Medición de la tensión de salida durante Laser Induced Axon lesión axonal a evaluar la adhesión al sustrato en picoNewton y Millisecond Resolución

Bioengineering

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Summary

Se midió la liberación de la tensión en un axón que fue parcialmente lesionada con un disector de láser por la medición simultánea de espectroscopia de fuerza se realiza en una sonda ópticamente atrapado adherido a la membrana del axón. El protocolo experimental desarrollado evalúa la adhesión axón al sustrato de cultivo.

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Vassalli, M., Basso, M., Difato, F. Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution. J. Vis. Exp. (75), e50477, doi:10.3791/50477 (2013).

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Abstract

La formación de conexiones funcionales en una red neuronal en desarrollo está influido por las señales extrínsecas. El crecimiento de axones de las neuronas en desarrollo está sujeto a las señales químicas y mecánicas, y los mecanismos por los que se detecta y responde a señales mecánicas, son poco conocidos. La elucidación del papel de las fuerzas en la maduración de las células permitirá el diseño de los andamios que puede promover la adhesión celular y del citoesqueleto de acoplamiento al sustrato, y por lo tanto mejorar la capacidad de los diferentes tipos neuronales para regenerarse después de una lesión.

Aquí se describe un método para aplicar medidas de espectroscopia de fuerza simultáneas durante la lesión celular inducida por láser. Medimos liberación de la tensión en el axón parcialmente lesionada por el seguimiento interferométrico simultánea de una sonda atrapada ópticamente adherido a la membrana del axón. El protocolo experimental detecta la liberación de la tensión con la sensibilidad picoNewton, y la dinámica de la liberación de la tensión enresolución de tiempo de milisegundos. Por lo tanto, ofrece un método de alta resolución para estudiar cómo el acoplamiento mecánico entre las células y los sustratos puede ser modulada por el tratamiento farmacológico y / o por las propiedades mecánicas distintas del sustrato.

Introduction

Microscopía óptica es uno de los sistema de imagen menos invasivo disponible para observar las células vivas. Con la explotación de efectos tales como la presión de la radiación (como en pinzas ópticas 1), o flujo de fotones de alta energía (como en láser disector 2), esta tecnología se extendió a nano-manipulación. El sistema de imagen óptica proporciona un control preciso de visualizar y manipular dianas celulares sub 3. Al mismo tiempo, gracias a la calibración precisa de la potencia del láser emitido, herramientas ópticas lograr ya sea suave o manipulación de la muestra invasiva con una reproducibilidad sin precedentes.

Varios laboratorios integrados, en la misma configuración experimental, pinzas ópticas y disector de láser con el fin de realizar la ablación orgánulos 4, se fusionen entre sí diferentes células 5, o para estimular las células por impulsado ópticamente cargas 6,7. Si bien las pinzas ópticas, después de la calibración de la rigidez óptica, permitenel control de la fuerza aplicada a la celda en una escala picoNewton, sistemas de disección láser puede modular la manipulación óptica, que se extiende desde la membrana foto-poración a la ablación de orgánulos individuales o disección de las estructuras subcelulares. Sin embargo, la calibración de la disección con láser se basa en la evaluación cualitativa de la entidad de manipulación óptica con respecto a la energía entregada a la muestra, basado principalmente en el análisis de imagen que ilustra los cambios morfológicos causados ​​a la muestra 8. En el método presentado, nos demuestran cómo realizar mediciones de espectroscopia de fuerza durante la disección láser axonal de las neuronas en desarrollo, para cuantificar, en la escala picoNewton, la fuerza producida por una alteración del equilibrio en la estructura del citoesqueleto de un compartimiento subcelular 9. Neuronas cultivadas se adhieren al sustrato, y polarizan durante el desarrollo. La fase de polarización se produce durante los primeros cinco días in vitro. En la etapa dos de polarización, una de las extruidoción neuritas se hace más largo, y se diferencian para convertirse en el axón 10. Elongación axonal en respuesta a la fuerza de tracción en el cono de crecimiento se ha modelado previamente por el modelo de Dennerl 11. Recientemente, este modelo se ha ampliado para incluir 12 el papel de la adhesión de neuritas a los sustratos de matriz extracelular. Este modelo biofísico, propuesto después de observaciones experimentales 13, mostró que fuerzas de tracción en el cono de crecimiento, la propagación a lo largo de la neurita, son moduladas por las adhesiones focales al sustrato. Del mismo modo, lesión axonal produce una liberación local de la propagación de la tensión hacia el cuerpo de la célula. Por lo tanto, se propuso que la medición de tal tensión liberada en un lugar a lo largo del axón entre la lesión y el soma celular ofrece la posibilidad de evaluar el resultado de amortiguación de las adhesiones focales no afectadas.

Calibramos la energía necesaria fotón de flujo del disector de láser para controlar la extensión de la damag axonal infligidae, de transección completa a lesión parcial. Después de la calibración, se repitió lesión parcial a los axones de varias diferenciación de las neuronas y el protocolo desarrollado para cuantificar la liberación de la tensión, y por lo tanto obtuvimos un parámetro cuantitativo para estimar la adherencia del axón al sustrato 14.

En el presente trabajo se describe en detalle el protocolo desarrollado, lo que representa un procedimiento experimental precisa para evaluar y comparar con la sensibilidad picoNewton la adhesión axonal al sustrato en diferentes condiciones experimentales, tales como el tratamiento químico 14, o diferentes tipos de soporte de cultivo celular.

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Protocol

1. Configuración óptica

El sistema óptico entero fue descrito anteriormente 15. En pocas palabras, el sistema de pinzas ópticas se basa en una onda continua de iterbio (CW) de fibra láser que opera a 1.064 nm (IPG Laser GmbH). Un modulador espacial de luz (SLM) (LCOS-SLM, modelo X10468-07 - Hamamatsu) varía la fase de la entrada del haz láser IR para controlar la posición del punto de enfoque de captura en la placa de cultivo por ordenador hologramas generados. Los Blue-pinzas de software (enlace web en la mesa de los equipos) hologramas generados libremente disponibles proyectados en el modulador espacial de luz. El interferómetro de medidas de espectroscopia de fuerza se basaba en un fotodiodo de cuatro cuadrantes (QPD, S5980 con C5460SPL 6041 bordo - Hamamatsu) y un fotodiodo (PD, PDA100A-EC - Thorlabs).

La fuente de la disección láser fue un pulso sub-nanosegundo UV Nd: YAG a 355 nm (PNV-001525-040, PowerChip nano-Pulse UV laser - Teem Photonics). Un acústico-modulador óptico (MQ110-A3-UV, 355 nm de sílice fusionados-AA-opto-electrónica) controla la potencia del láser UV entregado a la muestra.

El holográfica pinzas ópticas y láser micro-disector se integraron en un microscopio vertical modificado (BX51 - Olympus) equipado con un 60X, 0,9 NA etapa de la inmersión en agua objective.The del microscopio se compone de un eje lineal 3-motor de corriente continua de micro-posicionamiento sistema (M-126.CG1, Física-Instruments) que lleva una etapa de nano-posicionamiento piezoeléctrico 3-eje por separado (P-733.3DD, Física-Instruments) para combinar el movimiento grueso de la muestra con una resolución sub-nanométrica del piezo- etapa. El sistema de platina del microscopio estaba equipado con dos lazos de control que actúa sinérgicamente para mantener el punto de enfoque de captura en la posición correcta, en función del modo de trabajo seleccionado (posición o fuerza de sujeción, estática o dinámica) 16. En particular, un circuito de retroalimentación interna actúa en una etapa piezoeléctrico, para mantener el talón en un selectoed distancia desde el centro de la trampa. El otro bucle externo controla la posición de la platina motorizada para explotar la región abarcada por el piezo-actuador en un área más grande que su carrera disponible 17. Cuando la etapa de piezo-alcanza el límite de la carrera disponible en una dirección, el bucle externo se mueve la etapa de micro en la dirección opuesta, por lo tanto el piezoeléctrico se recupera hacia su posición central porque es el seguimiento de la perla atrapado adherido a la muestra. Cuando la etapa de piezo-llega a la posición central de su gama supuesto, la etapa de micro detuvo. Otros detalles del sistema se presentan en la Guiggiani et al 16,17.

Un dispositivo Peltier (QE1 calentamiento resistivo calentador con controlador de doble canal TC-344B - Warner Instruments) controla la temperatura del cultivo celular bajo el microscopio (37 ° C). En el cultivo, el pH y la humedad se mantuvieron en condiciones fisiológicas aireando un polidimetil de diseño personalizadosiloxano (PDMS) manga (integrando el objetivo del microscopio) con carbógeno humidificado (95% O 2, 5% de CO 2).

2. Cultivo de células Preparación

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Ministerio de Sanidad italiano. Los cultivos primarios se obtuvieron de hipocampo de los ratones (C57BL6J, Charles River) en el día embrionario 18 (E18).

  1. Las neuronas se sembraron en placas a una concentración de 25.000 células / ml en el fondo de cristal placas de Petri (P35G-0-14-C - matek Corporation). Se necesita la baja concentración de células en cultivo para evitar la formación de una densa red ya en los primeros días in vitro. A la concentración celular se ha mencionado, la probabilidad de encontrar células aisladas con una neuritas ya no está conectado a otras células es mucho más alto.

3. Revestimiento de bolas

  1. Microesferas de polímero (Ø 4 m, COOH-terminal-Bangs Laboratories, código de producto PC05N/6700) fueron recubiertas con poli-D-lisina siguiendo el procedimiento descrito en el Kit de acoplamiento de proteínas polyLink (Polysciences, código de producto 19539). Las perlas se recubren con la misma molécula utilizada para cubrir el soporte de cultivo y las células favor adherencia.

4. Elija neurona aislada. Separe un cordón del sustrato Cultura, Trampa y Muévete Junto a la neurona

  1. Ponga la cultura placa de Petri en la platina del microscopio. Después de fijar la atención en la muestra por el movimiento etapa, corregir la posición del condensador objetivo esclarecedor establecer Kohler-iluminación. La alineación de la óptica de iluminación para establecer la condición Kolher-iluminación es necesaria para mejorar la calidad de la imagen de campo claro. El uso de tales condiciones de alineación, sino que también es necesaria para maximizar la eficiencia de recolección láser IR (a través del condensador objetivo), de la sonda atrapado dispersión, para llevar a cabo su seguimiento interferométrico por el QPD y PD.
  2. Pipetear unos pocos l de la solución madre de microesferas recubierto ena la placa de cultivo. Las microesferas se depositará y se adhieren al sustrato de cultivo. El número de l inyectada en la placa de cultivo depende de la concentración de microesferas de la solución madre. La condición ideal es tener entre uno y dos microesferas por campo de la imagen de vista. Cuando demasiados microesferas se añaden a la placa de cultivo, que ya pueden adjuntar al azar a las neuronas cultivadas.
  3. Desplazamiento en la placa de cultivo, en busca de una neurona aislada con neuritas más larga (el axón) y guardar la posición de la platina del microscopio.
  4. Moverse y buscar un cordón adherido al soporte de cultivo.
  5. Encienda el láser captura IR. En esta etapa, no hay hologramas se proyectan en el MST, y la posición del punto de láser IR coincide con la posición de la mancha láser UV. Ajuste la posición axial de la mancha IR 2-3 m por encima de la superficie de soporte de cultivo, por el movimiento de platina del microscopio.
  6. Establecer la potencia del láser UV entregado a la muestra a menos de 1 mW. LaUV láser disector ha sido calibrado previamente 14:
    5-6 mW el soporte de vidrio es destruida
    4 mW una conexión neuronal se diseca completamente
    2,5 mW de neuritas se lesionó parcialmente
    <1 mW una onda de choque se produce en la placa de cultivo. La onda de choque óptica es lo suficientemente fuerte como para separar el talón desde el soporte de vidrio.
  7. Encienda el láser UV, mientras que deja el láser IR, y mover el punto de UV por encima del cordón adherido al movimiento de platina del microscopio. Los separa del grano de la superficie, y es atrapada por el láser IR. A continuación, apague el láser UV.
  8. Mueva las cuentas atrapados varios micrómetros por encima del soporte de vidrio (20-30 micras). El levantamiento del talón a esta posición evitará que entre en contacto con otras células, mientras que se está moviendo hacia la neurona previamente elegido. Lleve la cuenta de la posición de fase guardado anteriormente. Ajuste la velocidad de fase a un valor bajo (10 m / seg) por lo que la fuerza del fluido de arrastre no exceda de la trampa ópticafuerza de ping.

5. Mueva la Trampa posición con respecto al punto Dissector Laser y Axon Posición por ordenador holograma generado y calibrar la rigidez Pinzas Ópticas

  1. Mueva el talón hacia el soporte de vidrio para visualizar el axón. El talón se mantiene por encima de la celda para evitar el contacto con él (cerca de 5 m por encima del soporte de vidrio).
  2. Mover la platina del microscopio para mover el punto de enfoque UV en el centro de la anchura del axón. Guardar la posición actual etapa.
  3. Mover el enfoque posición al contado IR por holograma generado por computadora. En este paso, la etapa se detiene en la posición elegida en el paso anterior. Cuando se proyecta el holograma generado por ordenador en el SLM, el cordón atrapado se mueve con respecto al axón. Nos mover el punto del láser IR tener el talón atrapado alineada en el centro de la neurita, con el punto de láser UV centrado en la misma neuritas demasiado. El punto de IR y por lo tanto el talón atrapados están colocados a lo largo de los axones5-10 m de distancia de la mancha UV. Movemos la posición del IR con respecto a la tinta UV en función de la geometría de las neuritas. En el caso de las pinzas ópticas no están equipados con un sistema de SLM, la posición puede ser variada por los espejos basculantes, o deflectores acústicos, ópticos en la trayectoria óptica IR. El punto de láser IR puede estar situado 5-10 micras de distancia desde el punto de UV para evitar la interacción óptica del haz de disección con la sonda atrapada, lo que podría influir en su movimiento browniano y alterar los rastros de espectroscopia de fuerza.
  4. Después de definir la nueva posición al contado IR con respecto al punto de UV y la posición del axón, mover el escenario para colocar la bola atrapado lejos del axón y evitar la colisión con él. Mover la posición axial de la perla atrapado a aproximadamente 2 micras por encima de la cubierta de vidrio.
  5. Alinear el QPD al centro de las franjas de interferencia en él: las señales de diferencial y QPD x y son ceros cuando se centra la QPD. Adquirir 5 segundos del movimiento browniano de la perla atrapado por el interferometro, a 50 KHz de frecuencia de muestreo. Obtener la rigidez (pN / nm) y sensibilidad (V / nm) de la trampa óptica por el método de espectro de potencia 18.

6. Conecte el grano a la Axon. Realizar Medición Fuerza Axotomía y simultánea

  1. Elevar la posición del grano atrapado a unos 4 m por encima de la cubierta de vidrio, y moverlo a la posición de fase guardado previamente (véase el paso 3.2).
  2. Mueva el talón hacia abajo atrapado hacia el axón hasta que haga contacto con la neuritas. La colisión entre el talón atrapado y el axón se controla por la señal de QPD z detección de desplazamiento de la bola atrapado en la dirección axial.
  3. Espere 10 segundos con el talón atrapado empujado contra el axón para favorecer su adherencia a la membrana de neuritas.
  4. Mover la etapa de micro para desplazar el talón atrapado desde el axón, y por lo tanto verificar su adhesión a la membrana celular. Si el cordón adherido, se escapa de la trampa óptica.
  5. Retrocede la trampa láser en el cordón adheridoy active el circuito de fuerza con abrazadera condiciones fuerza igual a cero. De tal manera, los piezo-reposiciona la etapa de talón, que se adjunta a la célula, en el centro de la trampa óptica. Si el sistema no tiene un control de retroalimentación, la posición de la trampa láser puede ser movido por la platina del microscopio para centrarla en la sonda adherida. El centro de la trampa se alcanza cuando las señales QPD son los mismos que cuando la perla está atrapado y no se adhirió a la célula (x y las señales de QPD y igual a cero, y la señal de QPD z da el mismo voltaje suma de los cuatro cuadrantes como cuando la perla está atrapado lejos de cualquier superficie).
  6. Establecer una condición de fuerza-abrazadera en el eje z, el posicionamiento del láser captura ligeramente sobre el centro de la perla (aproximadamente 100 nm), para generar una pretensión en la sonda atrapado adherido. En caso de que el sistema no está equipado con un control de la fuerza-abrazadera, la posición de trampa óptica puede ser levantado en pasos de 25 nm por la platina del microscopio. La señal z QPD permite monitorizar. Por lo tanto, utilizar this señal para establecer la posición de la trampa láser con respecto a la sonda adherida. Este tipo es necesario pre-tensión para detectar la tensión en la membrana después de la lesión axonal, y la consiguiente disminución del movimiento browniano de la sonda adherido. Un enfoque similar se ha propuesto para la medición de la liberación de la tensión en una correa de sujeción de membrana por imágenes de vídeo 19.
  7. De desconexión de la regeneración de la fuerza de pinza para medir la fuerza en la sonda adherido en la condición de posición-abrazadera (la-etapa piezoeléctrico está bloqueado).
  8. Inicio de la grabación simultánea de las posiciones de la sonda atrapados a través del interferómetro (20 kHz frecuencia de muestreo), y la célula durante láser axotomía de lapso de tiempo de imágenes de campo brillante (velocidad de cuadro 20 Hz).
  9. Encienda el láser UV para entregar pulsos láser hasta que la lesión se hace visible en la imagen del axón (Por lo general se necesitan 200 a 400 pulsos ópticos de energía por pulso:. 25 NJ), a continuación, apague el láser UV.
  10. Continuar el registro por el interferómetro de aproximadamente 3 millasn, hasta que la x, y y z QPD trazas alcanzar una meseta.

7. Cuantificar la tensión de liberación total

  1. Convertir las huellas QPD grabados (en voltios) por la sensibilidad calibrada de la trampa óptica, para obtener las respectivas huellas en nanómetros.
  2. Se filtra la x, y, z y trazas de desplazamiento por un filtro de paso alto con corte a 10 Hz.
  3. Calcular la varianza total de las huellas filtrados que representan el movimiento browniano de la perla atrapado. Calcular la varianza en 25 mseg para ventanas de tiempo de 500 milisegundos (10000 puntos de datos) 20 superpuestas. El filtrado de trazas de paso alto excluye los cambios de movimiento browniano debido a la fluctuación de la membrana o el movimiento cortical de actina. El movimiento browniano de la perla se reduce por las fuerzas ópticas y las fuerzas de adhesión en la membrana celular. Cuando la membrana se tensa debido a la liberación de la tensión su viscosidad se incrementa, y por lo tanto el movimiento browniano de la perla, detecta inmediatamentemente después de axotomía, comienza a disminuir.
  4. Definir t0: el comienzo de la disminución de la varianza movimiento browniano, después de la entrega de la energía láser UV. En el instante t0 de tiempo indica el comienzo de la cepa de la membrana.
  5. Definir t1: el final de la disminución de la varianza movimiento browniano (cuando se alcanza una meseta). En el instante en el tiempo t1 indica el final de la cepa de la membrana.
  6. Realizar el seguimiento de vídeo de escombros o un rasguño en la cubierta de soporte de vidrio, para medir cualquier deriva de la muestra durante la medición de la fuerza. Para el seguimiento de la partícula en el soporte de vidrio, que primero aplicamos umbrales para las imágenes de campo brillante, para obtener una pila de imágenes binarias con la partícula en blanco sobre un fondo negro. A continuación, hacemos un seguimiento del centro de partícula de masa con una precisión sub-pixel (utilizando el software ImageJ freeware).
  7. Restar la deriva medida a partir de las huellas QPD de desplazamiento. Multiplicar las huellas QPD deriva corregidos por el respectivo rigidez óptica calibrada (k x, k z k) para obtener los Fx, Fy, Fz huellas en piconewtons.
  8. Calcular la huella total de la fuerza como F tot = √ (Fx ​​2 + 2 + Fy Fz 2).
  9. Calcular la liberación total de la fuerza entre t0 y t1 como F = F lanzado tot (t1) - F tot (t0). La fuerza medida en t0 tiene que ser restado porque es debido al desplazamiento de la sonda desde el centro de la trampa, cuando las cuentas se adhiere a la neuritas.
  10. Calcular el área de contacto entre el talón neuritas atrapado y la posición del punto láser UV: en la medida de campo claro la imagen de los ejes longitudinales (L) y cortas (D) de los axones entre el talón atrapados y la posición del punto láser UV. El área de contacto axón es un axón = L x D.
  11. Normalizar la fuerza F lanzado total liberada por el área de contacto axón Un axón.

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Representative Results

La célula genera fuerzas de tracción sobre el sustrato mediante sus adhesiones focales. Fuerza generada por los elementos del citoesqueleto están en equilibrio con la fuerza que contrarresta del sustrato de cultivo. Después de la lesión inducida por láser de la neurita, algunos de los cables tensados ​​citoesqueleto se interrumpen y su tensión equilibrada se libera porque se elimina la fuerza de oposición de la adhesión sustrato. La tensión liberada se distribuye parcialmente en las adhesiones focales no afectados, y el talón unido a la membrana celular, que tuvo lugar en una trampa óptica, mide la porción de dicha liberación no contrarrestada por elementos de anclaje del citoesqueleto de la célula para el sustrato (vea el esquema de la Figura 1) .

Se presenta, en la Figura 2, un resultado representativo del protocolo experimental descrito anteriormente. La neurona, en la Figura 2a panel de la izquierda, presenta un tiempo de neuritas, que identifica el axón de la n diferenciareuron. En la Figura 2a panel de la derecha, la misma neurona se muestra después de la lesión axonal inducida (indicado por la flecha blanca). Figura 2b muestra las trazas de desplazamiento de talón grabados en x, y, y z. Figura 2c informa el seguimiento de vídeo de un rasguño en el soporte de vidrio, para tener en cuenta y eliminar la deriva etapa durante la medición.

En la Figura 3a, en el panel izquierdo, se muestra el neuritas lesionado, y la línea blanca aguas arriba del sitio de la lesión, donde se calcula el quimógrafo el diámetro de las neuritas durante la medición de liberación de tensión. En el panel de la derecha es la quimógrafo, que muestra cómo el diámetro de neuritas aumenta ligeramente inmediatamente después de la lesión, y luego se vuelve más delgada debido a la liberación de la tensión hacia el soma celular. En la Figura 3b, se cuantifica el resultado quimógrafo. El neuritas aparece más brillante con respecto al fondo ya que la posicionados attached talón en el centro de enfoque del objetivo, y por lo tanto el axón es ligeramente fuera de foco. En efecto, por informar de la suma de intensidades de píxel a lo largo de la línea de quimógrafo en cada fotograma de la grabación de vídeo de lapso de tiempo, se obtiene una estimación del diámetro de las neuritas durante la liberación de la tensión. En el panel 3c, se presenta la variación total del talón adjunto durante la liberación de la tensión, calculados en base a las huellas registradas por el interferómetro (en la figura 2b) después del filtrado de paso alto a 10 Hz frecuencia de corte. Podemos observar que la varianza aumenta con el diámetro de neuritas durante la acumulación de material aguas arriba del sitio de la lesión. Entonces, la varianza comienza a disminuir (en t0 en la Figura 3c) cuando se tensa la membrana, y el diámetro de neuritas disminuye demasiado. La disminución de la variación alcanza una meseta (en el instante t1 en la figura 3c), cuando cesa la liberación de la tensión. Después t1, el movimiento browniano comienza a aumentar debido ala relajación de la membrana posiblemente debido a la exocitosis 21 (véase la Figura 3c).

En la Figura 4a, la caja blanca indica la estimación del área de contacto de neuritas Un axón con el soporte de cultivo. Un axón se calcula entre la posición de punto de láser UV y el centro de la sonda atrapado. Figura 4b informes de la traza de la amplitud total liberada fuerza F libera obtenidos después de multiplicar las trazas de desplazamiento QPD deriva-corregidos (en la figura 2b) por el respectivo calibrado rigidez trampa óptica (k x, k y, z k). Calculamos la diferencia entre la fuerza medida en el momento t1 t0 (ΔpN en la figura 4b), y luego se divide por un axón, para obtener la tensión liberada en términos de pN / m 2.

Al repetir el mismo protocolo en diferentes neuronas en la muestra, podemos empezarsesiones de experimentos sobre varios cultivos tratados con factores químicos o chapada en diferentes soportes, y finalmente comparar el valor medio obtenido en las condiciones experimentales diferentes. En la Figura 5, se muestra la liberación de la tensión después de la lesión axonal es humedecido por adhesiones focales sobre el sustrato, por lo tanto un valor de liberación de tensión más alto significa un axón menos adherida al sustrato. Debido a que inducen una parcial y no completa, lesión del axón, se determinó la dependencia de la liberación de la tensión medida en la energía total suministrada, y en el área de contacto de neuritas entre el sitio de la lesión y el talón atrapado. Hemos tratado de destruir más elementos del citoesqueleto mediante la entrega de un mayor número de pulsos de luz, y por lo tanto inducir una mayor liberación de tensión. De lo contrario, con un aumento del área de contacto de neuritas, que esperábamos para medir una cantidad más baja de la liberación de la tensión. En la Figura 5, se muestra que la dependencia de los dos parámetros mencionados anteriormente esno está claro. Por lo tanto, hemos deducido que la lesión inducida parcial (con la baja energía previamente calibrado por impulso; véase el protocolo de paso 4.5), está relacionada con la dimensión del punto de ablación 8, que no varía cuando se utiliza el mismo objetivo de microscopio y la misma energía por pulso en la muestra. Por otra parte, el hecho de que la liberación de la tensión no está correlacionado con el área de contacto no es sorprendente porque es bien sabido que tales parámetros no representan una buena estimación de la adhesión de las células al sustrato, como adhesiones focales ocupan sólo el 1% de la superficie basal 22.

Figura 1
Figura 1. Representación gráfica de la citoesqueleto equilibrio perturbado durante láser axotomía. Una célula se adhiere a un sustrato por adhesiones focales. Flechas azules specify fuerzas de tracción generadas por los elementos del citoesqueleto (indicados por los resortes). Flechas de luz azules indican las fuerzas contrarias generadas por el sustrato de cultivo rígido. En un escenario simplificado, antes de la lesión, las fuerzas del citoesqueleto y el sustrato se emparejan y se equilibra. Después de la lesión inducida por láser de la neurita, las conexiones entre algunos resortes y el sustrato se interrumpen. Por lo tanto, el sustrato ya no es contrarrestar la fuerza de tracción del elemento de cytoskletal. El cordón atrapado, unido a la membrana, las pistas de la dirección de las fuerzas del citoesqueleto depurados.

La figura 2
Figura 2. Seguimiento interferométrica de un cordón atrapado, unido a la membrana del axón de una neurona del hipocampo durante la lesión inducida por láser. (A) de campo brillante imágenes adquiridas durante la ablación de un axón. Antes de la lesión en el panel izquierdo. Después de la lesión en el panel derecho. Una perla recubierta con poli-D-lisina se une a la membrana (poliestireno bolas, Ø 4 micras) y se mantiene en una trampa óptica. La potencia media del láser IR en la muestra es de 14 mW. La flecha blanca indica el lugar de la lesión. Bar es de 5 m. (B) las huellas registradas por atrás plano focal interferometría de la posición del talón en la trampa óptica. Rastros azules, verdes y rojos representan la posición del grano en X, Y, y Z, respectivamente. La velocidad de muestreo es de 20 kHz. (C) Desplazamiento de un rasguño en el soporte de cultivo medido por el seguimiento de vídeo para controlar la deriva de fase. Huellas azules y verdes son las posiciones xey obtenidos por el seguimiento de vídeo. Velocidad de cuadro es de 5,5 Hz.

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Figura 3. Análisis del diámetro del axón durante la liberación de la tensión, y la tensión de membrana del axón lesionado. (A) Imagen de campo brillante del axón lesionado, en el panel izquierdo. La línea blanca perpendicular al axón indica la posición en la que se calcula un quimógrafo. En el panel derecho, quimógrafo del diámetro del axón, aguas arriba del sitio de la lesión. Cada fila de la quimógrafo corresponde a 0,18 seg. (B) Suma de las intensidades de los píxeles de cada fila de la quimógrafo que representa una estimación del diámetro del axón durante la liberación de la tensión. (C) la varianza total del movimiento browniano de la perla fijada a la axón (t0 y t1 indican, respectivamente, el comienzo y el final de la liberación de la tensión en el axón después de la disección).

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La Figura 4. La cuantificación de la tensión liberada después de axotomía. (A) Imagen de campo brillante del axón lesionado. El cuadro blanco indica la estimación del área de contacto de neuritas entre el sitio de la lesión y el centro de la perla atrapado. (B) seguimiento de la amplitud total de la fuerza medida después de axotomía (F tot = √ (Fx ​​2 + 2 + Fy Fz 2)). Fx, Fy, Fz y se calcularon por la ley de Hooke (F = kx), donde las huellas de desplazamiento son los que se muestran en la Figura 2b. Las rigideces, en las tres direcciones ortogonales, de la trampa óptica se calcularon por el método de espectro de potencia (k x, y = 7,9 PN / M, k z = 2.3 PN / m). ΔpN indica la fuerza liberada medido entre el tiempo instantes t0 y t1.

La figura 5 Figura 5. La dependencia de la liberación de la tensión medida de la cantidad de energía entregada a la muestra, y en el área de contacto de neuritas. Los datos de 26 experimentos realizados en los axones de las neuronas de ratón en hippocamapal 3 DIV. (A) Diagrama de dispersión de la liberación de la tensión frente al área de contacto de neuritas entre las localidades de cuentas lesión y atrapado. (b) Diagrama de dispersión de la liberación de la tensión frente a la cantidad total de energía entregada a la muestra el área de contacto de neuritas.

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Discussion

Se presenta en este trabajo un método cuantitativo para comparar la adhesión de neuritas al sustrato de la cultura, mediante la realización de mediciones de espectroscopia de fuerza simultánea durante la lesión celular inducida por láser. La liberación de la tensión medida está relacionada con el grado de adhesión de la célula al sustrato: células con un mayor número de adhesiones focales deben liberar menos tensión. La medición de la liberación de la tensión en términos de piconewtons proporciona una cantidad física por el cual para evaluar la adhesión axonal al soporte de cultivo en diferentes condiciones experimentales 14.

Varios laboratorios integrados un disector de láser con un sistema de pinzas ópticas, la adopción de diseños ópticos distintos 23. Nuestra elección fue una trampa con trayectoria óptica fija y movimiento platina del microscopio. Para lograr esto, se introduce un modulador espacial de luz en la trayectoria del haz láser IR para mover el punto de captura con respecto a la posición del láser UV. Aunque galvanometrespejos ic permiten dirigir la posición de enfoque del láser sin mover la muestra, que pueden introducir ruido mecánico en el sistema que afecta a las mediciones de espectroscopia de fuerza. Por otra parte, hemos decidido volver a la posición del foco láser IR en la muestra, ya que el análisis movimiento browniano permite una re-calibración rápido de la rigidez óptica. Desplazamiento de la posición del punto láser UV sobre la muestra puede producir aberraciones esféricas que afectan a la calidad del propio punto de foco UV, que son insignificantes sólo para pequeños desplazamientos de la viga de su posición central. Por lo tanto, la modificación de las propiedades ópticas de la disector de láser podría requerir una calibración de novo de la potencia del láser entregado frente a daños a la entidad.

Por medición de espectroscopia de fuerza, pudimos observar que la liberación de la tensión se compone de una fase rápida de unos pocos segundos, y una fase lenta que podría durar algunas decenas de segundos. Como se informó en el trabajo anterior 14, a veces el lentofase puede durar unos minutos. Por esa razón, hemos tenido que corregir la medición de la fuerza por parte de vídeo de seguimiento de un rasguño en el soporte de cultivo. En el futuro, un enfoque mejor sería para cancelar la deriva escenario con un bucle de realimentación, que corrige automáticamente la posición de fase microscopio por vídeo o seguimiento interferométrico de un cordón unido a la cubierta de vidrio. Este tipo de configuración, ya se ha informado en la literatura, se requiere un segundo haz de láser centrado en el talón adjunto, y asegura la estabilización de fase con precisión sub-nanométrica 24,25.

En el futuro, queremos aplicar el protocolo desarrollado para comparar la adhesión axonal al soporte de cultivo en diferentes etapas de la diferenciación y en diferentes condiciones patológicas para proporcionar un ensayo cuantitativo para el tratamiento farmacológico. Por otra parte, el mismo protocolo podría aplicarse al diseño de los andamios implantables, para comparar la adhesión neuronal de diferentes tipos de materiales con distinta mechmecánicos o químicos, propiedades 26.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Alberto Guiggiani para el desarrollo del sistema de control en tiempo real, Evelina Chieregatti y Hanako Tsushima para discusiones interesantes, Giacomo PRUZZO y Alessandro Parodi para el desarrollo de la electrónica y de software a medida, y Claudia y Marina Chiabrera Nanni por su asesoramiento y asistencia en la preparación de cultivos celulares.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated Bangs laboratories PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit Polyscience 19539
EQUIPMENT
IR laser IPG Laser GmbH YLM-5-SC-LP ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator Hamamatsu LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software Optics group, University of Glasgow Free downloadable software http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ Hamamatsu Free downloadable software http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD Thorlabs S5980 with C5460SPL 6041 board Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD Teem Photonics PDA100A-EC Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser AA-optoelctronics PNV-001525-040 Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator Olympus MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope Andor BX51 Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD Warner Instruments V887ECSUVB EMCCD
Peltier device Physic Instruments QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage National Instruments Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq NI PCI-6229 Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop

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References

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