लेजर प्रेरित एक्जॉन घाव के दौरान तनाव रिलीज के मापन piconewton और millisecond संकल्प पर सब्सट्रेट करने Axonal आसंजन का मूल्यांकन करने के लिए

Bioengineering

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Summary

हम आंशिक रूप से अक्षतंतु की झिल्ली का पालन एक ऑप्टिकली फंस जांच पर प्रदर्शन एक साथ बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप द्वारा एक लेजर चीड़फाड़ साथ lesioned था कि एक अक्षतंतु में तनाव जारी मापा. विकसित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल संस्कृति सब्सट्रेट करने के लिए अक्षतंतु आसंजन मूल्यांकन करता है.

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Vassalli, M., Basso, M., Difato, F. Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution. J. Vis. Exp. (75), e50477, doi:10.3791/50477 (2013).

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Abstract

एक विकासशील neuronal नेटवर्क में कार्यात्मक कनेक्शन के गठन बाह्य संकेतों से प्रभावित है. विकासशील न्यूरॉन्स की neurite विकास रासायनिक और यांत्रिक संकेतों के अधीन है, और जो व्यवस्था के द्वारा यांत्रिक संकेतों को यह होश और प्रतिक्रिया करता है खराब समझ रहे हैं. सेल परिपक्वता में सेना की भूमिका elucidating सब्सट्रेट करने के लिए कोशिका आसंजन और cytoskeletal युग्मन प्रोत्साहित कर सकते हैं कि scaffolds के डिजाइन सक्षम है, और इसलिए चोट के बाद पुनर्जीवित करने के लिए अलग neuronal प्रकार की क्षमता में सुधार होगा.

यहाँ, हम लेजर प्रेरित सेल घाव के दौरान एक साथ बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप लागू करने के लिए एक विधि का वर्णन है. हम अक्षतंतु की झिल्ली का पालन एक ऑप्टिकली फंस जांच का एक साथ interferometric ट्रैकिंग द्वारा आंशिक रूप से lesioned अक्षतंतु में तनाव रिहाई के उपाय. हमारे प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल piconewton संवेदनशीलता के साथ तनाव रिहाई का पता लगाता है, और कम तनाव रिहाई के गतिशीलमिलीसेकंड समय संकल्प. इसलिए, यह कोशिकाओं और substrates के बीच यांत्रिक युग्मन औषधीय उपचार और / या सब्सट्रेट के विशिष्ट यांत्रिक गुणों द्वारा ठीक किया जा सकता है कि कैसे अध्ययन करने के लिए एक उच्च संकल्प तरीका प्रदान करता है.

Introduction

ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी जीवित कोशिकाओं का निरीक्षण करने के लिए उपलब्ध कम इनवेसिव इमेजिंग प्रणाली में से एक है. ऐसे विकिरण दबाव (ऑप्टिकल चिमटी 1 के रूप में), या उच्च ऊर्जा फोटॉन प्रवाह (लेजर चीड़फाड़ 2 के रूप में) के रूप में प्रभाव के शोषण के साथ, इस तकनीक नैनो हेरफेर के लिए बढ़ा दिया गया था. ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली 3 कल्पना और उप सेलुलर लक्ष्य हेरफेर करने के लिए एक सटीक नियंत्रण प्रस्तुत. इसी समय, वितरित लेजर शक्ति का सही अंशांकन के लिए धन्यवाद, ऑप्टिकल उपकरण अभूतपूर्व reproducibility के साथ या तो मुलायम या आक्रामक नमूना हेरफेर पूरा.

कई प्रयोगशालाओं अलग कोशिकाओं 5 फ्यूज के साथ, या ऑप्टिकली प्रेरित कार्गो 6,7 द्वारा कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए organelles के 4, काटकर अलग करने के क्रम में एक ही प्रयोगात्मक सेटअप, ऑप्टिकल चिमटी और लेजर चीड़फाड़ में, एकीकृत. ऑप्टिकल चिमटी, ऑप्टिकल कठोरता की जांच के बाद, के लिए अनुमतिएक piconewton पैमाने पर सेल को लागू बल के नियंत्रण, लेजर विच्छेदन सिस्टम झिल्ली फोटो poration से उप सेलुलर संरचनाओं के एकल organelles या विच्छेदन की पृथक के बीच है, जो ऑप्टिकल हेरफेर, न्यूनाधिक कर सकते हैं. हालांकि, लेजर विच्छेदन अंशांकन मुख्य रूप से नमूना 8 से कारण morphological परिवर्तन को चित्रित छवि विश्लेषण के आधार पर नमूने लिए दिया ऊर्जा, के संबंध में ऑप्टिकल हेरफेर की इकाई का गुणात्मक मूल्यांकन पर निर्भर करता है. प्रस्तुत पद्धति में, हम piconewton पैमाने पर, यों के लिए, एक विकासशील न्यूरॉन की लेजर axonal विच्छेदन के दौरान बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन कैसे, एक उप सेलुलर डिब्बे 9 की cytoskeleton संरचना में एक बदल संतुलन द्वारा उत्पादित बल. सभ्य न्यूरॉन्स सब्सट्रेट का पालन करना, और विकास के दौरान फूट डालना. ध्रुवीकरण चरण में इन विट्रो में पहले पांच दिनों के दौरान होता है. स्तर पर ध्रुवीकरण की दो, extrud में से एकआईएनजी neurites के लंबे समय तक हो जाता है, और यह अक्षतंतु 10 बनने के लिए अलग होगा. विकास शंकु में रस्सा बल के जवाब में axonal बढ़ाव पहले Dennerl का मॉडल 11 से मॉडलिंग कर दिया गया है. हाल ही में, इस मॉडल बाह्य मैट्रिक्स substrates के लिए neurite आसंजन की भूमिका में शामिल करने के लिए 12 बढ़ा दिया गया है. प्रयोगात्मक टिप्पणियों के बाद 13 प्रस्तावित इस biophysical मॉडल,,, neurite साथ प्रचार, विकास शंकु पर बलों खींच सब्सट्रेट करने के लिए फोकल adhesions द्वारा संग्राहक हैं कि पता चला है. इसी तरह, axonal घाव सेल शरीर की ओर प्रचार तनाव की एक स्थानीय रिहाई पैदा करता है. इस प्रकार, हम घाव और सेल सोम के बीच अक्षतंतु साथ एक स्थान में इस तरह के जारी तनाव को मापने अप्रभावित फोकल adhesions की कमी लाने के परिणाम का आकलन करने की संभावना प्रदान करता है कि प्रस्ताव रखा.

हम प्रवृत्त axonal damag की हद तक नियंत्रित करने के लिए आवश्यक ऊर्जा लेजर चीड़फाड़ के फोटॉन प्रवाह जांचनाई, पूरी transection से आंशिक घाव को. अंशांकन के बाद, हम कई फर्क न्यूरॉन्स के axons को आंशिक घाव दोहराया और तनाव रिहाई यों के लिए प्रोटोकॉल विकसित की है, और इस प्रकार सब्सट्रेट 14 से अक्षतंतु के आसंजन अनुमान लगाने के लिए एक मात्रात्मक पैरामीटर प्राप्त की.

वर्तमान काम में, हम विस्तार से इस तरह के रासायनिक उपचार 14, या सेल संस्कृति समर्थन के विभिन्न प्रकार के रूप में विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों में सब्सट्रेट axonal आसंजन मूल्यांकन और piconewton संवेदनशीलता के साथ तुलना करने के लिए एक सटीक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है जो विकसित प्रोटोकॉल का वर्णन है.

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Protocol

1. ऑप्टिकल सेटअप

पूरे ऑप्टिकल प्रणाली में पहले 15 में वर्णित किया गया. संक्षेप में, ऑप्टिकल चिमटी प्रणाली 1064 एनएम (IPG लेजर GmbH) पर एक अटर्बियम निरंतर तरंग (CW) लेजर फाइबर परिचालन पर आधारित है. एक स्थानिक प्रकाश न्यूनाधिक (SLM) (LCOS-SLM, मॉडल X10468-07 - हमामात्सू) कंप्यूटर जनित होलोग्राम द्वारा संस्कृति पकवान पर फँसाने फोकस मौके की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए आने वाली आईआर लेजर बीम के चरण भिन्न होता है. आज़ादी से उपलब्ध ब्लू चिमटी सॉफ्टवेयर (उपकरण मेज पर वेब लिंक) उत्पन्न होलोग्राम स्थानिक प्रकाश न्यूनाधिक पर पेश किया. और एक photodiode (पीडी, PDA100A चुनाव आयोग - Thorlabs) - बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के लिए व्यकिकरणमीटर एक चार चतुर्थ भाग photodiode (हमामात्सू C5460SPL 6041 बोर्ड के साथ QPD, S5980) के आधार पर किया गया था.

355 एनएम (- टीम फोटोनिक्स PNV-001525-040, PowerChip नैनो पल्स यूवी लेजर) में YAG लेजर: लेजर विच्छेदन स्रोत एक स्पंदित उप nanosecond यूवी एन डी था. एक acousto-ऑप्टिक न्यूनाधिक (MQ110-A3-यूवी, सिलिका ए.ए. ऑप्टो इलेक्ट्रॉनिक जुड़े हुए 355 एनएम) नमूना के लिए दिया यूवी लेजर की शक्ति को नियंत्रित किया.

माइक्रोस्कोप के objective.The चरण एक 3 अक्ष रेखीय डीसी मोटर सूक्ष्म स्थिति से बना है सूई एक 60X, 0.9 एनए पानी के साथ सुसज्जित - स्वलिखित ऑप्टिकल चिमटी और लेजर माइक्रो चीड़फाड़ एक संशोधित ईमानदार माइक्रोस्कोप (ओलिंप BX51) पर एकीकृत किया गया के उप नैनोमीटर संकल्प के साथ नमूना के मोटे आंदोलन गठबंधन करने के लिए एक अलग 3 अक्ष पीजोइलेक्ट्रिक नैनो पोजीशनिंग मंच (पी 733.3DD, भौतिकी उपकरण) ले जाने प्रणाली (एम 126.CG1, भौतिकी उपकरण) piezo में मंच. खुर्दबीन मंच प्रणाली दो नियंत्रण के साथ सुसज्जित किया गया synergistically के चयनित काम मोड (स्थिर या गतिशील स्थिति या बल दबाना), 16 पर निर्भर करता है, सही स्थिति में फँसाने फोकस जगह बनाए रखने के लिए अभिनय छोरों. विशेष रूप से, एक आंतरिक प्रतिक्रिया पाश एक का चयन पर मनका रखने के लिए, एक piezoelectric मंच पर काम करता हैजाल केंद्र से एड दूरी. अन्य बाहरी पाश इसकी उपलब्ध स्ट्रोक 17 से एक बड़े क्षेत्र पर piezo में actuator द्वारा फैला क्षेत्र का दोहन करने के लिए मोटर चरण की स्थिति को नियंत्रित करता है. यह नमूना का पालन फंस मनका ट्रैकिंग है क्योंकि पीजो चरण एक दिशा में उपलब्ध स्ट्रोक की सीमा तक पहुँच जाता है, बाहरी पाश विपरीत दिशा में सूक्ष्म अवस्था चलता है, इस प्रकार पीजो अपनी केंद्रीय स्थिति की ओर ठीक हो जाए. पीजो चरण के अपने पाठ्यक्रम रेंज के मध्य स्थिति तक पहुँच जाता है, सूक्ष्म अवस्था रुका. प्रणाली के बारे में विस्तार Guiggiani एट अल 16,17 में रिपोर्ट कर रहे हैं.

एक पेल्टियर डिवाइस (टीसी-344B दोहरी चैनल हीटर नियंत्रक के साथ QE1 प्रतिरोधक हीटिंग - वार्नर उपकरण) खुर्दबीन (37 डिग्री सेल्सियस) के तहत सेल संस्कृति के तापमान को नियंत्रित करता है. संस्कृति में, पीएच और नमी एक कस्टम डिजाइन polydimethyl aerating द्वारा शारीरिक स्थिति में बनाए रखा गयाhumidified carbogen (95% 2 हे, 5% सीओ 2) के साथ siloxane (PDMS) आस्तीन (खुर्दबीन उद्देश्य को एकीकृत).

2. सेल संस्कृति तैयारी

सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल स्वास्थ्य इतालवी मंत्रालय द्वारा अनुमोदित किया गया. प्राथमिक संस्कृतियों भ्रूण दिन 18 (E18) पर चूहों की हिप्पोकाम्पी (C57BL6J, चार्ल्स नदी) से प्राप्त किया गया.

  1. न्यूरॉन्स गिलास नीचे पेट्री डिश पर 25,000 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता (- MATEK निगम P35G-0-14-सी) पर चढ़ाया गया. संवर्धित कोशिकाओं का कम एकाग्रता पहले से ही इन विट्रो में पहले दिन में एक घने नेटवर्क के गठन से बचने के लिए आवश्यक है. उल्लेख सेल एकाग्रता में, अन्य कोशिकाओं से जुड़ा नहीं है और एक लंबे समय तक neurite साथ अलग कक्षों पाने की संभावना काफी ज्यादा है.

3. मनका कोटिंग

  1. बहुलक microspheres (ँ 4 माइक्रोन, COOH-समाप्त-बैंग्स प्रयोगशालाओं, उत्पाद कोड PC05N/6700) पाली साथ लेपित किया गयापॉलीलिंक प्रोटीन युग्मन किट (Polysciences, उत्पाद कोड 19539) में वर्णित प्रक्रिया के बाद-डी lysine. मोती संस्कृति समर्थन और पक्ष कोशिकाओं आसंजन को कवर करने के लिए इस्तेमाल एक ही अणु के साथ लेपित हैं.

4. पृथक न्यूरॉन चुनें. संस्कृति सब्सट्रेट, जाल से एक मनका अलग करें और न्यूरॉन के लिए अगला यह कदम

  1. खुर्दबीन मंच पर संस्कृति पेट्री डिश में डाल दिया. मंच गति से नमूना पर ध्यान केंद्रित करने के बाद, Kohler रोशनी स्थापित करने के लिए रोशन उद्देश्य कंडेनसर की स्थिति सही है. Kolher रोशनी हालत सेट करने के लिए रोशनी प्रकाशिकी Aligning उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग गुणवत्ता में सुधार करने के लिए आवश्यक है. ऐसे संरेखण शर्तों का उपयोग करना, यह QPD और पीडी द्वारा अपने interferometric प्रदर्शन पर नज़र रखने के लिए, बिखरने फंस जांच से भी आईआर लेजर संग्रह क्षमता (उद्देश्य कंडेनसर के माध्यम से) को अधिकतम करने के लिए आवश्यक है.
  2. में लेपित microsphere शेयर समाधान के कुछ μl पिपेटसंस्कृति डिश के लिए. Microspheres जमा और संस्कृति सब्सट्रेट का पालन करना होगा. संस्कृति डिश में इंजेक्शन μl की संख्या स्टॉक समाधान की microsphere एकाग्रता पर निर्भर करता है. आदर्श स्थिति देखने के इमेजिंग क्षेत्र प्रति microspheres के एक और दो के बीच है. भी कई microspheres के संस्कृति डिश में शामिल कर रहे हैं, वे पहले से ही सभ्य न्यूरॉन्स को बेतरतीब ढंग से संलग्न कर सकते हैं.
  3. एक लंबे समय तक neurite (अक्षतंतु) के साथ एक अलग न्यूरॉन के लिए खोज, संस्कृति डिश में चारों ओर ले जाएँ, और खुर्दबीन मंच की स्थिति को बचाने के लिए.
  4. चारों ओर ले जाएँ और संस्कृति समर्थन का पालन एक मनका के लिए खोज करते हैं.
  5. आईआर फँसाने लेजर पर मुड़ें. इस स्तर पर, कोई होलोग्राम SLM पर पेश कर रहे हैं, और आईआर लेजर मौके की स्थिति यूवी लेजर मौके की स्थिति के साथ मेल खाता है. खुर्दबीन मंच गति से 2-3 माइक्रोन संस्कृति समर्थन सतह से ऊपर आईआर हाजिर, का अक्षीय स्थिति निर्धारित करें.
  6. कम से कम 1 μW को नमूना के लिए दिया यूवी लेजर सत्ता स्थापित.यूवी लेजर चीड़फाड़ पहले 14 calibrated किया गया है:
    5-6 μW कांच समर्थन ablated है
    4 μW एक neuronal कनेक्शन पूरी तरह से विच्छेदित है
    एक neurite आंशिक lesioned है 2.5 μW
    <1 μW एक सदमे की लहर संस्कृति डिश में उत्पादन किया है. ऑप्टिकल सदमे की लहर कांच समर्थन से मनका अलग करने के लिए पर्याप्त मजबूत है.
  7. पर आईआर लेजर जाते वक्त, यूवी लेजर पर मुड़ें, और खुर्दबीन मंच गति से पालन मनका ऊपर यूवी जगह चलते हैं. मनका सतह से detaches, और यह आईआर लेजर से फंस गया है. फिर, यूवी लेजर बंद कर देते हैं.
  8. कांच का समर्थन (20-30 माइक्रोन) ऊपर फंस मनका कई micrometers ले जाएँ. इस स्थिति के लिए मनका भारोत्तोलन यह पहले से चुना न्यूरॉन की ओर ले जाया जा रहा है, जबकि अन्य कोशिकाओं से संपर्क करने से रोकने जाएगा. पहले से बचाया चरण स्थिति को मनका लाओ. खींचें द्रव बल ऑप्टिकल जाल से अधिक नहीं है तो एक कम मूल्य (10 माइक्रोन / सेक) के लिए मंच गति सेट करेंपिंग बल.

5. कंप्यूटर जनित होलोग्राम द्वारा लेजर चीड़फाड़ स्पॉट और एक्जॉन स्थिति के संबंध में ट्रैप स्थान ले जाएँ, और ऑप्टिकल चिमटी कठोरता जांचना

  1. अक्षतंतु कल्पना करने के लिए कांच के समर्थन की ओर मनका ले जाएँ. मनका यह (लगभग 5 माइक्रोन गिलास समर्थन से ऊपर) के साथ संपर्क से बचने के लिए कक्ष के ऊपर आयोजित किया जाता है.
  2. अक्षतंतु की चौड़ाई के केंद्र पर यूवी फोकस जगह स्थानांतरित करने के लिए खुर्दबीन मंच हटो. वर्तमान चरण की स्थिति को बचाओ.
  3. कंप्यूटर जनित होलोग्राम द्वारा आईआर फोकस हाजिर स्थिति में ले जाएँ. इस चरण में, चरण पिछले चरण में चुना स्थिति में रुका है. कंप्यूटर जनित होलोग्राम SLM पर पेश किया जाता है, फंस मनका अक्षतंतु के लिए सम्मान के साथ ले जाया जाता है. हम भी उसी neurite पर केंद्रित यूवी लेजर स्थान के साथ, फंस मनका neurite के केंद्र पर गठबंधन करने के लिए आईआर लेजर हाजिर चाल. आईआर स्थान है और इस तरह फंस मनका neurite साथ तैनात कर रहे हैंदूर यूवी मौके से 5-10 माइक्रोन. हम neurite ज्यामिति के आधार पर यूवी स्थान के संबंध में भारतीय रेलवे की स्थिति के लिए कदम. ऑप्टिकल चिमटी एक SLM प्रणाली से सुसज्जित नहीं कर रहे हैं मामले में, स्थिति आईआर ऑप्टिकल पथ पर झुकने दर्पण, या ध्वनिक ऑप्टिक deflectors, से अलग किया जा सकता है. आईआर लेजर हाजिर अपने ब्राउनियन गति को प्रभावित करने और बल स्पेक्ट्रोस्कोपी निशान को बदल सकता है जो फंस जांच, साथ विदारक बीम का ऑप्टिकल बातचीत से बचने के लिए यूवी स्थान से दूर 5-10 माइक्रोन तैनात किया जा सकता है.
  4. यूवी हाजिर और अक्षतंतु स्थिति के संबंध में नई आईआर मौके की स्थिति को परिभाषित करने के बाद, दूर अक्षतंतु से फंस मनका की स्थिति और इसके साथ टकराव से बचने के लिए मंच के लिए कदम. कवर कांच ऊपर के बारे में 2 माइक्रोन तक फंस मनका के अक्षीय स्थिति हटो.
  5. केंद्र इस पर हस्तक्षेप किनारे करने QPD संरेखित: QPD केंद्रित है जब एक्स और वाई QPD अंतर संकेतों शून्य हैं. Interfero से फंस मनका के ब्राउनियन गति से 5 सेकंड के मोलमीटर, 50 हर्टज नमूना दर पर. बिजली स्पेक्ट्रम विधि 18 से ऑप्टिकल जाल की कठोरता (PN / एनएम) और संवेदनशीलता (वि / एनएम) प्राप्त करते हैं.

6. एक्जॉन को मनका संलग्न. Axotomy और एक साथ सेना के मापन प्रदर्शन करना

  1. कवर कांच ऊपर 4 माइक्रोन के बारे में फंस मनका स्थिति उठाएँ, और (3.2 कदम देखें) पहले से बचाया चरण की स्थिति के लिए यह कदम.
  2. अक्षतंतु की ओर फंस मनका नीचे ले जाएँ यह संपर्क neurite तक. फंस मनका और अक्षतंतु के बीच टक्कर अक्षीय दिशा में फंस मनका के विस्थापन का पता लगाने जेड QPD संकेत द्वारा नजर रखी है.
  3. फंस मनका के साथ 10 मिनट रुको neurite झिल्ली के लिए अपने आसंजन के पक्ष में अक्षतंतु के खिलाफ धक्का दिया.
  4. अक्षतंतु से फंस मनका विस्थापित करने के लिए सूक्ष्म अवस्था में ले जाएँ, और इस प्रकार की कोशिका झिल्ली को अपने आसंजन सत्यापित. मनका पालन करते हैं, तो यह ऑप्टिकल जाल से निकल जाता है.
  5. पालन ​​मनका पर लेजर जाल वापस ले जाएँऔर शून्य के बराबर बल शर्त के साथ बल दबाना पाश पर स्विच. ऐसे में, ऑप्टिकल जाल केंद्र पर, सेल से जुड़ी पीजो चरण repositions मनका,. प्रणाली एक राय पाश नियंत्रण नहीं है, लेजर जाल स्थिति पालन जांच पर केंद्र को खुर्दबीन मंच द्वारा ले जाया जा सकता है. QPD संकेतों मनका फंस और सेल (एक्स और शून्य के बराबर वाई QPD संकेतों, और z QPD संकेत चार quadrants के ही वोल्टेज राशि देता है का पालन नहीं कर रहा है के रूप में वही कर रहे हैं जब जाल के केंद्र पर पहुंच गया है के रूप में मनका) किसी भी सतह से दूर फंस जाता है.
  6. पालन ​​फंस जांच पर एक गुमान उत्पन्न करने के लिए, मनका के केंद्र के बारे में (100 एनएम) के ऊपर थोड़ा फँसाने लेजर स्थिति z अक्ष पर एक बल दबाना हालत, सेट करें. प्रणाली एक बल दबाना नियंत्रण के साथ सुसज्जित नहीं है मामले में, ऑप्टिकल जाल स्थिति खुर्दबीन मंच द्वारा 25 एनएम के इस कदम पर उठाया जा सकता है. जेड QPD संकेत निगरानी की अनुमति देता है. इसलिए, थी उपयोगएस पालन जांच के संबंध में लेजर जाल की स्थिति निर्धारित करने के लिए संकेत. इस तरह की पूर्व तनाव axonal घाव के बाद झिल्ली पर तनाव, और पालन जांच की ब्राउनियन गति के फलस्वरूप कमी भावना की जरूरत है. एक समान दृष्टिकोण वीडियो इमेजिंग 19 से एक झिल्ली पगहा में तनाव की रिहाई को मापने के लिए प्रस्तावित किया गया है.
  7. स्विच बंद की स्थिति दबाना हालत (पीजो चरण अवरुद्ध है) में पालन जांच पर बल मापने के लिए बल दबाना प्रतिक्रिया.
  8. लेजर axotomy के समय चूक उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग (20 हर्ट्ज फ्रेम दर) के दौरान व्यकिकरणमीटर (20 हर्टज नमूने आवृत्ति), और सेल के माध्यम से फंस जांच पदों की एक साथ रिकॉर्डिंग शुरू करें.
  9. एक घाव अक्षतंतु की छवि (. आमतौर पर 200-400 ऑप्टिकल दालों पल्स प्रति ऊर्जा की जरूरत है: 25 न्यू जर्सी) पर दिखाई हो जाता है जब तक कि लेजर दालों देने के लिए यूवी लेजर पर बारी है, तो यूवी लेजर बंद कर देते हैं.
  10. के बारे में 3 मील के लिए व्यकिकरणमीटर द्वारा रिकॉर्डिंग जारीएन, एक्स, वाई और जेड QPD निशान एक पठार तक पहुँचने.

7. कुल तनाव रिलीज यों

  1. नैनोमीटर में संबंधित निशान प्राप्त करने के लिए, ऑप्टिकल जाल से calibrated संवेदनशीलता द्वारा दर्ज QPD निशान (वोल्ट में) में कनवर्ट करें.
  2. 10 हर्ट्ज पर काट के साथ एक उच्च मार्ग फिल्टर द्वारा एक्स, वाई, जेड और विस्थापन निशान फ़िल्टर.
  3. फंस मनका के ब्राउनियन गति का प्रतिनिधित्व फ़िल्टर्ड निशान की कुल विचरण की गणना. 500 मिसे (10,000 डेटा अंक) 20 के समय खिड़कियों ओवरलैपिंग के लिए 25 मिसे कदम पर विचरण की गणना. निशान के फिल्टर उच्च मार्ग झिल्ली उतार - चढ़ाव या कॉर्टिकल actin के प्रस्ताव के कारण ब्राउनियन गति से परिवर्तन शामिल नहीं है. मनका के ब्राउनियन गति कोशिका झिल्ली पर ऑप्टिकल बलों और आसंजन बलों की कमी है. झिल्ली की वजह से इसकी चिपचिपाहट बढ़ जाती है तनाव की रिहाई, और इस तरह मनका के ब्राउनियन गति के तनावपूर्ण जाता है, तो तुरंत पता लगायाately axotomy के बाद, कम करने के लिए शुरू होता है.
  4. T0 परिभाषित करें: ब्राउनियन गति से विचरण की कमी की शुरुआत, यूवी लेजर ऊर्जा के वितरण के बाद. समय तत्काल t0 झिल्ली तनाव की शुरुआत का संकेत है.
  5. ब्राउनियन गति से विचरण (यह एक पठार तक पहुँच जाता है) की कमी के अंत: t1 परिभाषित करें. समय तत्काल t1 झिल्ली तनाव के अंत का संकेत है.
  6. बल माप के दौरान नमूने के किसी भी बहाव मापने के लिए, कांच कवर समर्थन पर मलबा या एक खरोंच की वीडियो ट्रैकिंग प्रदर्शन. कांच के समर्थन पर कण को ​​ट्रैक करने के लिए, हम पहली बार एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर सफेद में कण के साथ द्विआधारी छवियों का एक ढेर प्राप्त करने के लिए, उज्ज्वल क्षेत्र छवियों थ्रेसहोल्ड लागू होते हैं. फिर, हम उप पिक्सेल सटीकता (फ्रीवेयर ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग) के साथ बड़े पैमाने के कण केंद्र को ट्रैक.
  7. विस्थापन QPD निशान से मापा बहाव घटाएँ. संबंधित calibrated ऑप्टिकल कठोरता (कश्मीर एक्स, कश्मीर से बहाव को सही QPD निशान गुणा Z) piconewtons में FX, Fy, FZ निशान प्राप्त करने के लिए.
  8. के रूप में कुल बल का पता लगाने की गणना एफ मुन्ना = √ (FX + 2 Fy 2 Fz 2).
  9. के रूप में t0 और t1 के बीच बल की कुल रिहाई की गणना एफ रिहा = एफ मुन्ना (T1) - एफ मुन्ना (t0). यह जाल केंद्र से जांच के विस्थापन के कारण है क्योंकि t0 पर मापा बल, घटाया जाना है जब neurite को मनका का पालन करता है.
  10. फंस मनका और यूवी लेजर मौके की स्थिति के बीच neurite संपर्क क्षेत्र की गणना: फंस मनका और यूवी लेजर मौके की स्थिति के बीच neurite के उज्ज्वल क्षेत्र छवि उपाय पर लंबी (एल) और कम (डी) कुल्हाड़ियों. अक्षतंतु संपर्क क्षेत्र एक अक्षतंतु है = एल एक्स डी.
  11. द्वारा जारी कुल जारी बल एफ मानक के अनुसार अक्षतंतु संपर्क क्षेत्र एक अक्षतंतु.

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Representative Results

सेल अपने फोकल adhesions द्वारा सब्सट्रेट पर कर्षण बल उत्पन्न करता है. Cytoskeletal तत्वों द्वारा उत्पन्न फोर्स संस्कृति सब्सट्रेट का प्रतिकार बल के साथ संतुलन में हैं. Neurite की लेजर प्रेरित घाव के बाद, तनाव cytoskeleton के तारों के कुछ बाधित कर रहे हैं और सब्सट्रेट आसंजन के विरोध बल समाप्त हो रहा है क्योंकि उनके equilibrated तनाव जारी है. जारी तनाव आंशिक रूप से अप्रभावित फोकल adhesions पर वितरित की, और एक ऑप्टिकल जाल में आयोजित कोशिका झिल्ली, से जुड़ी मनका, (योजनाबद्ध चित्रा 1 देखें) सब्सट्रेट करने के लिए सेल प्रस्तोता cytoskeletal तत्वों द्वारा counteracted नहीं ऐसे रिहाई के हिस्से के उपाय कर रहा है .

हम चित्रा 2, ऊपर वर्णित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के एक प्रतिनिधि के परिणाम में, रिपोर्ट. न्यूरॉन, चित्रा 2a बाएं पैनल में, फर्क n के अक्षतंतु को दिखाता है, जो एक लंबे समय तक neurite, प्रस्तुतeuron. चित्रा 2a सही पैनल में, एक ही न्यूरॉन प्रेरित axonal घाव (सफेद तीर द्वारा इंगित) के बाद दिखाया गया है. चित्रा 2b एक्स, वाई, जेड और दिशाओं में दर्ज मनका विस्थापन निशान से पता चलता है. चित्रा 2c एक खरोंच की वीडियो ट्रैकिंग रिपोर्ट कांच के समर्थन पर, खाते में लेने के लिए माप के दौरान मंच बहाव को समाप्त.

चित्रा 3a में, बाईं पैनल पर, हम lesioned neurite, और हम तनाव रिलीज माप के दौरान neurite व्यास की kymograph गणना जहां सफेद रेखा नदी के ऊपर घाव साइट में दिखा. सही पैनल पर kymograph neurite व्यास थोड़ा तुरंत घाव के बाद बढ़ जाती है, और फिर सेल सोम ओर तनाव की रिहाई की वजह से पतली हो जाती है, दिखा कैसे है. चित्रा 3b में, हम kymograph परिणाम यों. हम आटा तैनात बाद neurite पृष्ठभूमि के संबंध में उज्जवल दिखाई देता हैउद्देश्य का ध्यान केंद्रित केंद्र में मनका ched, और इसलिए अक्षतंतु ध्यान के थोड़ा बाहर है. दरअसल, समय चूक वीडियो रिकॉर्डिंग की हर फ्रेम में kymograph रेखा के साथ पिक्सेल तीव्रता का योग रिपोर्ट करके, हम तनाव की रिहाई के दौरान neurite व्यास के एक अनुमान प्राप्त करते हैं. पैनल -3 सी को, हम तनाव रिलीज के दौरान संलग्न मनका की कुल विचरण रिपोर्ट, उच्च मार्ग 10 हर्ट्ज कट ऑफ आवृत्ति पर छानने के बाद व्यकिकरणमीटर (चित्रा 2b में) द्वारा दर्ज निशान के आधार पर गणना की थी. हम विचरण घाव साइट के अपस्ट्रीम सामग्री का संचय दौरान neurite व्यास के साथ बढ़ जाती है कि निरीक्षण कर सकते हैं. फिर, विचरण झिल्ली तनावपूर्ण है जब (चित्रा -3 सी में t0 पर) में कमी करने के लिए शुरू होता है, और neurite व्यास भी कम हो जाती है. विचरण कमी तनाव जारी रहता है जब एक पठार (चित्रा -3 सी में t1 पर), पहुँचता है. T1 के बाद, ब्राउनियन गति को बढ़ाने के लिए शुरू होता है क्योंकिएक्सोसाइटोसिस 21 (चित्रा -3 सी देखें) के लिए संभवतः कारण झिल्ली विश्राम की.

चित्रा -4 ए, सफेद बॉक्स neurite संपर्क क्षेत्र संस्कृति समर्थन के साथ एक अक्षतंतु के आकलन इंगित करता है. एक अक्षतंतु यूवी लेजर हाजिर स्थिति और फंस जांच के केंद्र के बीच की गणना की जाती है. चित्रा calibrated संबंधित द्वारा बहाव को सही QPD विस्थापन निशान (चित्रा 2b में) गुणा करने के बाद प्राप्त कुल जारी बल एफ के आयाम का पता लगाने जारी 4b रिपोर्टों ऑप्टिकल जाल कठोरता (कश्मीर एक्स, कश्मीर वाई, कश्मीर Z). हम समय t1 और t0 (चित्रा 4b में ΔpN) में मापा बल के बीच अंतर की गणना, और फिर हम पी.एन. / माइक्रोन 2 के संदर्भ में जारी तनाव को प्राप्त करने के लिए, एक अक्षतंतु से विभाजित.

नमूने में अलग न्यूरॉन्स पर ही प्रोटोकॉल को दोहराने से, हम शुरू कर सकते हैंकई संस्कृतियों पर प्रयोगों का सत्र रासायनिक कारकों के साथ इलाज या अलग समर्थन पर चढ़ाया, और अंत में अलग प्रयोगात्मक शर्तों में प्राप्त औसत मूल्य की तुलना करें. चित्रा 5 में, हम axonal घाव के बाद तनाव की रिहाई सब्सट्रेट पर फोकल adhesions से घटा है दिखाने के लिए, इस प्रकार एक उच्च तनाव रिहाई मूल्य एक अक्षतंतु कम सब्सट्रेट से पालन करने का मतलब है. हम एक आंशिक, और पूरा नहीं, अक्षतंतु के घाव प्रेरित है, क्योंकि हम वितरित कुल ऊर्जा पर मापा तनाव रिहाई की निर्भरता की जांच की, और घाव साइट और फंस मनका के बीच neurite संपर्क क्षेत्र पर. हम प्रकाश दालों के एक उच्च संख्या देने से अधिक cytoskeletal तत्वों को नष्ट कर, और फलस्वरूप तनाव का एक उच्च रिहाई के लिए प्रेरित करने की मांग की. अन्यथा, एक बढ़ा neurite संपर्क क्षेत्र के साथ, हम तनाव रिहाई की कम मात्रा को मापने के लिए उम्मीद. चित्रा 5 में, हम दो उपर्युक्त मानकों पर निर्भरता है कि दिखानेस्पष्ट नहीं. , एक ही खुर्दबीन उद्देश्य और एक ही ऊर्जा का उपयोग करते समय भिन्न नहीं है जो पृथक हाजिर 8, के आयाम से संबंधित है, इसलिए हम प्रेरित आंशिक घाव (प्रोटोकॉल 4.5 कदम देखने नाड़ी प्रति पहले से calibrated कम ऊर्जा के साथ) कि deduced नमूना प्रति पल्स. यह अच्छी तरह से इस तरह के मापदंडों सब्सट्रेट करने के लिए कोशिका आसंजन का एक अच्छा अनुमान का प्रतिनिधित्व नहीं करते कि जाना जाता है क्योंकि फोकल adhesions का केवल 1% पर कब्जा के रूप में इसके अलावा, तनाव की रिहाई संपर्क क्षेत्र के लिए सहसंबद्ध नहीं है कि तथ्य यह है, आश्चर्य की बात नहीं है बेसल सतह 22.

चित्रा 1
चित्रा 1. लेजर axotomy के दौरान बाधित cytoskeleton के संतुलन की चित्रमय प्रतिनिधित्व. एक सेल फोकल adhesions से एक सब्सट्रेट का पालन करता है. नीले तीर हैcytoskeletal तत्वों (स्प्रिंग्स द्वारा इंगित) द्वारा उत्पन्न कर्षण बलों pecify. हल्के नीले तीर कठोर संस्कृति सब्सट्रेट द्वारा उत्पन्न प्रतिकार बलों का संकेत मिलता है. एक सरल परिदृश्य में, घाव से पहले, cytoskeletal और सब्सट्रेट बलों बनती और equilibrated रहे हैं. Neurite की लेजर प्रेरित घाव के बाद, कुछ स्प्रिंग्स और सब्सट्रेट के बीच कनेक्शन बाधित कर रहे हैं. इस प्रकार, सब्सट्रेट cytoskletal तत्व के कर्षण बल का प्रतिकार नहीं रह गया है. फंस मनका, झिल्ली से जुड़ी, जारी cytoskeleton बलों की दिशा पटरियों.

चित्रा 2
चित्रा 2. एक, मनका फंस लेजर प्रेरित घाव के दौरान एक हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन अक्षतंतु की झिल्ली से जुड़ी. (एक) उज्ज्वल क्षेत्र के interferometric ट्रैकिंग छवियों को एक अक्षतंतु की पृथक दौरान प्राप्त कर लिया. बाईं पैनल पर घाव से पहले. सही पैनल पर घाव के बाद. एक पाली-D-लाइसिन लेपित मनका झिल्ली (POLYSTIRENE मनका, 4 माइक्रोन Ø) से जुड़ी है और एक ऑप्टिकल जाल में आयोजित किया जाता है. नमूने में आईआर लेजर का औसत बिजली 14 मेगावाट है. व्हाइट तीर घाव साइट को इंगित करता है. बार 5 माइक्रोन है. ऑप्टिकल जाल में मनका स्थिति के पीछे फोकल हवाई जहाज़ इंटरफेरोमेट्री द्वारा (ख) रिकॉर्ड निशान. नीले, हरे और लाल निशान के क्रमशः, एक्स, वाई, जेड और कुल्हाड़ियों साथ मनका स्थिति का प्रतिनिधित्व करते हैं. नमूना दर 20 kHz है. (ग) वीडियो ट्रैकिंग द्वारा मापा संस्कृति के समर्थन पर एक खरोंच के विस्थापन चरण के बहाव पर नजर रखने के लिए. नीले और हरे निशान वीडियो ट्रैकिंग द्वारा प्राप्त एक्स और वाई पदों पर रहे हैं. फ्रेम दर 5.5 हर्ट्ज है.

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चित्रा 3. तनाव रिलीज के दौरान अक्षतंतु व्यास, और lesioned अक्षतंतु की झिल्ली तनाव का विश्लेषण. बाईं पैनल पर lesioned अक्षतंतु (क) उज्ज्वल क्षेत्र छवि,. अक्षतंतु को सफेद लाइन सीधा एक kymograph गणना है जहां स्थिति को दर्शाता है. नदी के ऊपर घाव साइट के अक्षतंतु व्यास का सही पैनल पर, kymograph,. Kymograph की प्रत्येक पंक्ति में 0.18 सेकंड से मेल खाती है. (ख) तनाव रिलीज के दौरान अक्षतंतु व्यास के एक अनुमान का प्रतिनिधित्व kymograph की प्रत्येक पंक्ति के पिक्सेल तीव्रता का योग. (ग) मनका के ब्राउनियन गति की कुल विचरण से जुड़ी अक्षतंतु (t0 और t1 क्रमशः विच्छेदन के बाद अक्षतंतु में शुरुआत और तनाव रिहाई के अंत का संकेत).

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4 चित्रा. Axotomy के बाद जारी तनाव की मात्रा. Lesioned अक्षतंतु (क) उज्ज्वल क्षेत्र छवि. सफेद बॉक्स घाव साइट और फंस मनका के केंद्र के बीच neurite संपर्क क्षेत्र के अनुमान को इंगित करता है. (ख) axotomy (एफ मुन्ना = √ (FX + 2 Fy 2 Fz के बाद मापा बल की कुल आयाम की ट्रेस 2)). Fx, Fy, और FZ विस्थापन निशान चित्रा 2b में दिखाए गए हैं जहां हूक के कानून (एफ = kx) द्वारा गणना की गई. ऑप्टिकल जाल के तीन ओर्थोगोनल दिशाओं में stiffnesses, बिजली स्पेक्ट्रम विधि (कश्मीर एक्स, वाई = 7.9 पी.एन. / माइक्रोन, कश्मीर Z = 2.3 पी.एन. / माइक्रोन) द्वारा गणना की गई. ΔpN समय instants t0 और t1 के बीच मापा जारी की शक्ति को दर्शाता है.

चित्रा 5 चित्रा 5. नमूना के लिए दिया ऊर्जा की मात्रा को मापा तनाव रिहाई की निर्भरता, और neurite संपर्क क्षेत्र पर. 3 DIV पर माउस hippocamapal न्यूरॉन्स के axons पर प्रदर्शन 26 प्रयोगों से डेटा. Neurite संपर्क क्षेत्र बनाम तनाव रिहाई की (एक) स्कैटर साजिश घाव और फंस मनका स्थानों के बीच. तनाव रिहाई बनाम नमूना neurite संपर्क क्षेत्र के लिए दिया ऊर्जा की कुल राशि का (ख) स्कैटर साजिश.

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Discussion

हम इस काम में लेजर प्रेरित सेल घाव के दौरान एक साथ बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप प्रदर्शन करके, संस्कृति सब्सट्रेट neurite आसंजन तुलना करने के लिए एक मात्रात्मक विधि की रिपोर्ट. तनाव से मापा रिहाई सब्सट्रेट करने के लिए सेल के आसंजन की डिग्री से संबंधित है: फोकल adhesions के एक उच्च संख्या के साथ कोशिकाओं को कम तनाव जारी करना चाहिए. Piconewtons के मामले में तनाव की रिहाई मापने विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के 14 में संस्कृति का समर्थन करने के लिए axonal आसंजन का मूल्यांकन करने के लिए है जिसके द्वारा एक भौतिक मात्रा प्रदान करता है.

कई प्रयोगशालाओं अलग ऑप्टिकल डिजाइन 23 अपनाने, एक ऑप्टिकल चिमटी प्रणाली के साथ एक लेजर चीड़फाड़ एकीकृत. हमारा चुनाव तय ऑप्टिकल पथ और खुर्दबीन मंच गति के साथ एक सेटअप किया गया. यह पूरा करने के लिए, हम यूवी लेजर की स्थिति के संबंध में फँसाने जगह स्थानांतरित करने के लिए आईआर लेजर किरण पथ में एक स्थानिक प्रकाश न्यूनाधिक परिचय. हालांकि galvanometrआईसी दर्पण नमूना चलते बिना लेजर फोकस स्थिति स्टीयरिंग अनुमति देते हैं, वे बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप को प्रभावित करने की प्रणाली में यांत्रिक शोर लागू कर सकते हैं. ब्राउनियन गति विश्लेषण ऑप्टिकल कठोरता की एक तेजी से फिर से अंशांकन परमिट के बाद से इसके अलावा, हम नमूने में फिर से स्थिति आईआर लेजर ध्यान केंद्रित करने का फैसला किया. नमूना पर यूवी लेजर हाजिर स्थिति आगे बढ़ते ही अपनी केंद्रीय स्थान से बीम के छोटे विस्थापन के लिए नगण्य हैं जो यूवी फोकस जगह ही है, की गुणवत्ता को प्रभावित गोलाकार aberrations उत्पादन कर सकते हैं. इसलिए, लेजर चीड़फाड़ की ऑप्टिकल गुणों के संशोधन इकाई को नुकसान बनाम वितरित लेजर बिजली के एक नए सिरे से अंशांकन की आवश्यकता सकता है.

बल स्पेक्ट्रोस्कोपी माप करके, हम तनाव रिलीज के कुछ ही सेकंड के लिए एक तेजी से चरण, और सेकंड के कुछ दसियों पिछले सकता है कि एक धीमी चरण का बना है कि निरीक्षण कर सकता. जैसा कि कभी कभी पिछले काम के 14, धीमी गति में सूचना दीचरण कुछ मिनट पिछले सकता है. कारण है कि, हम संस्कृति के समर्थन पर एक खरोंच ट्रैकिंग वीडियो द्वारा बल माप सही करने के लिए किया था. भविष्य में, एक बेहतर दृष्टिकोण कवर कांच से जुड़ी एक मनका का वीडियो या interferometric ट्रैकिंग द्वारा खुर्दबीन मंच स्थिति स्वत: ठीक हो जाती है जो एक प्रतिक्रिया पाश, के साथ मंच बहाव को रद्द करने के लिए किया जाएगा. विन्यास के इस प्रकार के पहले से ही साहित्य में सूचना दी, संलग्न मनका पर केंद्रित एक दूसरे लेजर बीम की आवश्यकता है, और उप नैनोमीटर परिशुद्धता 24,25 साथ मंच स्थिरीकरण सुनिश्चित करता है.

भविष्य में, हम भेदभाव के विभिन्न चरणों में संस्कृति का समर्थन करने के लिए axonal आसंजन तुलना करने के लिए और विभिन्न रोग की स्थिति में औषधीय उपचार के लिए एक मात्रात्मक परख प्रदान करने के लिए विकसित प्रोटोकॉल लागू करना चाहते हैं. इसके अलावा, एक ही प्रोटोकॉल अलग यांत्रिक सामग्री के साथ विभिन्न प्रकार के neuronal आसंजन तुलना करने के लिए, प्रत्यारोपण scaffolds के डिजाइन करने के लिए आवेदन कर सकता हैanical या रासायनिक गुणों 26.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

वास्तविक समय नियंत्रण प्रणाली, व्यावहारिक विचार विमर्श, गियाकोमो Pruzzo और एलेसैंड्रो Parodi कस्टम इलेक्ट्रॉनिक्स और सॉफ्टवेयर के विकास के लिए, और क्लाउडिया Chiabrera और उनके विशेषज्ञ सलाह और सेल संस्कृति तैयार करने में सहायता के लिए मरीना Nanni के लिए Evelina Chieregatti और ​​Hanako Tsushima के विकास के लिए अल्बर्टो Guiggiani.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated Bangs laboratories PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit Polyscience 19539
EQUIPMENT
IR laser IPG Laser GmbH YLM-5-SC-LP ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator Hamamatsu LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software Optics group, University of Glasgow Free downloadable software http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ Hamamatsu Free downloadable software http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD Thorlabs S5980 with C5460SPL 6041 board Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD Teem Photonics PDA100A-EC Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser AA-optoelctronics PNV-001525-040 Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator Olympus MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope Andor BX51 Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD Warner Instruments V887ECSUVB EMCCD
Peltier device Physic Instruments QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage National Instruments Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq NI PCI-6229 Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop

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References

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