प्रमुख नाभिक के साथ व्यास में चरण उज्ज्वल, गोल और लगभग 15 माइक्रोन है.
  3. एक न्यूरॉन स्थित किया गया है, एक कम बढ़ाई उद्देश्य (जैसे 10X) करने के लिए स्विच और दृश्य क्षेत्र के भीतर लक्ष्य न्यूरॉन खोजें.
  4. निम्नलिखित प्रक्रिया (या समतुल्य) का उपयोग करने की स्थिति में प्रकाश वितरण ऑप्टिकल फाइबर ले जाएँ:
    1. टिप क्षैतिज और ऊर्ध्वाधर विमानों दोनों में लक्ष्य न्यूरॉन करे जब तक उत्पादन फाइबर स्थानांतरित करने के लिए micropositioner का प्रयोग करें. फाइबर टिप के ऊर्ध्वाधर स्थिति उद्देश्य ऊपर और नीचे चलती है (ध्यान स्कैनिंग) द्वारा सत्यापित किया जा सकता है.
    2. उच्च वृद्धि के उद्देश्य पर वापस जाएं और टी के बगल में अपनी इच्छित स्थिति में ऑप्टिकल फाइबर की नोक की स्थितिउन्होंने न्यूरॉन (चित्रा 2 इनसेट देखें). फाइबर की ऊर्ध्वाधर स्थिति का समायोजन करते हैं, यह फाइबर के नीचे बढ़त फाइबर के स्थान में अनिश्चितता को कम करने के लिए, coverslip (यानी बस छू) पर आराम कर रहा है कि महत्वपूर्ण है. क्षैतिज विमान में इष्टतम संरेखण फाइबर coverslip और फाइबर r की त्रिज्या के साथ आता है कि θ कोण पर निर्भर करेगा. लक्ष्य न्यूरॉन के केंद्र फाइबर अक्ष के साथ झूठ इतना है कि फाइबर की स्थिति के लिए आदेश में, फाइबर के ऊपरी किनारे और लक्ष्य सेल के बीच क्षैतिज दूरी होनी चाहिए
      Δ लक्ष्य = आर (cosec θ - 2 पाप θ),
      नकारात्मक मूल्यों का संकेत होता है कि जहां ऑप्टिकल फाइबर overhangs सेल. फाइबर aligning जब, फाइबर के ऊपरी किनारे और न्यूरॉन के केंद्र के बीच Δ लक्ष्य की दूरी लगभग दृश्य निरीक्षण के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि Δ लक्ष्य बनाया गया हैकेवल किसी न किसी दिशानिर्देश के रूप में सेवा करते हैं. फाइबर के ऊपरी किनारे और न्यूरॉन के केंद्र के बीच वास्तविक दूरी Δ Δ लक्ष्य (चित्रा 1 के रूप में) से कुछ हद तक अलग है कि इस तरह के फाइबर पोजिशनिंग के मध्य से दोनों रेडियल विस्थापन (यानी के प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं लक्ष्य न्यूरॉन के सापेक्ष किरण की बीम) और अक्षीय विस्थापन (फाइबर अक्ष के साथ अर्थात्). ठेठ बहुपद्वति फाइबर के लिए बीम प्रोफाइल अच्छी तरह से एक शीर्ष टोपी वितरण 26, स्थानीय रूप से अवशोषित ऊर्जा (तापमान) में कमी के द्वारा approximated है के बाद से यानी - उदाहरण के लिए, Δ स्थापना ≈ 0 सेल के आसपास के क्षेत्र में स्थानीय तापमान में वृद्धि की उम्मीद होगी किरण के केंद्र से विस्थापन के कारण करीब सेल करने के लिए फाइबर अंत चेहरे बढ़ने से अवशोषित ऊर्जा में वृद्धि की तुलना में कम है.
      देखभाल के रूप में सही और repeatably पो के रूप में फाइबर की स्थिति के लिए लिया जाना चाहिएदृश्य cues, लक्ष्य न्यूरॉन (जैसे Δ) के सापेक्ष फाइबर स्थान की सटीक माप का उपयोग कर ssible एक पूर्व निर्धारित दूरी पर यह स्थिति अधिक से अधिक महत्व का है. प्रोटोकॉल के कदम 3.8.2 में वर्णित के रूप में Δ छवि विश्लेषण द्वारा (± 3 माइक्रोन की अनुमानित अधिकतम अनिश्चितता के साथ) निर्धारित किया जा सकता है. कुछ प्रयोगों 5,8 में, सफेद प्रकाश स्रोतों वांछित सेल को लक्षित करने के क्रम में फाइबर के माध्यम से युग्मित किया गया है. यह दृष्टिकोण लक्ष्य क्षेत्र से बिखरे हुए प्रकाश की तीव्रता इन उथले कोण (θ) पर अपेक्षाकृत कम था, ईमानदार माइक्रोस्कोप सेटअप में अप्रभावी हो पाया था.
    3. फाइबर की स्थिति में है, तो micropipette की स्पष्ट स्थिति सक्षम करने के लिए जाना जाता राशि से बाहर चले जाते हैं. फाइबर तो एक तंत्रिका रिकॉर्डिंग हासिल की है जब मूल स्थान को लौट जा सकता है.
  5. Intracellular समाधान के साथ micropipette भरें और सुरक्षित रूप से सिर पर जगह में फिटएम्पलीफायर की tage (जैसे Multiclamp 700B, आण्विक डिवाइसेज). Microelectrode धारक की तरफ से जुड़ी ट्यूबिंग का प्रयोग, micropipette के clogging रोकने के लिए सकारात्मक दबाव की एक छोटी राशि लागू होते हैं.
  6. एक micromanipulator का प्रयोग, सिर्फ लक्ष्य न्यूरॉन ऊपर स्थिति में micropipette ले जाते हैं.
  7. पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए प्रोटोकॉल:
    1. एम्पलीफायर का वोल्टेज दबाना मोड में एक 10 मिसे, 10 एम वी वर्ग तरंग नाड़ी (जैसे सील टेस्ट) लागू करें और 0 ना करने के लिए आधारभूत संकेत के micropipette के संभावित (पिपेट ऑफसेट) को समायोजित. सील परीक्षण भी microelectrode के प्रतिरोध वांछित सीमा (- MΩ 6 उदा 2) के भीतर है कि यह निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
    2. प्रतिरोध की निगरानी करते हैं, धीरे लक्ष्य न्यूरॉन की सतह पर micropipette की स्थिति के लिए micromanipulator के ठीक समायोजन का उपयोग करें. Micropipette के न्यूरॉन के साथ संपर्क में है, प्रतिरोध (~ 0.5 से 1 MΩ द्वारा) में वृद्धि होगी. मैंmmediately प्रतिरोध वृद्धि के बाद, सकारात्मक द्रव दबाव हटाने के लिए और एक छोटे से नकारात्मक दबाव लागू होते हैं. एक बार प्रतिरोध 10 बीत गया - 20 MΩ, एक होल्डिंग स्तर (-60 एम वी के आसपास उदाहरण के लिए) के लिए संभावित झिल्ली को ठीक.
    3. यह 1 GΩ से अधिक है जब तक इलेक्ट्रोड प्रतिरोध एक प्रभावी मुहर ('gigaseal' करार दिया) कोशिका झिल्ली और micropipette के बीच का गठन किया गया है कि वाचक, को बढ़ाने के लिए जारी रखना चाहिए. इस बिंदु पर, micropipette से सभी द्रव दबाव को हटा दें.
    4. Gigaseal गठन किया गया है एक बार, कम मौजूदा दालों (25-100 μsec, 1 वी) का उपयोग करें या टूटना कोशिका झिल्ली को नकारात्मक द्रव दबाव का संक्षिप्त दालों और पूरे सेल विन्यास प्राप्त.
    5. झिल्ली समाई, श्रृंखला प्रतिरोध और सील परीक्षण पल्स दौरान वर्तमान के लिए फिट घातीय वक्र से निर्धारित के रूप में इनपुट प्रतिरोध रिकार्ड. तब switc, एम्पलीफायर पर CpFast और CpSlow नियंत्रण का समायोजन करके समाई यात्रियों को छोटा करेंज पूरे सेल मोड में एम्पलीफायर, और एक फ्लैट वर्तमान तक समाई और प्रतिरोध क्षतिपूर्ति मुहर परीक्षण के दौरान मनाया जाता है. एक फ्लैट परीक्षण मुहर प्रतिक्रिया बनाए रखने के लिए समाई और प्रतिरोध नियंत्रण समायोजन, श्रृंखला प्रतिरोध मुआवजा (70% भविष्यवाणी ~ 70% सुधार) लागू करें.
    6. एम्पलीफायर में वर्तमान दबाना मोड में स्विच करें. आराम झिल्ली क्षमता (मौजूदा इंजेक्शन की अनुपस्थिति में) का ध्यान रखना. वांछित स्तर (जैसे -60 एम वी) पर झिल्ली क्षमता को स्थिर करने के लिए एक होल्डिंग मौजूदा सेट. पिपेट समाई बेअसर और वोल्टेज ड्रॉप संतुलन के लिए पुल शेष राशि को समायोजित.
    7. (, 300 मिसे अवधि 10 पीए चरणों में 10-200 पीए) वर्तमान depolarizing साथ उत्तेजक द्वारा न्यूरॉन की फायरिंग गुण की जाँच करें.
    1. न्यूरॉन के लिए अगले स्थिति में ऑप्टिकल फाइबर वापस ले जाएँ. एक सीसीडी कैमरे के लिए युग्मित इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, लक्ष्य न्यूरो के संबंध में फाइबर की स्थिति की छवियों पर कब्जाएन, ऑप्टिकल फाइबर (चित्रा 1 देखें) के शीर्ष किनारे पर तो शुरू में न्यूरॉन के विमान पर ध्यान दे, और.
    2. जिसके परिणामस्वरूप छवियों के बाद के विश्लेषण (जैसे आंकड़े -1 बी और -1 सी) द्वारा इसे ठीक Δ (लक्ष्य न्यूरॉन के केंद्र के लिए ऑप्टिकल फाइबर रिश्तेदार के ऊपरी छोर की स्थिति) निर्धारित करने के लिए संभव है. एक बार Δ में जाना जाता है, इस तरह के फाइबर अंत चेहरे से लक्ष्य न्यूरॉन (फाइबर अक्ष के साथ) z और किरण δ आर के केंद्र से न्यूरॉन के रेडियल विस्थापन के लिए दूरी के रूप में मानकों सरल त्रिकोणमितीय संबंधों का उपयोग कर की गणना की जा सकती है:
      Z = आर पाप 2θ + Δ क्योंकि θ
      δ आर = ((नि. क्योंकि 2θ - Δ पाप θ) 2 δy 2) 1/2,
      δy फाइबर अक्ष और ऊपर से देखा के रूप में न्यूरॉन के केंद्र के बीच की दूरी है जहां (उदाहरण सेई चित्रा 1).
      ये स्थान मापदंडों का सही ज्ञान उत्तेजना प्रक्रियाओं 25 के बीच संभव मतभेदों को दूर करने के लिए आवश्यक हो सकता है के रूप में विश्लेषण, सेल से सेल को खाते स्थितीय विविधताओं में रखना चाहिए.

4. आईएनएस प्रयोगों

  1. वर्तमान दबाना या वोल्टेज दबाना विन्यास या तो में electrophysiological डेटा रिकॉर्डिंग, वहीं वांछित मापदंडों (जैसे शक्ति, नाड़ी लंबाई, पुनरावृत्ति दर आदि) में उत्तेजना लेजर चलाते हैं. हमारे लेजर के साथ, ऑप्टिकल शक्ति लेजर चालक को एक प्रत्यक्ष निवेश के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है और प्रत्येक रिकॉर्डिंग से पहले मैन्युअल रूप से निर्दिष्ट किया जाता है. पल्स लंबाई और पुनरावृत्ति दर एक बाहरी संकेत जनरेटर या डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर (जैसा कदम 2.3.4 में वर्णित है) या तो द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है. डेटा पैच दबाना चैनल और लेजर ट्रिगर चैनल दोनों से दर्ज कर रहे हैं सुनिश्चित करें.

लेकर लंबाई के साथ लेजर दालोंलगभग 500 μsec से 15 मिसे और नाड़ी प्रति ~ 0.25-5 एम.जे. की ऊर्जा से आम तौर पर मध्यम श्रेणी का बिजली प्रतिक्रियाओं उपज. इसे इस पैरामीटर के प्रभाव को कम कर देंगे, क्योंकि 1 हर्ट्ज या कम होने की लेजर दालों की पुनरावृत्ति दर निर्धारित करना, प्रारंभिक प्रयोगों के लिए उपयोगी हो सकता है. दर्ज संकेत में परिवर्तन दिखा ठेठ परिणाम निम्न अनुभाग में प्रस्तुत कर रहे हैं.

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Representative Results

सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स वोल्टेज दबाना और वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग विन्यास दोनों में से repeatable waveforms के साथ लेजर रोशनी का जवाब. चित्रा 3a 2.5 मिसे, 0.8 एम.जे. लेजर पल्स (6 से औसत प्रतिक्रिया के जवाब में एक कोशिका झिल्ली भर में वर्तमान प्रवाह में विशिष्ट परिवर्तन से पता चलता है -70 एम वी, -60 एम वी और -50 एम वी में आयोजित झिल्ली क्षमता के साथ 1 सेकंड अंतराल) में दोहराया लेजर दालों,. नेट आवक धाराओं लगातार रोशनी नहीं रह गया है के बाद प्रारंभिक मूल्यों की ओर लौटने, लेजर दालों के जवाब में पैदा कर रहे हैं. लेजर प्रेरित धाराओं के आकार इसे आईएनएस अंतर्निहित प्रक्रियाओं की एक पूरी समझ पाने के क्रम में धारण क्षमता की एक सीमा में प्रयोगों का संचालन करने के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, यह दर्शाता है कि झिल्ली संभावित बदल रहा है के रूप में भिन्न करने के लिए देखा जा सकता है. इन प्रयोगों मौजूदा प्रोटोकॉल की मामूली संशोधन के साथ किया जाता है और इस तरह के आरोप वोल्टेज के रूप में स्थापित तकनीक (QV) विश्लेषण का उपयोग का विश्लेषण किया जा सकता है (सेइन विट्रो में आईएनएस से प्राप्त QV घटता के उदाहरण) के लिए ई संदर्भ 7.

चित्रा 3b में प्रस्तुत आंकड़ों को आम तौर पर एक 2.5 मिसे, 0.8 एम.जे. लेजर पल्स (प्रारंभिक झिल्ली संभावित-73mV, 4 हर्ट्ज की पुनरावृत्ति दर पर दिया 16 लेजर दालों के औसत) द्वारा पैदा की झिल्ली क्षमता में बदलाव के संकेत हैं. वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग नाड़ी के बाद आराम झिल्ली क्षमता की दिशा में एक लगभग घातीय कमी के बाद लेजर पल्स के पाठ्यक्रम पर एक स्थिर झिल्ली विध्रुवण दिखा. चित्रा 3b में उदाहरण भी लेजर पल्स के बाद एक छोटे से अतिरिक्त झिल्ली विध्रुवण दर्शाती है. शापिरो एट अल. 7 झिल्ली क्षमता में लेजर प्रेरित परिवर्तन बारीकी से तापमान में स्थानीय परिवर्तन (सेल का प्रत्यक्ष आसपास के क्षेत्र में यानी तापमान) से संबंधित हैं जो प्रदर्शन किया है. इसके अलावा, मॉडल थॉम्पसन एट अल द्वारा वर्णित है. 27कुछ संरेखण परिस्थितियों में, प्रबुद्ध क्षेत्र में अक्षीय और रेडियल तापमान ढ़ाल से उत्पन्न प्रसार बारीकी चित्रा 3b में दिखाया झिल्ली क्षमता में परिवर्तन जैसी स्थानीय तापमान परिवर्तनों को जन्म दे सकता है कि निर्धारित किया गया है. इन निष्कर्षों का एक परिणाम के रूप में, यह प्रकाश वितरण फाइबर के अंत में चेहरे के सापेक्ष लक्ष्य सेल की स्थिति झिल्ली क्षमता में लेजर पैदा की विविधताओं के समय के पाठ्यक्रम और अधिकतम तापमान दोनों का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि माना जाता है सेल के क्षेत्र में.

अत्यधिक ऊर्जा या तापमान में भारी वृद्धि के लिए जोखिम के साथ रोशन लक्ष्य न्यूरॉन को नुकसान हो सकता है. इस बार (एक अचानक एक स्थिर स्तर पर झिल्ली क्षमता बनाए रखने की आवश्यकता वर्तमान में वृद्धि हुई है, और / या संकेत के भीतर शोर और अस्थिरता में एक बड़ी वृद्धि जैसे) सेल बिजली के गुणों की गिरावट के माध्यम से देखा जा सकता है. चरम स्थिति मेंकोशिका मृत्यु लेजर जोखिम पर लगभग तुरंत होता है. चित्रा 4 एक 25 मिसे, 8 एम.जे. लेजर पल्स के लिए जोखिम से उत्पन्न एक सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन की मौत के एक वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग से पता चलता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. एक ठेठ सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन और ऑप्टिकल उत्तेजना प्रयोगों के दौरान ऑप्टिकल फाइबर और micropipette (जैसा कि ऊपर से देखा है) के सापेक्ष पदों दिखा चरण विपरीत छवियाँ. एक) ठेठ सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन. ख) की स्थिति में ऑप्टिकल फाइबर (छवि शीर्ष पर ध्यान केंद्रित किया है ऑप्टिकल फाइबर के किनारे) ग) सेल (नोट के सापेक्ष फाइबर स्थिति दिखा मढ़ा चित्र:. फाइबर के ऊपरी किनारे से थोड़ा सेल यानी Δ ऊपर है) नकारात्मक है. जैसा कि ऊपर, δ y और और डेल से देखाटा, फाइबर अक्ष से न्यूरॉन केंद्र के रेडियल विस्थापन और क्रमशः न्यूरॉन के केंद्र के लिए फाइबर के ऊपरी किनारे से दूर हैं. तीर सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन की स्थिति का संकेत मिलता है. स्केल सलाखों 20 माइक्रोन.

चित्रा 2
चित्रा 2. ऑप्टिकल उत्तेजना प्रयोगों के लिए प्रयोगात्मक स्थापना (नहीं पैमाने पर करने के लिए) के योजनाबद्ध इनसेट:. ऑप्टिकल फाइबर और लक्ष्य सेल के सापेक्ष microelectrode की स्थिति. θ, Δ और जेड के रूप में प्रोटोकॉल कदम 3.4.2 और 3.8.2 में परिभाषित कर रहे हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. एक) वोल्टेज दबाना (6 लेजर दालों delive से औसत प्रतिक्रिया1 हर्ट्ज की दर से लाल) और ख) वर्तमान दबाना (4 हर्ट्ज की दर से दोहराया 16 लेजर दालों से औसत प्रतिक्रिया) रिकॉर्डिंग झिल्ली में लेजर प्रेरित परिवर्तन 2.5 मिसे से रोशनी पर वर्तमान और झिल्ली क्षमता दिखा सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स से , 0.8 एम.जे. लेजर पल्स. छायांकित क्षेत्रों लेजर जोखिम के समय संकेत मिलता है. Insets अधिक विस्तार में लेजर रोशनी के दौरान प्रतिक्रियाओं दिखा. नोट: एक) में इनसेट -60 एम वी की एक झिल्ली क्षमता के साथ प्राप्त ट्रेस करने पर केंद्रित है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. एक जरूरत से ज्यादा ऊर्जावान (25 मिसे, 8 एम.जे.) लेजर पल्स के लिए जोखिम से उत्पन्न कोशिका मृत्यु दिखा वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग. ध्यान दें कि के आयामसंकेत ना में दिखाया गया है और 3 चित्र में दिखाया पीए धाराओं की तुलना में काफी बड़ा है.

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Discussion

इस पत्र में उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर इसे निकालने और संस्कृति सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स और पूरे सेल पैच दबाना प्रयोगों प्रदर्शन से लेजर पैदा बिजली की गतिविधि की जांच करने के लिए संभव है. इन विट्रो में इस्तेमाल किया, पैच दबाना तकनीक vivo में प्राप्त नहीं है कि प्रयोगात्मक मापदंडों पर नियंत्रण के एक स्तर प्रदान करता है. ऐसी तरंगदैर्ध्य, पल्स ऊर्जा, नाड़ी लंबाई, पल्स आकार, और नाड़ी पुनरावृत्ति दृश्यों के रूप में लेजर उत्तेजना मापदंडों एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सेटिंग में अध्ययन किया जा सकता है. इसके अलावा, न्यूरॉन्स रखा जाता है जो वातावरण में (उदाहरण के समाधान के तापमान, रासायनिक कारकों) यह संभव झिल्ली गुणों का अध्ययन और इसलिए अवरक्त तंत्रिका उत्तेजना अंतर्निहित तंत्र को बनाने, व्यवस्थित विविध किया जा सकता है. बिजली और ऑप्टिकल उत्तेजना तौर तरीकों के बीच बातचीत भी एक नियंत्रित तरीके से जांच की जा सकती है. ये मौलिक अध्ययन लचीला शुरू करने से अधिक उन्नत हो सकता हैuorescent जांच वैसे ईओण सांद्रता या गर्मी झटका प्रोटीन की अभिव्यक्ति के रूप में अतिरिक्त पैरामीटर पर नजर रखने के लिए. इन विभिन्न मापदंडों का एक स्पष्ट समझ घटना की पूरी समझ प्राप्त करने के लिए, लेकिन यह भी अनुकूलन प्रक्रिया के माध्यम से और अधिक कुशल उत्तेजना को प्राप्त करने के लिए ही महत्वपूर्ण नहीं है.

आईएनएस के तंत्र में तापमान द्वारा निभाई गई महत्वपूर्ण भूमिका के कारण 5-7, लेजर रोशनी के कारण स्थानीय हीटिंग का सही माप इस तंत्र 27 परिभाषित करने में सबसे ज्यादा महत्वपूर्ण है. एक खुला पैच विंदुक के माध्यम से बह वर्तमान रिकॉर्डिंग से कैलिब्रेटेड तापमान मापन प्राप्त करने की एक विस्तृत विधि 28. याओ एट अल द्वारा वर्णित और कई लेखकों द्वारा नियोजित, उन का वातावरण प्रतिनिधि में लेजर प्रेरित तापमान में परिवर्तन की भयावहता और समय पाठ्यक्रम निर्धारित करने के लिए किया गया है इन विट्रो (जैसे संदर्भ 7, 8 देखें) में पाया. प्रदान करनाघ प्रकाश वितरण फाइबर की स्थिति ठीक निर्धारित किया जा सकता है (वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग जैसे), तापमान माप की इस विधि ठेठ आईएनएस उत्तेजनाओं के कारण तापमान में स्थानीय परिवर्तन का सही मैपिंग सक्षम होने की संभावना है.

उत्तेजक लेजर की तरंग दैर्ध्य लेजर प्रेरित तापमान परिवर्तन (और इसलिए आईएनएस की अंतर्निहित तंत्र) पानी 7 की तरंग दैर्ध्य निर्भर अवशोषण विशेषताओं द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं के बाद से (के लिए थॉम्पसन एट अल. 25 देख, आईएनएस प्रयोगों में विचार किया जाना चाहिए कि एक पैरामीटर है उम्मीद की तरंग दैर्ध्य प्रभाव का विस्तृत चर्चा). इस के अलावा प्रोटोकॉल (इन्फ्रारेड तंत्रिका उत्तेजक, Optotech पी / एल), तरंग दैर्ध्य और लेजर संकुल की एक किस्म में इस्तेमाल किया 1,870 एनएम डायोड लेजर से अन्य लेखकों द्वारा इस्तेमाल किया गया है. मौजूदा आईएनएस प्रकाशनों में इस्तेमाल किया लेज़रों के कुछ सामान्य उदाहरण हैं: 1,840-1,940 एनएम 6,7,10,13 से लेकर तरंग दैर्ध्य के साथ Aculight से लेजर डायोड,16-18, Holmium: लेजर 1-2-3 6,11,12,14,15 से YAG लेसरों (2.12 मीटर), और एनएम 8 1,875 पर एनएम 5,8, 1,470 संचालन लेजर डायोड, और Sheaumann से 1,535 एनएम 8 लेजर.

सुसंस्कृत सर्पिल नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स के लिए इस तकनीक को लागू करने का एक संभावित दोष यह है कि न्यूरॉन्स (~ 10-15 माइक्रोन व्यास) के अपेक्षाकृत छोटे आकार के कारण कि है, रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड सीधे लेजर द्वारा प्रकाशित है. यह एक निश्चित सीमा से परे लेजर रोशनी रिकॉर्डिंग सर्किट 7 (यानी सील और पिपेट प्रतिरोध) के गुणों में परिवर्तन हो सकता है कि सुझाव दिया गया है. शापिरो एट अल. 7 लेजर शक्ति बढ़ा दिया गया था के रूप में 3 एम.जे. की एक सीमा पल्स ऊर्जा, ढूँढने QV घटता के पलटने की क्षमता में परिवर्तन की निगरानी के द्वारा इस सीमा से मापा. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में, यह w में सील और विंदुक के संयुक्त प्रतिरोध को मापने के द्वारा इस आशय का परिमाण निर्धारित करने के लिए संभव हो सकता हैहोल सेल मोड (एक 10 मिसे, 10 एम वी वोल्टेज स्पंद के लिए वर्तमान प्रतिक्रिया रिकॉर्डिंग से उदा) कोशिकी समाधान के तापमान जबकि अलग. पूरी तरह से आईएनएस के तंत्र को समझने के क्रम में, यह लेजर प्रेरित प्रतिरोध परिवर्तन मापा और ध्यान में रखा जाना है कि महत्वपूर्ण है.

अवरक्त तंत्रिका उत्तेजना विवो में शुरू किया गया है के विषय में प्रयोगात्मक कार्य के बहुमत तिथि करने के लिए. Vivo में अवरक्त उत्तेजना के लिए सूचना दी उज्ज्वल जोखिम थ्रेसहोल्ड कुछ भिन्नता है (चूहा sciatic नसों 1 के लिए 2.12 माइक्रोन से कम उदा 0.32 जेसीएम -2, <0.1 gerbil श्रवण नसों 18 के लिए 1.855 माइक्रोन से कम जेसीएम -2), वे के माध्यम से निर्धारित सीमाओं से काफी कम हैं इन विट्रो अध्ययन (जैसे माउस रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं और चूहे vestibular में नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं चूहे नवजात cardiomy के लिए -2 5,8, 8.3 जम्मू सेमी के लिए 1.875 माइक्रोन से कम लगभग 20 जेसीएम -2 मेंcytes 9). इस स्तर पर आईएनएस प्रक्रिया की जानकारी के लिए पर्याप्त रूप से अच्छी तरह से इस अंतर के कारण के बारे में अटकलें को समझ नहीं रहे हैं, लेकिन, इस तरह की बारीकी विवो काम में पिछले का लक्ष्य समान है कि श्रवण न्यूरॉन्स के रूप में इन विट्रो मॉडल में उपयोग कर एक विवरण खोजने में फायदेमंद हो सकता है .

इन विट्रो मॉडल में कुछ अन्य ऐसे शापिरो एट अल द्वारा इस्तेमाल किया Xenopus oocytes (~ 1 मिमी व्यास) के रूप में बड़ा कोशिकाओं शामिल है. 7 इन सेलुलर घटकों को प्रभावित कर रहे हैं कि जांच के क्रम में व्यक्ति की कोशिकाओं में आईएनएस की प्रभावशीलता में स्थानिक विविधताओं की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है उत्तेजना से. ऐसे लिपिड bilayer vesicles के रूप में सरल मॉडल इन विट्रो प्रयोगों में से प्रयोगात्मक मानकों पर भी अधिक सटीक नियंत्रण अनुमति दे सकता है, लेकिन इस तरह के मॉडल कुछ दायरे में सीमित कर रहे हैं और भारतीय नौसेना पोत की पूरी जटिलता प्रकट नहीं हो सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के संबंध परियोजना अनुदान LP120100264 तहत ऑस्ट्रेलियाई अनुसंधान परिषद द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips Lomb Scientific CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish VWR International 82050-542
Poly-L-ornithine solution Sigma-Aldrich P4957
Laminin Invitrogen 23017-015
Curved forceps WPI 14101 Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator ThermoScientific Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A Gibco 10888-022
N-2 supplement Invitrogen 17502-048
B27 serum-free supplement Invitrogen 17504-044
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140-148
L-Glutamine Invitrogen 25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Potassium D-gluconate Sigma-Aldrich G4500
EGTA Sigma-Aldrich E3889
Na2ATP Sigma-Aldrich A2383
MgATP Sigma-Aldrich A9187
NaGTP Sigma-Aldrich G8877
Potassium hydroxide LabServ BSPPL738.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich 310166
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Calcium chloride Sigma-Aldrich 383147
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
Sodium hydroxide LabServ BSPSL740.500
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope Zeiss AxioExaminerD1 Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective Zeiss W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage ThorLabs Burleigh Gibraltar
Recording chamber Warner Instruments RC-26G
Vibration isolation table TMC Micro-g 63-532
CCD Camera Diagnostic Instruments RT1200
Camera software Diagnostic Instruments SPOT Basic
In-line solution heater Warner SH-27B
Temperature controller Warner TC-324B
Patch clamp amplifier Molecular Devices Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system Molecular Devices Digidata 1440A
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-325
Micropipette glass Sutter Instruments GBF100-58-15 Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller Sutter Instruments P2000
Recording Software AxoGraph Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle Sigma-Aldrich CLS12201L 1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing Harvard PolyE #340
Masterflex peristaltic pump Cole-Parmer HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC) AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC) Thorlabs ADAFC2
Optical fiber cleaver EREM FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm) Siemens For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm) Siemens For removing outer coating of patch cord
Signal generator Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck Newport FPH-DJ
Laser power meter and detector head Coherent FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.

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References

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