Mesure de la tension de sortie Pendant Laser Induced Axon lésion axonale évaluer l'adhésion au substrat à piconewton et Millisecond Résolution

Bioengineering

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Summary

Nous avons mesuré la sortie de tension dans un axone qui a été partiellement lésé avec un dissecteur laser en mesure de spectroscopie de force simultanées effectuées sur une sonde optiquement piégé collée à la membrane de l'axone. Le protocole expérimental développé évalue l'adhérence des axones au substrat de culture.

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Vassalli, M., Basso, M., Difato, F. Measurement of Tension Release During Laser Induced Axon Lesion to Evaluate Axonal Adhesion to the Substrate at Piconewton and Millisecond Resolution. J. Vis. Exp. (75), e50477, doi:10.3791/50477 (2013).

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Abstract

La formation des connexions fonctionnelles dans un réseau de neurones en développement est influencée par des signaux extrinsèques. La croissance des neurites des neurones en développement est soumis à des signaux chimiques et mécaniques, et les mécanismes par lesquels il détecte et réagit aux signaux mécaniques sont mal compris. L'élucidation du rôle des forces dans la maturation des cellules permettra à la conception des échafaudages qui peut favoriser l'adhérence cellulaire et l'accouplement du cytosquelette au substrat, et donc d'améliorer la capacité de différents types de neurones pour régénérer après une blessure.

Ici, nous décrivons une méthode pour appliquer des mesures de spectroscopie de force simultanés pendant lésion cellulaire induite par laser. Nous mesurons relâchement de la tension dans l'axone partiellement lésé par simultané suivi interférométrique d'une sonde optique piégé adhéré à la membrane de l'axone. Notre protocole expérimental détecte le relâchement de la tension avec sensibilité piconewton, et la dynamique de la libération de tension aurésolution de la milliseconde. Par conséquent, il propose une méthode à haute résolution pour étudier comment le couplage mécanique entre les cellules et les substrats peut être modulée par un traitement pharmacologique et / ou par des propriétés mécaniques distinctes du substrat.

Introduction

La microscopie optique est l'un du système de formation d'image moins invasive disponible pour observer les cellules vivantes. Avec l'exploitation des effets tels que la pression de radiation (comme pinces optiques 1), ou flux de photons de haute énergie (comme dans dissection laser 2), cette technologie a été étendue aux nano-manipulation. Le système d'imagerie optique fournit un contrôle précis de visualiser et de manipuler les cibles cellulaires sous 3. Dans le même temps, grâce à l'étalonnage précis de la puissance du laser livré, outils optiques accomplir soit la manipulation de l'échantillon mou ou invasive avec une reproductibilité sans précédent.

Plusieurs laboratoires intégrés, dans le même dispositif expérimental, pinces optiques et dissecteur laser afin de réaliser l'ablation organites 4, à fusionner les différentes cellules 5, ou pour stimuler les cellules par entraîné optiquement cargaisons 6,7. Bien pinces optiques, après étalonnage de la rigidité optique, permettent dele contrôle de la force appliquée à la cellule sur une échelle piconewton, les systèmes de dissection laser peut moduler la manipulation optique, qui va de la membrane photo-ration à l'ablation des organites simples ou dissection des structures sub-cellulaires. Cependant, l'étalonnage de dissection laser repose sur l'évaluation qualitative de l'entité de manipulation optique par rapport à l'énergie fournie à l'échantillon, principalement basée sur l'analyse d'images illustrant les changements morphologiques dus à l'échantillon 8. Dans la méthode présentée, nous montrons comment effectuer la mesure de la spectroscopie de force au cours de la dissection axonale laser d'un neurone en développement, pour quantifier, sur l'échelle piconewton, la force produite par un équilibre altération de la structure du cytosquelette d'un compartiment subcellulaire 9. Des neurones en culture adhèrent au substrat, et polarisent au cours du développement. La phase de polarisation se produit durant les cinq premiers jours in vitro. À la deuxième étape de la polarisation, l'un des Extrudment neurites est long, et il faudra différencier pour devenir l'axone 10. Élongation des axones en réponse à la force de traction au niveau du cône de croissance a déjà été modélisé par le modèle de Dennerl 11. Récemment, ce modèle a été étendu pour inclure 12 le rôle de l'adhésion neurites sur les substrats de la matrice extracellulaire. Ce modèle biophysique, proposé après les observations expérimentales 13, a montré que les forces de traction sur le cône de croissance, se propageant le long de la neurites, sont modulés par des adhérences focales au substrat. De même, lésion axonale produit une libération locale de tension se propageant en direction du corps de la cellule. Ainsi, nous avons proposé que la mesure de cette tension libérée dans un emplacement le long de l'axone entre la lésion et le corps cellulaire offre la possibilité d'évaluer l'issue d'amortissement des adhésions focales ne sont pas touchés.

Nous calibrer l'énergie nécessaire photons flux de la dissection laser pour contrôler l'étendue de l'avarie de axonale infligéee, de la section complète de la lésion partielle. Après la calibration, nous avons répété lésion partielle des axones des neurones plusieurs différenciation et développé le protocole de quantifier le relâchement de la tension, et obtient ainsi un paramètre quantitatif pour estimer l'adhérence de l'axone au substrat 14.

Dans le présent travail, nous décrivons en détail le protocole mis au point, ce qui représente une procédure expérimentale précise pour évaluer et comparer avec sensibilité piconewton l'adhésion axonale au substrat dans différentes conditions expérimentales telles que le traitement chimique 14, ou différents types de support de culture cellulaire.

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Protocol

1. Configuration optique

Le système optique entier a été décrit précédemment 15. En bref, le système pinces optiques est basé sur une onde continue ytterbium (CW) fibre laser fonctionnant à 1064 nm (IPG Laser GmbH). Un modulateur spatial de lumière (SLM) (LCOS-SLM, modèle X10468-07 - Hamamatsu) fait varier la phase du faisceau laser IR entrant pour commander la position de la tache de focalisation de piégeage sur la boîte de culture par ordinateur hologrammes générés. Les Blue-pinces logiciels (lien web sur la table de l'équipement) hologrammes générés librement disponibles projetées sur le modulateur spatial de lumière. L'interféromètre pour les mesures de spectroscopie de force reposait sur une photodiode à quatre quadrants (DOU, S5980 avec C5460SPL 6041 board - Hamamatsu) et une photodiode (PD, PDA100A-EC - Thorlabs).

La source de dissection laser pulsé est un sous-nanoseconde Nd UV: YAG à 355 nm (PNV-001525-040, POWERCHIP nano-Pulse laser UV - Teem Photonics). Un modulateur acousto-Modulateur optique (MQ110-A3-UV, 355 nm, la silice fondue-AA-opto-électronique) contrôle la puissance du laser UV directement à l'échantillon.

La pincette optique holographique et le laser micro-dissecteur sont intégrés sur un microscope droit modifié (BX51 - Olympus) équipé d'un 60X, 0,9 NA eau trempage étape objective.The du microscope se compose d'un trois-axes linéaires moteur à courant continu de micro-positionnement Système (M-126.CG1, Physique-Instruments) portant une piézoélectrique étape de nano-positionnement à 3 axes séparés (P-733.3DD, Physique-Instruments) pour combiner le mouvement grossier de l'échantillon avec la résolution inférieure au nanomètre de l'élément piézo- étape. Le système de la platine du microscope est équipé de deux boucles de régulation agissant en synergie pour maintenir le point de mise au point de piégeage à la bonne position, en fonction du mode de fonctionnement sélectionné (ou position de serrage de la main, statique ou dynamique) 16. En particulier, une boucle de rétroaction interne agit sur un étage piézo-électrique, pour garder la perle à la sélectioned distance du centre du piège. L'autre boucle externe commande la position de la platine motorisée pour exploiter la région couverte par l'actionneur piézo-électrique sur une surface plus grande que sa course disponible 17. Lorsque l'élément piézo-phase atteint la limite de la course disponible dans une direction, la boucle externe déplace le micro-étape dans la direction opposée, donc l'élément piézo récupère vers sa position centrale, car elle suit le bourrelet emprisonné collée à l'échantillon. Lorsque l'élément piézo-stade atteint la position centrale de sa gamme de cours, le micro scène arrêtée. D'autres détails du système sont présentés dans Guiggiani et al 16,17.

Un dispositif à effet Peltier (QE1 chauffage résistif avec commande de chauffage à deux canaux TC-344B - Warner Instruments) contrôle la température de la culture de cellules sous un microscope (37 ° C). Dans la culture, le pH et l'humidité ont été maintenus à des conditions physiologiques en aérant un polydiméthyle conçu sur mesuresiloxane (PDMS) manchon (intégration de l'objectif de microscope) avec humidifié carbogène (95% O2, 5% CO2).

2. Culture cellulaire Préparation

Tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le ministère italien de la Santé. Les cultures primaires ont été obtenus à partir de l'hippocampe de souris (C57BL6J, Charles River) au jour embryonnaire 18 (E18).

  1. Les neurones ont été étalées à une concentration de 25.000 cellules / ml à fond de verre boîtes de Pétri (P35G-0-14-C - Matek Corporation). La faible concentration des cellules en culture est nécessaire pour éviter la formation d'un réseau dense dès les premiers jours in vitro. A la concentration cellulaire mentionné, la probabilité de trouver des cellules isolées avec un neurites plus pas connecté à d'autres cellules est beaucoup plus élevé.

3. Revêtement perle

  1. Microsphères de polymère (Ø 4 pm, laboratoires COOH-fin-Bangs, code produit PC05N/6700) ont été enduites de poly-D-lysine suivant la procédure décrite dans la Polylink Coupling Kit Protein (Polysciences, code produit 19539). Les billes sont recouvertes de la même molécule utilisée pour couvrir le support de la culture et de la faveur cellules adhérence.

4. Choisissez Neuron isolé. Détachez une perle du substrat Culture, Piège et déplacez-côté de la Neuron

  1. Mettez la culture boîte de Pétri sur la platine du microscope. Après avoir réglé la mise au point sur l'échantillon par le mouvement de la scène, corriger la position du condenseur objectif éclairant de mettre Kohler-éclairage. Aligner l'optique d'éclairage pour régler l'état Kolher-éclairage est nécessaire pour améliorer la qualité de l'imagerie en champ clair. En utilisant de telles conditions d'alignement, il est également nécessaire pour maximiser l'efficacité de la collecte de laser IR (à travers le condenseur objectif), de la diffusion sonde emprisonné, pour effectuer son suivi interférométrique par le DOU et PD.
  2. Introduire à la pipette un peu pl de la solution mère de microsphères revêtuà la boîte de culture. Microsphères déposer et adhérer au substrat de culture. Le nombre de pi injecté dans la boîte de culture dépend de la concentration des microsphères de la solution mère. La condition idéale est d'avoir entre un et deux microsphères par champ imagerie de vue. Quand trop de microsphères sont ajoutés à la boîte de culture, ils peuvent déjà attacher au hasard dans les neurones en culture.
  3. Déplacez-vous dans la boîte de culture, la recherche d'un neurone isolé avec un neurites plus (l'axone), et enregistrer la position de la platine du microscope.
  4. Déplacer et rechercher une perle adhéré au support de culture.
  5. Allumez le laser de piégeage IR. A ce stade, aucun des hologrammes sont projetés sur SLM, et de la position de la tache laser IR coïncide avec la position du spot laser UV. Régler la position axiale de la tache infrarouge 3.2 um au-dessus de la surface de support de culture, par le mouvement de la platine du microscope.
  6. Régler la puissance du laser UV directement à l'échantillon de moins de 1 mW. LeUV laser dissection a déjà été calibré 14:
    6.5 uW le support en verre est soumis à une ablation
    4 mW une connexion neuronale est complètement disséqué
    2,5 mW une neurites est partiellement lésé
    <1 mW une onde de choc est produite dans la boîte de culture. L'onde de choc optique est suffisamment fort pour détacher le talon du support de verre.
  7. Allumez le laser UV, tout en laissant le laser infrarouge, et déplacez le spot UV au-dessus de la perle respecté par le mouvement de la platine du microscope. Les perles se détache de la surface, et il est piégé par le laser IR. Ensuite, éteignez le laser UV.
  8. Déplacer les billes piégées plusieurs micromètres au-dessus du support de verre (de 20 à 30 pm). La levée du talon de cette position, on l'empêche de venir au contact d'autres cellules pendant qu'il est déplacé vers le neurone choisi précédemment. Porter le bourrelet à la position de phase enregistrée précédemment. Régler la vitesse de phase à une valeur faible (10 um / sec) de telle sorte la force de traînée du fluide ne dépasse pas le piège optiquevigueur ping.

5. Déplacer la position du piège par rapport au Coin Dissector laser et Axon Position par hologramme généré par ordinateur, et de calibrer la rigidité pinces optiques

  1. Déplacer le bourrelet vers le support de verre de visualiser l'axone. Le bourrelet est maintenu au-dessus de la cellule pour éviter le contact avec celui-ci (environ 5 um au-dessus du support de verre).
  2. Déplacer la platine du microscope pour déplacer le spot de focalisation UV sur le centre de la largeur de l'axone. Enregistrer la position actuelle de la scène.
  3. Déplacer le focus position au comptant IR par hologramme généré par ordinateur. Dans cette étape, l'étape est arrêtée dans la position choisie à l'étape précédente. Lorsque l'hologramme généré par ordinateur est projeté sur le SLM, la bille piégée est déplacée par rapport à l'axone. Nous déplacer le point laser IR pour avoir le bourrelet emprisonné aligné sur le centre de la neurite, de la tache laser UV centré sur le même neurites aussi. Le spot IR et donc la perle piégée sont positionnés le long de la neurites5-10 um loin de l'endroit UV. Nous passons la position de l'IR par rapport à la tache UV en fonction de la géométrie des neurites. Dans le cas où les pinces optiques ne sont pas équipés d'un système SLM, la position peut être modifiée par des miroirs inclinables ou déflecteurs acoustiques optiques, sur le chemin optique IR. Le spot laser infrarouge peut être positionné à une distance de 5 à 10 um de la tache UV afin d'éviter une interaction optique du faisceau de dissection avec la sonde piège, qui pourraient influencer son mouvement brownien et modifier les traces de spectroscopie de force.
  4. Après la définition de la nouvelle position de la tache infrarouge par rapport à la tache UV et la position de l'axone, déplacer la platine pour positionner le bourrelet emprisonné loin de l'axone et éviter la collision avec elle. Déplacer la position axiale du bourrelet emprisonné à environ 2 um au-dessus de la vitre de recouvrement.
  5. Aligner le DOU du centre Les franges d'interférence sur elle: signaux différentiels QPD x et y sont des zéros lorsque le DOU est centrée. Acquérir 5 sec du mouvement brownien de la bille piégée par le interférométriemètre, à la fréquence d'échantillonnage de 50 KHz. Obtenir la rigidité (pN / nm) et la sensibilité (V / nm) du piège optique par la méthode de spectre de puissance 18.

6. Fixez la perle de l'axone. Effectuer la mesure de force axotomie et simultanée

  1. Levez la position perle piégée environ 4 um au-dessus du couvercle en verre, et le déplacer vers la position de scène enregistrée précédemment (voir l'étape 3.2).
  2. Déplacez le bas talon coincé vers l'axone jusqu'à ce qu'il touche le neurites. La collision entre le bourrelet emprisonné et l'axone est contrôlée par le signal DOU z détecter le déplacement de la bille emprisonnée dans le sens axial.
  3. Attendre 10 sec avec le bourrelet emprisonné poussé contre l'axone pour favoriser son adhérence à la membrane des neurites.
  4. Déplacer le micro-étape pour déplacer la bille piégée de l'axone, et vérifier ainsi son adhésion à la membrane cellulaire. Si la perle respecté, il s'échappe du piège optique.
  5. Déplacer en arrière le piège à laser sur le bourrelet colléeet activer la boucle de force avec serrage état de force égale à zéro. De cette façon, les repositionne piézo-scène la perle, attachés à la cellule, au centre du piège optique. Si le système n'a pas de contrôle de la boucle de rétroaction, la position d'interruption du laser peut être déplacé par la platine du microscope pour le centrer sur la sonde collée. Le centre du piège est atteinte lorsque les signaux QPD sont les mêmes que lorsque la bille est coincée et n'est pas collée à la cellule (y QPD signaux égaux à zéro et x et le signal DOU z donne la même tension somme des quatre quadrants que lorsque le talon est coincé loin de toute surface).
  6. Définir une condition de force la bride sur l'axe z, le positionnement du laser de piégeage légèrement sur le centre de la bille (environ 100 nm), pour générer une précontrainte sur la sonde piège collée. Dans le cas où le système n'est pas équipé d'une commande de force de serrage, la position de piège optique peut être soulevée vers le haut au pas de 25 nm par la platine du microscope. Le signal DOU z permet de surveiller. Par conséquent, utiliser this signal pour régler la position de la trappe de laser par rapport à la sonde collée. Une telle pré-tension est nécessaire pour détecter la pression exercée sur la membrane après la lésion axonale et la diminution conséquente du mouvement brownien de la sonde adhéré. Une approche similaire a été proposée pour mesurer le relâchement de la tension dans un câble d'attache de la membrane par imagerie vidéo 19.
  7. Déconnexion du retour de force-pince pour mesurer la force sur la sonde adhérant à la condition de position de serrage (l'élément piézo-étape est bloquée).
  8. Lancer l'enregistrement simultané des positions des sondes piégés par l'interféromètre (20 fréquence d'échantillonnage KHz), et la cellule pendant laser axotomie en accéléré imagerie à champ clair (20 Hz fréquence de trame).
  9. Allumez le laser UV pour délivrer des impulsions laser jusqu'à une lésion devient visible sur l'image de l'axone (généralement 200-400 impulsions optiques sont nécessaires énergie par impulsion: 25. NJ), puis éteignez le laser UV.
  10. Continuez l'enregistrement par l'interféromètre pour environ 3 kmn, jusqu'à ce que les coordonnées x, y et z des traces QPD atteindre un plateau.

7. Quantifier le total relâchement de tension

  1. Autre les traces enregistrées QPD (en volts) par la sensibilité étalonnée du piège optique, d'obtenir des traces respectives de nanomètres.
  2. Filtrer la trace de déplacement z x, y, et par un filtre passe-haut avec les couper à 10 Hz.
  3. Calculer la variance totale des traces filtrées représentant le mouvement brownien de la bille piégée. Calcul de la variance à 25 msec pour recouvrir les fenêtres de temps de 500 ms (10 000 points de données) 20. Le filtrage des traces passe-haut exclut les effets du mouvement brownien en raison de la fluctuation de la membrane ou le mouvement de l'actine corticale. Le mouvement brownien de la bille est réduite par les forces optiques et les forces d'adhérence sur la membrane cellulaire. Lorsque la membrane est tendue en raison de la libération des tensions sa viscosité augmente, et donc le mouvement brownien de la perle, détectée immédiatementdiatement après axotomy, commence à diminuer.
  4. Définir T0: début de la diminution de la variance du mouvement brownien, après la livraison de l'énergie laser UV. A l'instant t0 le temps indique le début de la déformation de la membrane.
  5. Définir t1: la fin de la diminution de la variance du mouvement brownien (quand il atteint un plateau). L'instant t1 marque la fin de la déformation de la membrane.
  6. Effectuer suivi vidéo des débris ou une égratignure sur le support de verre de couverture, afin de mesurer une éventuelle dérive de l'échantillon au cours de la mesure de force. Pour suivre la particule sur le support de verre, nous appliquons d'abord seuils des images brillantes sur le terrain, afin d'obtenir une pile d'images binaires avec la particule en blanc sur un fond noir. Ensuite, on suivre le centre de masse de particules avec une précision sous-pixel (en utilisant le logiciel ImageJ gratuit).
  7. Soustraire la dérive mesurée à partir des traces QPD déplacement. Multiplier les traces QPD dérive corrigée par la rigidité optique calibré respectif (k x, k z k) afin d'obtenir les traces Fz Fx, Fy, dans piconewtons.
  8. Calculer la trace de la force totale de F tot = √ (Fx ​​2 + 2 + Fy Fz 2).
  9. Calculer la libération totale de la force entre T0 et T1 comme F libéré = F tot (t1) - F tot (T0). La force mesurée à l'instant t0 doit être soustraite, car il est dû au déplacement de la sonde à partir du centre de la trappe, lorsque les adhère bourrelet à l'neurites.
  10. Calculer la surface de contact des neurites entre le bourrelet piégé et la position du spot laser UV: sur la mesure d'image de champ lumineux les longs (L) et à court axes (D) de la neurites entre le bourrelet piégé et la position du spot laser UV. La zone de contact axone est un axone = L x D.
  11. Normaliser la totale libérée force F publié par la zone de contact axone Un axone.

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Representative Results

La cellule génère des forces de traction sur le substrat par ses points d'adhésion. Force générée par les éléments du cytosquelette sont en équilibre avec la force antagoniste du substrat de culture. Après lésion induite par laser de la neurite, une partie des câbles tendus de cytosquelette sont perturbés et leur tension équilibrée est libéré en raison de la force antagoniste de l'adhérence du substrat est éliminé. La tension libérée est partiellement diffusé sur les adhésions focales ne sont pas touchés, et le cordon attaché à la membrane cellulaire, qui s'est tenue dans un piège optique, mesure la part d'une telle autorisation n'est contrebalancé par des éléments du cytosquelette d'ancrage de la cellule au substrat (voir schéma figure 1) .

Nous rapportons, dans la figure 2, un résultat représentatif du protocole expérimental décrit ci-dessus. Le neurone, la figure panneau de gauche 2a, présente une plus neurites, qui identifie l'axone de la différenciation neuron. Dans la figure panneau de droite 2a, le même neurone est affiché après la lésion axonale induite (indiqué par la flèche blanche). Figure 2b montre les traces de déplacement de perles enregistrées dans des directions z x, y et. Figure 2c rapporte le tracking vidéo d'une rayure sur le support en verre, pour prendre en compte et d'éliminer la dérive de la phase au cours de la mesure.

La figure 3A, sur le panneau de gauche, nous montrons le axones lésés, et la ligne blanche en amont du site de la lésion, où nous calculons le kymographe du diamètre des neurites lors de la mesure de libération de tension. Sur le panneau de droite est le kymographe, en montrant comment le diamètre des neurites augmente légèrement immédiatement après la lésion, puis devient plus mince en raison de la libération de la tension vers le corps cellulaire. Dans la Figure 3b, nous quantifions le résultat de kymographe. Le axones apparaît plus clair en ce qui concerne le fond puisque nous avons positionné l'attached perle dans le centre de mise au point de l'objectif, et donc l'axone est légèrement floue. En effet, par rapport à la somme des intensités des pixels le long de la ligne de kymographe à chaque trame de l'enregistrement vidéo en time-lapse, on obtient une estimation du diamètre axones lors de la libération de la tension. Sur le panneau 3c, nous rapportons la variance totale du talon ci-joint lors de la sortie de tension, calculé sur les traces enregistrées par l'interféromètre (figure 2b) après filtrage passe-haut à 10 Hz fréquence de coupure. Nous pouvons observer que l'écart augmente avec le diamètre axones lors de l'accumulation de matière en amont du site de la lésion. Alors, la variance commence à diminuer (à t0 sur la figure 3c) lorsque la membrane est tendue, et le diamètre des neurites diminue trop. La diminution de la variance atteint un plateau (t1 à la figure 3c), lors de la libération de tension cesse. Après t1, le mouvement brownien commence à augmenter à causede relaxation de la membrane peut-être en raison de l'exocytose 21 (voir figure 3c).

Dans la figure 4a, la case blanche indique l'estimation de la surface de contact des neurites Un axone avec le soutien de la culture. Un axone est calculée entre la position du spot laser UV et le centre de la sonde piège. Figure 4b rapports de la trace de l'amplitude du total libéré force F Autorisation obtenus après multipliant les courbes de déplacement de dérive corrigée Qpd (sur la figure 2b) par l'respectif calibré la raideur du piège optique (k x, k y, k z). Nous calculons la différence entre la force mesurée au temps t1 et t0 (ΔpN à la figure 4b), puis on divise par un axone, pour obtenir la tension libérée en termes de PN / um 2.

En répétant le même protocole sur différents neurones dans l'échantillon, nous pouvons commencersessions d'expériences sur plusieurs cultures traitées avec des facteurs chimiques ou étalées sur des supports différents, et enfin comparer la valeur moyenne obtenue dans les conditions expérimentales différentes. Dans la figure 5, nous montrons le relâchement de la tension après lésion axonale est atténué par les adhésions focales sur le substrat, donc une valeur de libération de tension plus élevée signifie un axone moins adhère au substrat. Parce que nous induire une partielle et non totale, lésion de l'axone, nous avons étudié la dépendance de la libération de la tension mesurée sur l'énergie totale délivrée, et sur la zone de contact entre axones site de la lésion et le talon piégé. Nous avons cherché à détruire des éléments du cytosquelette plus en offrant un plus grand nombre d'impulsions lumineuses, et donc induire une plus grande libération de tension. Sinon, avec une augmentation de la surface de contact des neurites, nous nous attendions à mesurer une quantité inférieure de relâchement de la tension. Dans la figure 5, nous montrons que la dépendance sur les deux paramètres précités estpas claire. Par conséquent, nous avons déduit que la lésion partielle induite (avec la faible énergie préalablement étalonné par impulsion; voir l'étape de protocole 4.5), est liée à la dimension de la tache d'ablation 8, qui ne varie pas pour un même objectif de microscope et la même énergie par impulsion à l'échantillon. En outre, le fait que le relâchement de la tension n'est pas corrélée à la zone de contact n'est pas surprenant car il est bien connu que ces paramètres ne représentent pas une bonne estimation de l'adhérence des cellules au substrat, comme les adhésions focales n'occupent que 1% de la surface de base 22.

Figure 1
Figure 1. Représentation graphique de l'équilibre du cytosquelette perturbé durant laser axotomie. Une cellule adhère à un substrat par des adhérences focales. Flèches bleues specify forces de traction générées par des éléments du cytosquelette (indiqué par des ressorts). Bleu clair flèches indiquent les forces antagonistes produites par le substrat de culture semi-rigide. Dans un scénario simplifié, avant la lésion, les forces de cytosquelette et le substrat sont appariés et équilibrée. Après lésion induite par laser de la neurite, les connexions entre certains ressorts et le substrat sont perturbées. Ainsi, le substrat n'est plus contrebalancer la force de traction de l'élément cytoskletal. Le bourrelet emprisonné, attaché à la membrane, les pistes de la direction des forces de cytosquelette clarifiés.

Figure 2
Figure 2. Suivi interférométrique d'un bourrelet emprisonné, attaché à la membrane de l'axone d'un neurone hippocampique pendant lésion induite par laser. (A) champ lumineux images acquises pendant l'ablation d'un axone. Avant la lésion sur le panneau de gauche. Après la lésion sur le panneau droit. Un bourrelet revêtu de poly-D-lysine est attachée à la membrane (polystirène bourrelet, Ø 4 um) et son maintien dans un piège optique. La puissance moyenne du laser IR à l'échantillon est de 14 mW. Flèche blanche indique le site de la lésion. Bar est à 5 um. (B) des traces enregistrées par en arrière plan focal interférométrie de la position perle dans le piège optique. Bleu, vert et rouge traces représentent la position z le long de bourrelet axes x, y, et, respectivement. le taux d'échantillonnage est de 20 kHz. (c) Déplacement d'une rayure sur le support de culture mesurée par suivi vidéo pour surveiller la dérive de phase. Traces bleues et vertes sont les positions x et y obtenues par suivi vidéo. Frame rate est de 5,5 Hz.

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Figure 3. Analyse du diamètre de l'axone lors de la sortie de tension, et la déformation de la membrane de l'axone lésé. (A) image de champ lumineux de l'axone lésé, sur le panneau de gauche. La ligne blanche perpendiculaire à l'axone indique la position à laquelle un kymographe est calculée. Sur le panneau de droite, kymographe du diamètre des axones, en amont du site de la lésion. Chaque ligne de la kymographe correspond à 0,18 sec. (B) Somme des intensités des pixels de chaque rangée de la kymographe représentant une estimation du diamètre des axones lors de la libération de la tension. (C) la variance totale du mouvement brownien de la bille fixée à l' axone (t0 et t1 indiquent respectivement le début et la fin du relâchement de la tension dans l'axone après dissection).

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Figure 4. Quantification de la tension libérée après axotomy. (A) de l'image lumineuse de terrain de l'axone lésé. La boîte blanche indique l'estimation de la zone de contact des neurites entre le site de la lésion et le centre de la bille piégée. (B) de trace de l'amplitude totale de la force mesurée après axotomie (F tot = √ (FX 2 + Fy 2 + Fz 2)). Fx, Fy, Fz et ont été calculés par la loi de Hooke (F = kx), où les traces de déplacement sont celles montrées sur la Figure 2b. Les rigidités dans les trois directions orthogonales, de la trappe optique ont été calculées par la méthode de spectre de puissance (k x, y = 7,9 pm, PN / k z = 2,3 PN / um). ΔpN indique la force libérée mesuré entre le moment instants T0 et T1.

Figure 5 Figure 5. La dépendance de la libération de tension mesurée sur la quantité d'énergie fournie à l'échantillon, et sur ​​la zone de contact axones. Des données provenant de 26 essais effectués sur les axones des neurones hippocamapal de souris à 3 DIV. (A) Diagramme de dispersion de la libération de tension par rapport à la surface de contact des neurites entre les lieux de perles lésion et emprisonné. (b) Diagramme de dispersion de la libération de tension par rapport à quantité totale d'énergie fournie à la zone de contact des neurites de l'échantillon.

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Discussion

Nous décrivons dans ce travail une méthode quantitative pour comparer l'adhérence des neurites au substrat de culture, en effectuant une mesure par spectroscopie de force simultanée pendant lésion cellulaire induite par laser. La libération mesurée de tension est liée au degré d'adhésion de la cellule au substrat: les cellules avec un plus grand nombre d'adhésions focaux devraient libérer moins de tension. Mesure de la libération de la tension en fonction de piconewtons fournit une quantité physique par lequel pour évaluer l'adhérence axonale au support de culture dans différentes conditions expérimentales 14.

Plusieurs laboratoires intégrés une dissection au laser avec un système pinces optiques, l'adoption de conceptions optiques distinctes 23. Notre choix s'est porté sur une configuration avec le chemin optique fixe et le mouvement de la platine du microscope. Pour ce faire, nous introduisons un modulateur spatial de lumière dans la trajectoire du faisceau laser infrarouge pour déplacer le point de piégeage par rapport à la position du laser UV. Bien galvanometric miroirs permettent de direction de la position de focalisation du laser, sans déplacer l'échantillon, ils peuvent introduire du bruit dans le système mécanique qui affecte les mesures de spectroscopie de force. En outre, nous avons décidé de repositionner la focalisation du laser IR de l'échantillon, depuis l'analyse du mouvement brownien permet un re-calibrage rapide de la rigidité optique. Le déplacement de la position de la tache laser UV sur l'échantillon peut produire des aberrations sphériques qui affectent la qualité de la tache de focalisation UV lui-même, ce qui est négligeable seulement pour de petits déplacements de la poutre partir de sa position centrale. Par conséquent, la modification des propriétés optiques de l'instrument de dissection laser pourrait nécessiter une calibration de novo de la puissance laser délivrée contre les dommages à l'entité.

Par mesure de spectroscopie de force, nous avons pu observer que le relâchement de la tension est composé d'une phase rapide de quelques secondes, et une phase lente qui pourrait durer quelques dizaines de secondes. Tel que rapporté dans les travaux antérieurs 14, parfois la lenteurphase pourrait durer quelques minutes. Pour cette raison, nous avons dû corriger la mesure de la force par le suivi d'un scratch sur le support de culture vidéo. À l'avenir, une meilleure approche serait d'annuler la dérive de la scène avec une boucle de rétroaction, qui corrige automatiquement la position de la platine du microscope par vidéo ou suivi interférométrique d'un cordon attaché au couvercle en verre. Ce type de configuration, déjà rapportée dans la littérature, il faut un second faisceau laser centré sur le talon ci-joint, et assure la stabilisation de la scène avec une précision sub-nanométrique 24,25.

À l'avenir, nous voulons appliquer le protocole mis au point pour comparer l'adhérence axonale au support de culture à différents stades de différenciation et dans différentes conditions pathologiques de fournir une analyse quantitative pour le traitement pharmacologique. Par ailleurs, le même protocole pourrait s'appliquer à la conception des supports implantables, de comparer l'adhérence neuronale aux différents types de matériaux avec distinct mechmécaniques ou chimiques des propriétés 26.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Alberto Guiggiani pour développer le système de contrôle en temps réel, Evelina Chieregatti et Hanako Tsushima des discussions perspicaces, Giacomo Pruzzo et Alessandro Parodi pour le développement de l'électronique et des logiciels personnalisés et Claudia Chiabrera et Marina Nanni pour leurs conseils d'expert et aide à la préparation de culture cellulaire.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated Bangs laboratories PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit Polyscience 19539
EQUIPMENT
IR laser IPG Laser GmbH YLM-5-SC-LP ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator Hamamatsu LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software Optics group, University of Glasgow Free downloadable software http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ Hamamatsu Free downloadable software http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD Thorlabs S5980 with C5460SPL 6041 board Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD Teem Photonics PDA100A-EC Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser AA-optoelctronics PNV-001525-040 Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator Olympus MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope Andor BX51 Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD Warner Instruments V887ECSUVB EMCCD
Peltier device Physic Instruments QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage National Instruments Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq NI PCI-6229 Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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