Medição da tensão Lançamento Durante Laser Induced Axon lesão axonal Avaliar Adesão ao substrato em piconewton e resolução de milissegundos

Bioengineering

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Summary

Medimos a libertação da tensão num axónio que foi parcialmente lesionada com um dissecador de laser através da medição simultânea de espectroscopia de força realizado em uma sonda opticamente preso aderida à membrana do axónio. O protocolo experimental desenvolvido avalia a aderência do axónio para o substrato de cultura.

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Vassalli, M., Basso, M., Difato, F. Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution. J. Vis. Exp. (75), e50477, doi:10.3791/50477 (2013).

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Abstract

A formação de ligações funcionais em uma rede neuronal em desenvolvimento seja influenciado por sinais extrínsecos. O crescimento de neurite de neurônios em desenvolvimento está sujeita a sinais químicos e mecânicos, e os mecanismos pelos quais ele sente e responde a sinais mecânicos são mal compreendidos. A elucidação do papel das forças na maturação das células irá permitir a concepção de andaimes que pode promover a adesão celular e o acoplamento do citoesqueleto ao substrato, e, por conseguinte, melhorar a capacidade de diferentes tipos neuronais para regenerar após uma lesão.

Aqui, nós descrevemos um método para aplicar medidas de espectroscopia de força simultâneos durante a laser lesão celular induzida. Medimos liberar a tensão no axônio parcialmente lesada por rastreamento interferométrico simultânea de uma sonda ótica preso aderido à membrana do axônio. Nosso protocolo experimental detecta a liberar a tensão com a sensibilidade piconewton, ea dinâmica da liberação de tensão noresolução de tempo de milissegundos. Por isso, oferece um método de alta resolução para estudar como o acoplamento mecânico entre as células e os substratos podem ser moduladas por tratamento farmacológico e / ou propriedades mecânicas distintas do substracto.

Introduction

A microscopia óptica é um dos sistema de imagiologia menos invasivas disponíveis para observar as células vivas. Com a exploração de efeitos, tais como pressão de radiação (como pinças ópticas 1), ou fluxo de fótons de alta energia (como a laser dissecador 2), esta tecnologia foi estendida para nano-manipulação. O sistema de imageamento óptico fornece um controle preciso para visualizar e manipular alvos celulares sub 3. Ao mesmo tempo, graças à calibração precisa da potência do laser emitido, instrumentos ópticos de realizar qualquer manipulação da amostra mole ou invasiva, com reprodutibilidade precedentes.

Vários laboratórios integrados, na mesma configuração experimental, pinças ópticas e dissecador laser para ablação organelas 4, para se fundem células diferentes 5, ou para estimular as células de cargas opticamente impulsionado 6,7. Enquanto as pinças ópticas, depois da calibração da rigidez óptico, para permitiro controlo da força aplicada à célula numa escala piconewton, sistemas laser de dissecação pode modular manipulação óptica, que varia de membrana de formação de poros para foto-ablação de organelos individuais ou dissecação das estruturas sub-celulares. No entanto, a calibração de dissecção de laser baseia-se na avaliação qualitativa da entidade de manipulação óptica no que diz respeito à energia entregue à amostra, com base, principalmente, na análise de imagem que ilustra as alterações morfológicas causados ​​à amostra 8. No método apresentado, é mostrado como para executar a medição de espectroscopia de força durante a dissecção axonal de laser de um neurónio em desenvolvimento, para quantificar, na escala piconewton, a força produzida por uma alteração do equilíbrio da estrutura de citoesqueleto um compartimento subcelular 9. Neurónios cultivados aderir ao substrato e, durante o desenvolvimento polarizar. A fase de polarização ocorre durante os primeiros cinco dias in vitro. Na fase dois de polarização, um dos EXTRUDing neurites se torna mais longo, e que irá diferenciar para se tornar o axónio 10. Alongamento axonal em resposta a uma força de tracção no cone de crescimento tem sido modelada pelo modelo de Dennerl 11. Recentemente, este modelo tem sido alargado para 12 incluem o papel da adesão de neurites para os substratos de matriz extracelular. Este modelo biofísico, proposto após as observações experimentais 13, mostrou que as forças de puxar no cone de crescimento, propagação ao longo da neurite, são modulados por adesões focais ao substrato. Da mesma forma, a lesão axonal produz uma liberação local de tensão propagando em direção ao corpo celular. Assim, propôs que a medição tal tensão lançado em um local ao longo do axônio entre a lesão ea soma celular oferece a possibilidade de avaliar o resultado de amortecimento de adesões focais não afetadas.

Nós calibrar a energia necessária fotões fluxo do dissector laser para controlar a extensão da DAMAG axonal infligidae, a partir de transecção completa a lesão parcial. Após a calibração, repetiu-se a lesão parcial dos axónios de vários neurónios diferenciados e o protocolo desenvolvido para quantificar a libertação da tensão, e assim obtido um parâmetro quantitativo para estimar a aderência do axónio para o substrato 14.

No presente trabalho, nós descrevemos em pormenor o protocolo desenvolvido, o que representa um procedimento experimental preciso para avaliar e comparar com sensibilidade piconewton axonal a adesão ao substrato, em condições experimentais diferentes, tais como o tratamento de substâncias químicas 14, ou diferentes tipos de suporte de cultura celular.

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Protocol

1. Setup Optical

O sistema óptico inteiro foi anteriormente descrito 15. Resumidamente, o sistema de pinças ópticas baseia-se numa onda contínua itérbio (CW), fibra de laser que opera a 1064 nm (IPG Laser GmbH). Um modulador de luz espacial (SLM) (LCOS-GSP, modelo X10468-07 - Hamamatsu) varia a fase do feixe de laser de entrada de IR para controlar a posição do foco pontual aprisionamento no prato de cultura por hologramas gerados por computador. As livremente disponíveis Blue-pinças de software (link da web na mesa do equipamento) hologramas gerados projetada no modulador de luz espacial. O interferômetro para medidas de espectroscopia de força foi baseado em um fotodiodo de quatro quadrantes (QPD, S5980 com C5460SPL 6041 bordo - Hamamatsu) e um fotodiodo (PD, PDA100A-CE - Thorlabs).

A fonte dissecção a laser pulsado foi um sub-nanossegundo UV Nd: YAG laser em 355 nm (PNV-001525-040, Powerchip nano-Pulse laser UV - Teem Photonics). Uma acusto-modulador óptico (MQ110-A3-UV, 355 nm de sílica fundida-AA-opto-electrónico), controlada a potência do laser UV entregue à amostra.

O holográfico pinças ópticas e a laser de micro-dissecção foram integrados num microscópio vertical modificado (BX51 - Olympus), equipado com um 60X, 0,9 NA água mergulhando fase objective.The do microscópio é composto por um motor DC de 3 eixos de posicionamento linear de micro- sistema (M-126.CG1, Física-Instruments) carregando um piezoelétrico fase de posicionamento nano 3 eixos separado (P-733.3DD, Física-Instruments) para combinar o movimento grosseiro da amostra com a resolução sub-nanométrica da piezo- fase. O sistema de estrado de microscópio foi equipado com duas malhas de controle agindo sinergicamente para manter o foco pontual aprisionamento na posição direita, dependendo do modo de funcionamento seleccionado (ou posição de fixação força, estático ou dinâmico) 16. Em particular, um loop de feedback interno atua em um palco piezoelétrico, para manter a conta em um selected distancia do centro da armadilha. O outro loop externo, controla a posição da fase motorizada para explorar a região medido pela piezo actuador em uma área maior do que o seu curso disponível 17. Quando a fase de piezo atinge o limite do curso disponível numa direcção, o laço externo move a fase de micro no sentido oposto, pelo que o piezo recupera para a sua posição central, porque ele está seguindo o talão prendido aderiu à amostra. Quando a fase de piezo atinge a posição central da sua gama de curso, a fase de micro interrompida. Outros detalhes do sistema estão apresentados na Guiggiani et ai 16,17.

Um dispositivo de Peltier (QE1 aquecimento resistivo de aquecimento com controlador de canal duplo TC-344B - Warner Instruments) controla a temperatura da cultura de células ao microscópio (37 ° C). Na cultura, pH e humidade foram mantidas em condições fisiológicas, gaseificar um polidimetil costume concebidosiloxano (PDMS), manga (integrando a objetiva do microscópio) com carbogen umidificado (95% O 2, 5% CO 2).

2. Cultura celular Preparação

Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano. As culturas primárias foram obtidos a partir de hipocampo de ratinhos (C57Bl6J, Charles River) no dia embrionário 18 (E18).

  1. Os neurónios foram plaqueados a uma concentração de 25.000 células / ml em placas de Petri de vidro de fundo (P35G-0-14-C - matek Corporation). A baixa concentração de células de cultura é necessária para evitar a formação de uma rede densa já nos primeiros dias in vitro. Na concentração de células mencionado, a probabilidade de encontrar as células isoladas com um longo de neurites não ligado a outras células é muito maior.

3. Revestimento Bead

  1. Polymer microesferas (Ø 4 mm, COOH-terminado-Bangs Laboratories, código de produto PC05N/6700) foram revestidas com poli-D-lisina seguindo o procedimento descrito no polyLink Protein Coupling Kit (Polysciences, código de produto 19539). Os grânulos são revestidos com a mesma molécula usada para cobrir o suporte de cultura e as células favor aderência.

4. Escolha neurônio isolado. Retire uma gota da cultura do substrato, Trap e movê-lo próximo ao neurônio

  1. Coloque a cultura de Petri no palco microscópio. Depois de definir o foco na amostra pelo movimento palco, corrigir a posição do condensador objetivo esclarecedor para definir Kohler-iluminação. Alinhando a ótica de iluminação para definir a condição Kölher-iluminação é necessária para melhorar a qualidade de imagem brilhante campo. Utilizando essas condições de alinhamento, é também necessário para maximizar a eficiência de recolha do laser de IV (através do condensador objectivo), a partir da sonda presa espalhamento, para realizar o seu rastreamento interferométrico pelo QPD e DP.
  2. Pipetar alguns mL da solução estoque em microesfera revestidapara o prato de cultura. Microesferas irá depositar e aderir ao substrato de cultura. O número de ul injectada na placa de cultura depende da concentração da solução de microesferas de estoque. A condição ideal é ter entre um e dois microesferas por campo de imagem de visão. Quando muitos microesferas são adicionados ao prato de cultura, eles podem já anexar aleatoriamente aos neurónios em cultura.
  3. Movimente-se na placa de cultura, em busca de um neurônio isolado com uma neurite mais tempo (o axônio) e guardar a posição do palco microscópio.
  4. Movimente-se e procurar um talão aderiu ao apoio da cultura.
  5. Ligue o laser trapping IR. Nesta fase, os hologramas não são projectadas SLM, e a posição do ponto de laser IR coincide com a posição do feixe de laser de UV. Definir a posição axial do local IR 2-3 mM acima da superfície de suporte da cultura, pelo movimento platina do microscópio.
  6. Definir a potência do laser UV entregue à amostra a menos de 1 μW. OLaser UV de dissecção foi previamente calibrado 14:
    5-6 μW o apoio de vidro é ablated
    4 μW uma ligação neuronal é completamente dissecados
    2,5 μW um neurites está parcialmente lesionada
    <1 μW uma onda de choque é produzida na placa de cultura. A onda de choque óptico é suficientemente forte para separar o talão do suporte de vidro.
  7. Ligue o laser UV, deixando o laser IR, e mover o ponto UV acima do cordão aderido pelo movimento estágio do microscópio. Os destaca talão da superfície, e é preso pelo laser IR. Em seguida, desligue o laser UV.
  8. Mova os presos talão vários micrômetros acima do suporte de vidro (20-30 mm). Levantando o talão para esta posição vai impedi-lo de entrar em contato com outras células, enquanto ele está sendo transferido para o neurônio previamente escolhido. Traga o talão para a posição palco salvo anteriormente. Ajuste a velocidade de fase para um valor baixo (10 mM / seg), de modo a força de arrasto do fluido não excede a armadilha ópticaforça ping.

5. Mova a posição Armadilha com relação ao ponto Dissector Laser e Axon Posição holograma gerado por computador, e calibrar a rigidez pinças ópticas

  1. Mova o talão para o suporte de vidro para visualizar o axônio. O talão é mantida acima da célula a fim de evitar o contacto com ela (cerca de 5 um por cima do suporte de vidro).
  2. Mover a fase de microscópio para mover o foco pontual UV no centro da largura do axónio. Salvar a posição atual estágio.
  3. Mova a posição do ponto de foco IR por holograma gerado por computador. Neste passo, a fase é interrompida na posição escolhida na etapa anterior. Quando o computador holograma gerado é projectada no SLM, o talão prendido é movido com respeito ao axónio. Nós mover o ponto de laser de infravermelho para ter o talão prendido alinhado no centro da neurite, com o ponto de laser UV centrado no mesmo neurites também. A mancha de IR e, assim, o talão prendido estão posicionados ao longo do neurites5-10 mM de distância do local UV. Passamos a posição do IR em relação ao local de UV dependendo da geometria de neurites. No caso das pinças ópticas não estão equipados com um sistema SLM, a posição pode ser variada por espelhos basculantes, ou deflectores acústicos óptica, no percurso óptico de IR. O ponto de laser de IV pode ser posicionada de 5-10 mM de distância a partir do ponto de UV para evitar a interacção do feixe óptico de dissecação com a sonda presa, o que poderia influenciar o seu movimento Browniano e alterar os vestígios de espectroscopia de força.
  4. Depois de definir a nova posição IV local no que diz respeito à posição do ponto de UV e axónio, mover a etapa de posicionar o talão prendido longe do axónio e evitar a colisão com ele. Mover a posição axial do rebordo preso a cerca de 2 m acima do vidro de cobertura.
  5. Alinhe o QPD ao centro das franjas de interferência sobre ele: sinais diferenciais y QPD x e são zeros quando o QPD está centrada. Adquirir 5 seg do movimento browniano de o talão prendido pela interferometro, a 50 kHz taxa de amostragem. Obter a rigidez (pN / nm) e a sensibilidade (V / nm) da armadilha óptica pelo método de espectro de potência 18.

6. Anexar o talão para o axônio. Realizar medição de força axotomia e simultânea

  1. Elevar a posição cordão preso cerca de 4 mm acima da tampa de vidro, e movê-lo para a posição palco salvo anteriormente (veja o passo 3.2).
  2. Mova a pérola presa em direção ao axônio até tocar no neurite. A colisão entre o talão prendido e do axónio é controlada pelo sinal de detecção de deslocamento z QPD do rebordo preso na direcção axial.
  3. Espere 10 segundos com o talão prendido empurrado contra o axónio para favorecer a adesão do material para a membrana de neurites.
  4. Mover a fase de micro para deslocar o rebordo preso a partir do axónio, e, portanto, verificar a sua adesão à membrana celular. Se o cordão aderido, ele escapa da armadilha óptica.
  5. Afaste-se da armadilha de laser sobre o cordão aderidoe ligar o circuito força-clamp com a condição força igual a zero. Em tal forma, as fases de piezo reposiciona o grânulo, ligados à célula, no centro da armadilha óptica. Se o sistema não tiver um ciclo de realimentação de controlo, a posição da armadilha de laser pode ser movido por platina do microscópio para centrá-la sobre a sonda aderido. O centro da armadilha é alcançada quando os sinais QPD são os mesmos que quando o rebordo está preso e não aderiram à célula (sinais QPD y igual a zero e x, e o sinal QPD Z dá o mesmo valor de voltagem dos quatro quadrantes como quando o cordão é presa longe de qualquer superfície).
  6. Definir um estado de força de fixação sobre o eixo z, posicionando o laser aprisionamento ligeiramente ao longo do centro do cordão (cerca de 100 nm), para gerar uma pretensão na sonda presa aderido. No caso de o sistema não está equipado com um controlo de força da braçadeira, a posição armadilha óptica pode ser levantado em passos de 25 nm, por a fase de microscópio. O sinal QPD z permite o monitoramento. Portanto, use this um sinal para ajustar a posição da armadilha de laser em relação à sonda aderido. Tal pré-tensão é necessária para detectar a tensão sobre a membrana após a lesão axonal e a consequente diminuição do movimento browniano de sonda aderido. Uma abordagem semelhante tem sido proposto para medir a libertação da tensão na membrana através de um tirante de vídeo de imagem 19.
  7. Switch-off o force feedback-clamp para medir a força na sonda aderido na condição posição-clamp (a fase piezo é bloqueado).
  8. Iniciar a gravação simultânea das posições de sonda presos através do interferômetro (20 frequência de amostragem KHz), e as células durante axotomia lapso de tempo de imagem de campo claro do laser (20 Hz taxa de quadros).
  9. Ligue o laser UV para entregar pulsos de laser até que uma lesão se torna visível na imagem do axônio (geralmente 200-400 pulsos ópticos são necessários energia por pulso: 25. NJ), em seguida, desligue o laser UV.
  10. Continuar a gravação do interferômetro para cerca de 3 kmN, até que a x, y e z QPD vestígios atingir um patamar.

7. Quantificar a liberação total Tension

  1. Converter os vestígios QPD gravados (em volts) pela sensibilidade calibrada da armadilha óptica, para se obter os respectivos vestígios em nanómetros.
  2. Filtrar a x, y, z e vestígios de deslocamento por um filtro passa alto com corte de 10 Hz.
  3. Calcule a variância total dos traços filtrados representando o movimento browniano do cordão preso. Calcular a variância em 25 mseg passos para as janelas de tempo de 500 ms (10.000 pontos de dados) 20 sobrepostos. A filtragem passa-alto de vestígios exclui as variações de movimento Browniano, devido à flutuação ou movimento da membrana cortical actina. O movimento Browniano do cordão é reduzida pelas forças ópticas e as forças de aderência sobre a membrana celular. Quando a membrana é esticada devido à libertação de tensões a sua viscosidade aumenta, e, assim, o movimento browniano dos grânulo, detectado imediatamentediatamente após axotomia, começa a diminuir.
  4. Definir t0: o início de diminuição da variação do movimento Browniano, depois do fornecimento de energia laser de UV. O instante de tempo t0 indica o início da deformação da membrana.
  5. Definir t1: o fim da redução da variação do movimento Browniano (quando se atinge um planalto). O instante de tempo t1 indica o fim da estirpe membrana.
  6. Realizar monitoramento de vídeo de detritos ou um arranhão com o apoio tampa de vidro, para medir qualquer desvio da amostra durante a medição de força. Para acompanhar a partícula com o apoio de vidro, nós aplicamos primeiro limiares para as imagens de campo claro, para obter uma pilha de imagens binárias com a partícula em branco sobre um fundo preto. Então, vamos acompanhar o centro de massa da partícula com precisão sub-pixel (utilizando o software ImageJ freeware).
  7. Subtrair o desvio medido a partir de vestígios QPD deslocamento. Multiplique os traços QPD deriva corrigidos pela respectiva rigidez óptica calibrado (k x, k z k) para obter os Fx, Fy, Fz traços em piconewtons.
  8. Calcule o traço força total, como F tot = √ (Fx ​​2 + 2 + Fy Fz 2).
  9. Calcule a liberação total da força entre T0 e T1 como F liberado = F tot (t1) - F tot (t0). A força medida em t0 tem que ser subtraídos, porque é devido ao deslocamento da sonda a partir o centro da armadilha, quando adere ao grânulo de neurites.
  10. Calcule a área de contato entre a neurite cordão preso ea posição UV ponto de laser: na medida imagem de campo claro as longas (L) e curto eixos (D) da neurite entre o talão preso ea posição UV local laser. A área de contato do axônio é um axônio = L x D.
  11. Normalizar o total liberado força F lançado pela área de contato do axônio A axônio.

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Representative Results

A célula gera forças de tração sobre o substrato por suas adesões focais. Força gerada pelos elementos do citoesqueleto estão em equilíbrio com a força contrária do substrato de cultura. Após a lesão do laser de neurites induzido, alguns dos cabos do citoesqueleto tensos são rompidas e sua tensão equilibrada é libertado porque a força contrária do substrato de adesão é eliminada. A tensão libertado é parcialmente distribuído nas adesões focais não afectadas, e o cordão ligado à membrana celular, realizada em uma armadilha óptica, mede a parcela de tal libertação não contrariado por elementos de ancoragem do citoesqueleto da célula para o substrato (ver Figura 1 esquema) .

Descrevemos, na Figura 2, um resultado representativo do protocolo experimental descrito acima. O neurónios, na Figura 2a painel à esquerda, apresenta um tempo de neurites, que identifica o axónio do n diferenciandoEURON. No painel da direita Figura 2a, o mesmo neurónio é mostrado após a lesão axonal induzida (indicado pela seta branca). Figura 2b mostra os vestígios gravados deslocamento grânulo em x, y, z e instruções. Figura 2c relata o rastreamento de vídeo de um arranhão no suporte de vidro, para ter em conta e eliminar a deriva durante a fase de medição.

Na figura 3a, no painel à esquerda, que mostram a neurites lesionada, e da linha branca a montante do local da lesão, em que calcular o quimógrafo do diâmetro de neurites durante a medição da tensão. No painel direito é o quimógrafo, mostrando como o diâmetro neurite aumenta ligeiramente imediatamente após a lesão e, em seguida, se torna mais fina devido à liberação de tensão para a soma celular. Na Figura 3b, quantificamos o resultado quimógrafo. A neurite aparece mais brilhante em relação ao fundo, uma vez que posicionou o attached talão no centro foco da objetiva, e, portanto, o axônio é um pouco fora de foco. Com efeito, relatando a soma das intensidades de pixel ao longo da linha quimógrafo em cada quadro da gravação vídeo de lapso de tempo, obtém-se uma estimativa do diâmetro de neurites durante a libertação de tensão. No painel 3c, relatamos a variância total do talão anexo durante o lançamento tensão, calculado com base nos traços registrados pelo interferômetro (na Figura 2b), após alta filtragem passa em 10 Hz a freqüência de corte. Podemos observar que a variância aumenta com o diâmetro de neurites durante a acumulação de material a montante do local da lesão. Em seguida, a variância começa a diminuir (em t0 na figura 3c), quando a membrana é esticada, e o diâmetro de neurites diminui também. A redução de variância atinge um patamar (em t1 na Figura 3c), quando cessa a libertação de tensão. Após t1, o movimento Browniano começa a aumentar porquede relaxamento membrana possivelmente devido a exocitose 21 (ver Figura 3c).

Na Figura 4a, o quadro branco indica a estimativa da superfície de contacto de neurites Um axónio com o suporte de cultura. Um axónio é calculada entre a posição do ponto de laser UV e o centro da sonda aprisionada. Figura 4b relatórios o traço amplitude do total libertado força F divulgados obtidos após multiplicação dos deriva-corrigidos QPD vestígios de deslocamento (na Figura 2b), pelo respectivo calibrado rigidez armadilha óptica (x k, y k, k z). Nós calculamos a diferença entre a força medida no tempo T1 e T0 (ΔpN na Figura 4-B), e depois dividir por um axônio, para obter a tensão liberada em termos de pN / 2 mM.

Ao repetir o mesmo protocolo em diferentes neurônios na amostra, podemos começarsessões de experiências com várias culturas tratadas com factores químicos ou revestida sobre diferentes suportes, e, finalmente, comparar o valor médio obtido nas condições experimentais diferentes. Na Figura 5, mostramos a liberação da tensão após a lesão axonal é atenuado por adesões focais sobre o substrato, assim, um valor de lançamento tensão maior significa um axônio menos aderido ao substrato. Porque induzir uma parcial, e não está completa, a lesão do axónio, investigaram a dependência da libertação da tensão medida na energia total fornecida, e sobre a área de contacto entre as neurites do local da lesão e o talão prendido. Temos procurado destruir elementos do citoesqueleto, oferecendo mais um número maior de pulsos de luz e, consequentemente, induzir uma maior liberação de tensão. Caso contrário, com o aumento da área de contato neurite, esperávamos medir uma menor quantidade de liberação de tensão. Na Figura 5, mostra-se que a dependência dos dois parâmetros acima mencionados énão está claro. Assim, deduzimos que a lesão induzida parcial (com baixo consumo de energia previamente calibrado por impulso; ver protocolo passo 4.5), está relacionada com a dimensão da mancha 8, a ablação, a qual não varia quando se utiliza o mesmo objectivo de microscópio e a mesma energia por impulso para a amostra. Além disso, o facto de que a libertação da tensão não está correlacionada com a área de contacto não é surpreendente, porque é sabido que tais parâmetros não representam uma boa estimativa da adesão das células ao substrato, tal como as adesões focais ocupam apenas 1% do superfície basal 22.

Figura 1
Figura 1. Representação gráfica do equilíbrio citoesqueleto rompida durante axotomia laser. Uma célula adere a um substrato por adesões focais. Azul setas specify forças de tração geradas por elementos do citoesqueleto (indicados por molas). Claro setas azuis indicam que contrariam as forças geradas pelo substrato de cultura rígida. Em um cenário simplificado, antes da lesão, as forças do citoesqueleto e substrato são emparelhados e equilibrada. Após a lesão induzida por laser do neurites, as conexões entre algumas molas e o substrato sejam perturbadas. Assim, o substrato não é mais contrariar a força de tracção do elemento cytoskletal. O cordão preso, ligado à membrana, segue a direção das forças do citoesqueleto liberados.

Figura 2
Figura 2. Interferométrico de controle de um (a) Campo brilhante preso grânulo, ligado à membrana do axónio de um neurónio do hipocampo durante lesão induzida por laser. imagens adquiridas durante a ablação de um axônio. Antes da lesão no painel esquerdo. Após a lesão no painel da direita. Um ácido poli-D-lisina pérola revestida está ligado à membrana (poliestireno talão, Ø 4 mm) e realizado em uma armadilha óptica. Potência média do laser IR na amostra é de 14 mW. Branco seta indica o local da lesão. Bar é 5 mm. (B) os traços gravados por volta focal interferometria plano da posição talão na armadilha óptica. Traços azul, verde e vermelho representam a posição talão junto X, Y e Z, respectivamente. Taxa de amostragem é de 20 kHz. (C) Deslocamento de um arranhão com o apoio cultura medido pelo monitoramento de vídeo para monitorar a deriva palco. Traços azuis e verdes são as posições x e y obtidos pelo monitoramento de vídeo. Taxa de quadros é de 5,5 Hz.

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Figura 3. Análise do diâmetro do axônio durante a liberação de tensão, ea tensão da membrana do axônio lesado. (A) imagem de campo brilhante do axônio lesado, no painel esquerdo. A linha branca perpendicular ao axónio indica a posição onde uma quimógrafo é computado. No painel direito, quimógrafo do diâmetro do axónio, a montante do local da lesão. Cada linha da quimógrafo corresponde a 0,18 seg. (B) A soma das intensidades de pixel de cada linha da quimógrafo representando uma estimativa do diâmetro axonal durante a libertação de tensão. (C) a variação total de movimento Browniano do cordão ligado ao axónio (T0 e T1 indicam, respectivamente, no início e no fim da libertação da tensão no axónio após dissecção).

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Figura 4. Quantificação da tensão liberada após axotomia. (A) imagem de campo brilhante do axônio lesado. A caixa branca indica a estimativa da área de contacto entre neurites do local da lesão e do centro do rebordo preso. (B) Rastreio da amplitude total da força medida após axotomia (F tot = √ (Fx ​​2 + 2 + Fy Fz 2)). Fx, Fy, e Fz foram calculados pela lei de Hooke (F = kx), onde as pistas de deslocamento são as mostradas na Figura 2b. A rigidez, nas três direcções ortogonais, da armadilha óptica foram calculados pelo método de espectro de potência (k x, y = 7,9 / PN mM, k z = 2.3 pN / im). ΔpN indica a força medida lançado entre o momento em instantes T0 e T1.

Figura 5 Figura 5. Dependência de liberação de tensão medido na quantidade de energia fornecida para a amostra, e na área de contato neurite. Dados de 26 experimentos realizados sobre os axônios dos neurônios de rato hippocamapal em 3 DIV. (A) Gráfico de dispersão de liberar a tensão em relação a área de contato neurite entre os locais de talão de lesão e preso. (b) Gráfico de dispersão de liberar a tensão contra quantidade total de energia entregue à área de contato neurite da amostra.

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Discussion

Apresentamos neste trabalho um método quantitativo para comparar a adesão neurite ao substrato da cultura, através da realização de medidas de espectroscopia de força simultânea durante a laser lesão celular induzida. A libertação da tensão medida está relacionada com o grau de adesão das células ao substrato: as células com maior número de adesões focais devem libertar menos tensão. Medição da libertação da tensão em termos de piconewtons fornece uma grandeza física pelo qual se avalia a aderência axonal ao suporte de cultura em diferentes condições experimentais 14.

Vários laboratórios integrados um dissecador a laser com um sistema de pinças ópticas, adotando projetos ópticos distintos 23. Nossa escolha foi uma configuração com caminho óptico fixo e movimento estágio do microscópio. Para conseguir isso, é introduzido um modulador espacial de luz no caminho do feixe laser IR para mover o ponto de armadilhagem com respeito à posição de laser UV. Embora galvanometrespelhos ic permitir orientar a posição do foco do laser, sem mover a amostra, eles podem introduzir ruído mecânico do sistema que afectem as medidas de espectroscopia de força. Além disso, decidiu-se re-posicionar o foco do laser IR na amostra, uma vez que a análise do movimento browniano permite uma rápida re-calibração da rigidez óptica. Movendo a posição de ponto de laser de UV para a amostra pode produzir as aberrações que afectam a qualidade do foco pontual UV em si, que são negligenciáveis ​​apenas para pequenos deslocamentos do feixe a partir da sua posição central. Por isso, a modificação das propriedades ópticas do dissector laser pode necessitar de uma calibração de novo da potência do laser emitido contra danos para a entidade.

Por medição de espectroscopia de força, pudemos observar que a libertação de tensão é constituída por uma fase rápida de poucos segundos, e uma fase lento que pode durar algumas dezenas de segundos. Como relatado no trabalho anterior 14, por vezes, o lentofase pode durar de alguns minutos. Por esse motivo, tivemos que corrigir a medição da força de vídeo monitoramento a zero com o apoio cultura. No futuro, uma abordagem melhor seria cancelar fase deriva com um loop de feedback, que auto-corrige a posição estágio do microscópio por vídeo ou por rastreamento interferométrico de um cordão ligado à tampa de vidro. Este tipo de configuração, já relatado na literatura, requer um segundo feixe de laser centrado no grânulo ligado, e assegura a estabilização fase com precisão sub-nanométrica 24,25.

No futuro, queremos aplicar o protocolo desenvolvido para comparar a adesão axonal ao suporte de cultura em diferentes estágios de diferenciação e em diferentes condições patológicas para fornecer um ensaio quantitativo para o tratamento farmacológico. Além disso, o mesmo protocolo poderia aplicar-se o desenho de andaimes implantáveis, para comparar a adesão neuronal a diferentes tipos de materiais com diferente mecanismomecânicos ou químicos propriedades 26.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Alberto Guiggiani para o desenvolvimento do sistema de controle em tempo real, Evelina Chieregatti e Hanako Tsushima para discussões criteriosas, Giacomo PRUZZO e Alessandro Parodi para o desenvolvimento de produtos eletrônicos personalizados e softwares, e Claudia Chiabrera e Marina Nanni para seu aconselhamento e assistência na preparação de cultura de células.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated Bangs laboratories PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit Polyscience 19539
EQUIPMENT
IR laser IPG Laser GmbH YLM-5-SC-LP ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator Hamamatsu LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software Optics group, University of Glasgow Free downloadable software http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ Hamamatsu Free downloadable software http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD Thorlabs S5980 with C5460SPL 6041 board Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD Teem Photonics PDA100A-EC Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser AA-optoelctronics PNV-001525-040 Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator Olympus MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope Andor BX51 Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD Warner Instruments V887ECSUVB EMCCD
Peltier device Physic Instruments QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage National Instruments Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq NI PCI-6229 Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop

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References

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