Protein Purification-fri metode til Binding Affinity Bestemmelse ved Microscale Thermophoresis

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Mikroskala thermophoresis (MST) kan anvendes bredt til bestemmelse af bindingsaffinitet uden oprensning af målproteinet fra cellelysater. Protokollen involverer overekspression af GFP-fusioneret protein, cellelyse i ikke-denaturerende betingelser, og påvisning af MST signal i nærvær af varierende koncentrationer af liganden.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Khavrutskii, L., Yeh, J., Timofeeva, O., Tarasov, S. G., Pritt, S., Stefanisko, K., Tarasova, N. Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis. J. Vis. Exp. (78), e50541, doi:10.3791/50541 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kvantitative karakterisering af protein interaktioner er afgørende i næsten ethvert område af biovidenskab, især lægemiddelforskning. De fleste af tiden tilgængelige metoder til K D bestemmelse kræver adgang til oprenset protein af interesse, generation, som kan være tidskrævende og dyrt. Vi har udviklet en protokol, der giver mulighed for bestemmelse af bindingsaffiniteten mikroskala thermophoresis (MST) uden oprensning af målproteinet fra cellelysater. Fremgangsmåden involverer overekspression af GFP-fusionerede protein og cellelysis i ikke-denaturerende betingelser. Anvendelse af metoden til STAT3-GFP udtrykt transient i HEK293-celler lov til at bestemme for første gang affiniteten af ​​velundersøgte transkriptionsfaktor til oligonukleotider med forskellige sekvenser. Protokollen er ligetil og kan have en bred vifte af ansøgning om at studere interaktioner af proteiner med små molekyler, peptider, DNA, RNA, og proteins.

Introduction

Kvantitative karakterisering af affinitet intermolekylære vekselvirkninger er vigtig i mange områder af biomedicinsk forskning. Bindende dissociationskonstant (K D) er væsentligt ikke kun i lægemiddelforskning, men er også en vigtig parameter i karakterisering af enhver binær interaktion i ethvert biologisk system. Biokemiske metoder til påvisning af protein-protein interaktioner, såsom immunoprecipitation og gær, to-hybrid skærme, ikke informere os om, hvordan stramt er de interaktioner, mens affinitet definerer, om denne særlige kompleks eksisterer under givne betingelser in vivo. I lægemiddelforskning processen er bindende assay udvikling en af ​​de nødvendige og ofte er de mest tidskrævende trin. Mest almindeligt anvendte metoder til K D bestemmelse omfatter fluorescenspolarisering, 1 overflade (SPR) teknologi, 2 radioligandbinding, 3 thermo titrering kalorimetri, 4 equilibrium dialyse (ED), 5 ultrafiltrering (UF), 5 og ultracentrifugering (UC). 6. Alle af dem kræver betydelige mængder af renset målprotein. Mikroskala thermophoresis (MST) er en rivende udvikling metode, der registrerer rettet bevægelse af molekyler i en mikroskopisk temperaturgradient. Eventuelle ændringer i hydrering skallen af biomolekyler resulterer i en relativ ændring af bevægelse langs temperaturgradient. 7. MST anvendes til at bestemme bindingsaffiniteter og er blevet anvendt til at studere ligandbinding til fluorescensmærkede proteiner eller fluorescerende ligander til et målprotein. 8, 9 MST tillader måling af interaktioner direkte i opløsning uden behov for immobilisering på en overflade (immobilisation-fri teknologi). Praktisk er nogen bindende ledsaget af en ændring i MST-signal, selvom størrelsen af ​​ændringen forskellig fra system til system betydeligt. Til påvisning af molekylet bevægelse ved MST, skal de være fluorescerernt. Denne store begrænsning af metoden kan vendes til en fordel. Hvis proteinet udtrykkes som et GFP-fusion i ethvert system, vil det være den eneste fluorescerende molekyle og kan således studeres uden isolering fra cellelysatet eller cellefrit ekspressionssystem. Generering af cellelysater der giver mulighed for bindende betingelser med minimale artefakter er den store udfordring. Her beskriver vi en protokol cellelysat forberedelse og MST eksperiment, der kan bruges til mange opløselige og membranproteiner.

STAT-proteiner er latente cytoplasmiske transkriptionsfaktorer aktiveres af tyrosinphosphorylering som respons på ekstracellulære signaler og er involveret i mange biologiske processer, herunder immunitet, hæmatopoiese, inflammation og udvikling. 10. I pattedyr STAT familien består af STAT 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B og 6. Alle aktiverede STATs er kendt for at binde til den samme DNA-sekvens, såkaldt GAS motiv, IFN-gamma aktiveret sekvens. Imidlertid transcriptional virkninger af forskellige statistikinterval er meget anderledes. 11. På trods af engagement i mange patologiske processer og omfattende undersøgelser der giver over 17.000 publikationer, har K D STAT interaktioner med forskellige DNA-sekvenser ikke blevet bestemt. Kun relative affinitet forskellige statistik til varianter af GAS motiv er blevet karakteriseret. 11 Vanskeligheder med protein ekspression og oprensning er de store hindringer i karakterisering af Stats »DNA bindende selektivitet. Selv om de fleste af de undersøgelser har fokuseret på den rolle "aktiveret" Stats, der blev synonym til Tyr-phosphoryleret transskription faktor, rolle ikke-phosphoryleret STATs (U-stats) i regulering af transskription er ved at opstå hurtigt. 12. Imidlertid disse mekanismer er dårligt forstået, og det var uklart, om U-Stats faktisk binder sig til DNA eller handle gennem interaktioner med andre transkriptionsfaktorer. Vi har for nylig vist, at U-STAT3 kan binde til DNA sekventielleces forskellig fra GAS motiver med endnu højere affinitet. 13. Konstateringen har betydelige konsekvenser for vores forståelse af de biologiske funktioner af dette vigtige protein. Vi har anvendt mikroskala thermophoresis at bestemme relative affiniteter STAT3 til GAS og AT-rige oligonukleotid S +100 (Figur 4). Næsten identisk protokol er blevet anvendt til K D bestemmelse for binding af et andet STAT3 ligand, en lipopeptid inhibitor. 14. Ingen binding til en beslægtet transkriptionsfaktor, GFP-STAT1 der blev anvendt som en negativ kontrol kunne påvises således bekræfter selektiviteten af interaktion. 14

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Fremstilling af cellelysat

Denne protokol er beregnet til adhærente celler, der udtrykker enhver GFP-fusioneret protein. Nødvendigt celletal kan variere fra så lavt som 10 6 til så mange som 20 x 10 6 celler, afhængigt af niveauet af protein-ekspression. For eksempel blev lysat af HEK-celler overudtrykker GFP-STAT3 fremstilles ved behandling af celler dyrket i 10 T75 kolber til nær 70% sammenflydning med 1 ml lysisbuffer. Men denne lysat måtte fortyndes 150 gange for at give optimal niveau af fluorescens for MST eksperiment. Cellelyse protokol afhænger meget af de egenskaber og intracellulær lokalisering af proteinet omfattet af undersøgelsen. Hvis bruger rengøringsmidler er uønsket på grund af protein-ustabilitet, sonikering beskrevet nedenfor, kunne være det bedste valg. Forskellige additiver kan tilsættes til lysisbuffer at forhindre protein modifikation reaktioner: EDTA forhindrer phosphorylering, natriumvanadat hæmmer tyrosin proteinphosphataser, sådium fluorid er en inhibitor af Ser / Thr fosfataser.

  1. Forbered lysisbuffer. For nemme at udtrække cytoplasmiske proteiner følgende sammensætning fungerer godt: 25 mM Tris HCl, pH 8,0, og proteasehæmmer cocktail fortyndes 100 gange (Sigma-Aldrich P2714, bestående af 2 mM AEBSF, 0,3 uM aprotinin, 130 pM bestatin, 1 mM EDTA, 14 uM E-64, 1 uM leupeptin). Alternativt, for mindre opløselige proteiner, kan man bruge kommerciel RIPA-buffer med proteasehæmmere cocktail og ikke-denaturerende detergenter. Hold puffer på is.
  2. Vask cellerne kortvarigt med iskoldt PBS ved hjælp af 10 ml buffer pr T75 kolbe. At holde cellerne på is i 5 minutter, eller indtil cellerne begynder afmontere fra kolben. Skrabe cellerne med celleskraber at løsne evt.
  3. Resuspender cellerne i 10 ml iskold PBS og overføres til en forafkølet 14 ml rundbundet centrifugeglas.
  4. Pellet cellerne ved centrifugering ved 400-600 xg ved 4 ° C i 5 min. Kombiner celler fra flere kolber på dette punkt jegf nødvendig.
  5. Fjern PBS supernatanten og resuspender pellet i 200 pi iskold lysepuffer, overføre suspensionen til en pre kølet 1,5 ml Eppendorf-rør.
  6. At holde cellerne på is for at minimere lokal overophedning. Lyse celler med 3x 10 sek pulser af lydbehandling ved 30% amplitude ved hjælp af en 2-3 mm forafkølet spids. Hold spidsen under overfladen for at minimere skumdannelse. Udelade dette trin, når bruger vaskemiddel indeholdende puffer og inkuberes på is i 30 minutter i stedet.
  7. Ret lysatet løsning at indeholde fysiologisk saltkoncentration (100 mM NaCl) om nødvendigt ved anvendelse af 5 M NaCl.
  8. Saml lysater ved centrifugering ved ca 26.000 xg ved 4 ° C i 10 min.
  9. Bestem den optimale lysat fortynding (som beskrevet i afsnit 3 nedenfor) og mængden af ​​lysat nødvendig for en enkelt titrering (typisk omkring 300 ul forfortyndet lysat).
  10. Afmål lysatet og opbevares ved passende temperatur for proteinet under undersøgelse (-80 ° C, i de fleste tilfælde).
  11. </ Ol>

    2.. MST Buffer Valg og forberedelse

    1. Da protein-ligand interaktioner er afhængige pufferbetingelser er MST buffer sammensætning udvælges baseret på egenskaberne af et bestemt system. Det er generelt fordelagtigt at teste mindst to forskellige buffere.
    2. Forbered 2 5x MST buffere. Vi havde gode erfaringer med disse to sammensætninger: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4, 25 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 0,25% NP-40) og Tris HCI (250 mM Tris HCI, pH 7,4; 750 mM NaCI; 50 mM MgCI2, 0,05% Tween-20). Tilsætning af BSA (5% i den endelige bindende blanding) kan hjælpe med at forhindre vedhæftning af proteiner til plastrør og glas kapillærer. NaN3 (0,5 mM) kan også inkluderes for at forhindre vækst af mikroorganismer.

    3.. Bestemmelse af Optimal Lysate Udvanding

    1. Vælg LED excitationskilden med bølgelængden λ = 470 nm på MST instrumentet.
    2. Load kapillærer med cell ekstrakt fortyndet 2 og 10x med MST buffer.
    3. Udfør "Find Kapillærer" drift på Control Software af MST-instrument. Det optimale fluorescens interval i fortyndet lysat er fra 400 til 1.500 fluorescensenheder.

    4.. Bestemmelse af den optimale ligandkoncentration Range

    1. Den højeste koncentration af liganden skal være mindst 20x højere end den forventede dissociationskonstant.
    2. Den laveste ligand koncentration bør være lavere end molære koncentration af det fluorescerende protein.

    Der henvises til NanoTemper Technologies Koncentration Finder værktøj til ligandkoncentrationen rækkevidde skøn.

    5.. Fremstilling af cellelysat og Ligand Fortyndinger

    1. Placer et rør rack med en tiltrængt nummer (normalt 10-16) i 0,5 ml LoBind centrifugerør på is. Afpipetteres 25 ul af MST-puffer til bunden af ​​hvert rør. Tilsæt 25 gl af liganden stamopløsning til det første kare (# 1, ligand højeste koncentration) og udføre serielle to gange fortynding af liganden bruge resten af ​​rørene. Hold rack med ligand prøver på is.
    2. Thaw cellelysat langsomt på is.
    3. Fortynd cellelysat med MST puffer til tilvejebringelse af det optimale niveau af fluorescerende målprotein i de bindende reaktioner. Slutproteinkoncentrationen bør være tæt på forventede K D eller lavere. Det bør justeres for at opnå det nødvendige antal fluorescens tællinger i den endelige løsning. Til bestemmelse af GFP-STAT3 koncentration i lysatet blev instrumentet kalibreres med en hjælp af fluorescein. Den molære koncentration af GFP i lysatet blev bestemt under anvendelse af forholdet mellem fluorescein og EGFP kvantumudbytter, 0,85 og 0,61 hhv. 15.

    6.. Mikroskala Thermophoresis bindingsstudier

    1. Vælg LED excitationskilden med λ = 470 nm på MST instrumentet.
    2. Place 0.5 ml LoBind rør i tUbe rack tværs fra rør med ligand seriefortynding prøver. Tilsæt forsigtigt 15 pi af cellelysatet til bunden af ​​hvert rør. Prøv ikke at røre rørvægge at undgå prøven tab.
    3. Tilsæt 15 gl af liganden prøven med den højeste koncentration (# 1) til den tilsvarende rør # 1 med cellelysatet. Bland godt og ændre en pipettespids. Gentag dette trin med resten af ​​rørene undtagen den sidste, som skal indeholde nogen ligand.
    4. Tilsæt 15 ul MST buffer til det sidste rør og bland godt.
    5. Fyld ca 2/3 af den første kapillar med den bindende blanding fra røret # 1, vippe den til at bevæge opløsningen mod centrum, og placer kapillarrøret på den kapillære skuffen til den position # 1 (den tætteste position til bakkeåbningen) . Gentag dette trin med resten kapillærer. Kapillære ender kan sættes med voks til længere eksperimenter.
    6. Placer bakken inde i MST instrumentet og luk instrumentets dør.
    7. Udfør "Find Kapillærer"kommando til at lade instrumentet finde nøjagtige positioner af kapillærer og måle fluorescens af prøverne.
    8. Baseret på fluorescens signal intensitet, power LED (fra 10-100%) for at bringe det i 400-1,500 enheder interval justere.
    9. Klik på "Start" knappen for at udføre thermophoresis eksperiment. Mere end én IR-laser magt kan vælges for eksperiment med henblik på at finde den optimale temperatur gradient i det pågældende system. Indsaml data 2-3 kørsler for det samme sæt af kapillærer til at sikre reproducerbarhed af målingerne. Det tager 10-12 minutter at køre et sæt af 16 kapillærer.

    7.. Mikroskala Thermophoresis Dataanalyse

    1. Åbn Analysis software.
    2. Indlæse projektet mappen. I dukkede Information Run Viewer vælge indsamlet i en bestemt IR laser magt thermophoretic kurver. Der er en mulighed for at åbne alle thermophoretic spor indsamlet under forskellige forhold såsom IR laser magt, LED power, temperatur, koncentration, etc.. på én gang, og derefter vælge de kurver til analyse ved at skifte dem til og fra (klik på eksperimentets navn).
    3. I evalueringen Points grafvinduet, vælg thermophoresis eller thermophoresis med T-jump. Sørg for, at blå og røde linjer er placeret korrekt. For at opnå de midlede punkter med standardafvigelser, skal du vælge "Anvend Average" eller "Skelne kører" for separate kørsler.
    4. At plotte en dissociationskonstant pasform, skal du vælge "Brug Average", indtaste og fastsætte mærkede molekyle koncentrationen værdi (tjekke "koncentrationen" firkantet i et anfald vindue menu), og passer kurven. K D-værdi med sin standardafvigelse vises i en separat information pop-up vindue. At plotte en fit hjælp Hill, skal du vælge "Gennemsnit", Hill-metoden, og derefter montere kurven. EF 50 affinitet værdi med sin standardafvigelse er vist i dette tilfælde. Funktionen af K D eller Hill "kant" kan også udnyttes, når mætningi en bundet tilstand ikke er nået.
    5. Gem de gennemsnitlige fit data i en tekstfil og overføre til Excel.
    6. Plot F norm (normaliseret fluorescens), bf normen (forskel i normaliseret fluorescens hvis forskellige eksperimenter sammenlignes), eller Fraktionen bundet (se formlen nedenfor) som en funktion af det umærkede (titreret) molekyle koncentration.

    Fraktionen bundet (fraktion af molekyler i et kompleks) = (Therm (C)-ubundet) / (bundet-ubundet), hvor Therm (C) er thermophoresis målt for koncentration C, ubundet er thermophoresis for ubundet tilstand (når molekyler er ikke i en kompleks), og bundet er thermophoresis for helt bundet tilstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Måling af affiniteten af ikke-phosphoryleret STAT3 proteinbinding til oligonukleotider.

HEK293 celler, der udtrykker STAT3-GFP blev anvendt som en kilde for fluorescensmærket STAT3 for DNA bindingsassay. Cellelysater blev fremstillet ved hjælp af RIPA-buffer (20x10 6 celler / ml). For bindingsundersøgelser blev lysaterne fortyndedes 150x med MST DNA-bindingspuffer for at give det optimale niveau af det fluorescerende protein i bindingsreaktionen (ca. 20 nM). Ikke-transficerede HEK293-celler er blevet anvendt til at evaluere baggrundsfluorescens, som viste sig at være ikke-påviselige selv i ikke-fortyndet lysat. Dog kan baggrundsfluorescens være større i andre ekspressionssystemer og skal således overvåges. Titrering rækken bestående af 11 bindingsblandinger og lysatprøve uden liganden er blevet fremstillet. Hver prøve indeholdt 15 pi fortyndet cellelysat og 15 pi af oligonucleotider opløsninger af varierende koncenioner. Slutbuffer sammensætning omfattede 25 mM HEPES, pH 7,2, 50 mM NaCl, 2,5 mM MgCl2, og 0,025% NP-40. Målingerne blev foretaget i standard behandlet kapillærer på Monolith NT.115 instrument bruge 50% IR-laser magt og LED excitationskilde med λ = 470 nm ved omgivelsestemperatur. Binding af stærkt ladede oligonukleotider medført betydelige ændringer i STAT3 mobilitet i temperaturgradient (Figur 2). I figur 3 er thermophoretic signal afbildet som en funktion af oligonukleotid koncentration. Hvert datapunkt repræsenterer middelværdien af ​​tre målinger. NanoTemper Analysis 1.2.20 software blev brugt til at passe data og fastlægge de tilsyneladende Kd-værdier. De tilsyneladende dissociationskonstanter var 37,9 ± 1,0 uM og 23,3 ± 0,6 uM til GAS og S +100 henholdsvis (figur 4). Substitution af A-til-G resulterede i en dramatisk nedgang i affinitet S +100 mut # 1 (figur 4), mens mutig S +100 mut # 2 viste ingen påviselig binding bekræftede således sekvens-selektiv binding af STAT3 til S +100. Overraskende, S 100 sekvenser vises en anelse tættere binding end GAS i tre målinger gentagelser.

Figur 1
Figur 1. Samlet ordning af forsøget. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Ubehandlede thermophoresis data genereret til vekselvirkningen mellem GFP-STAT3 med AT-rige oligonukleotid. Fortyndet cellelysat containi ng 20 nM GFP-STAT3 blev blandet med stigende mængder af dobbeltstrenget oligonukleotid (5'-AAAACAAAACGAAACAAACAAACTA), hvilket gav de specificerede koncentrationer af liganden. Dataene blev indsamlet på 50% laser magt og 100% LED.

Figur 3
Figur 3. Bindende kurve genereret af NanoTemper Analyse 1.2.231 softwaren. Normaliseret fluorescens (varm fluorescens / indledende fluorescens) er afbildet som en funktion af oligonukleotid koncentration. Proteinet viser en stigning i fluorescens i den bundne sammenlignet med ubundet tilstand. Dataene er monteret ved hjælp af Hill ligningsmetode inkorporeret i NanoTemper Analysis-softwaren.

0541fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50541/50541fig4.jpg "/>
Figur 4.. STAT3 binding til oligonukleotider med forskellige sekvenser. Mikroskala thermophoresis bindende målinger af STAT3-GFP til GAS (K D = 37,9 ± 1,0 uM), S 100 (K D = 23.3 ± 0,6 uM), S +100 mutant 1 (K D = 740 ± 21 uM) og S +100 mutant 2 (ikke bindende). Den STAT3-GFP koncentrationen blev holdt konstant på omkring 20 nM, og koncentrationen af ​​oligonucleotider varierede fra 666 til 0,650 uM. Forskellen i normaliseret fluorescens [‰] er afbildet som en funktion af oligonukleotid koncentration, og kurver er monteret ved hjælp af Hill fremgangsmåden NanoTemper Analysis-softwaren. Fejlsøjler repræsenterer standardafvigelsen af ​​3 målinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Proteinekspression og oprensning er en omstændelig og dyr trin, som er imidlertid nødvendig til bestemmelse af interaktioner 'K D af mest anvendte metode. Anvendelse af MST tillader undgå proteinoprensning dermed væsentligt forenkle og fremskynde kvantitativ karakterisering af interaktioner. Den præsenterer særligt betydelige fordele i tilfælde af svære at udtrykke og oprense proteiner, såsom membranproteiner og transkriptionsfaktorer.

Den største begrænsning og kravet om MST er evnen til at udtrykke et protein, som en fusion med grønt fluorescerende protein. Men konstruktioner til ekspression af flertallet af GFP-kondenserede humane og muse-proteiner er kommercielt tilgængelige. GFP-fusionerede proteiner er også meget brugt til menneskehandel og nedbrydningsstudier og dermed kan tjene "dobbelt pligter" i kombination med MST studier.

Ud over manglen på behov for protein purification, meget økonomisk brug af alle reagenser og ufølsomhed over for små variationer i puffersammensætninger, MST tilbyder andre fordele i forhold til traditionelle metoder til K D bestemmelser. I modsætning overfladeplasmonresonans, tage MST-baserede eksperimenter mindre end 2 timer, tillader bestemmelse af KD i bredere spektrum og ikke lider af overfladen immobilisering artefakter. For eksempel kunne vi ikke bestemme K D for STAT3 binding til oligonukleotider ved SPR, selv om vi har investeret betydelige beløb af midler til indkøb af renset STAT3 protein. KD af interaktionen var for høj, hvilket ofte er tilfældet for transkriptionsfaktorer, og faldt ud af SPR eksperiments koncentrationsområde.

Titrering kalorimetri virker kun for interaktioner, der er ledsaget af ændringer i enthalpi. Denne begrænsning udelukker mange tilfælde. I mellemtiden, ændringer i thermophoretic mobilitet, selvom du er meget forskellige i værdier for different systemer forekomme et stort flertal af interaktioner. En af de største fordele ved MST er, at det virker i en række forskellige buffere og tolererer tilstedeværelsen af ​​vaskemidler, miceller og bicelles i systemet. Denne egenskab giver at anvende det på membranproteiner, der er praktisk taget umuligt at studere med andre midler. Dog skal der udvises forsigtighed for at undgå de variationer i detergent og miceller indhold og sammensætning under titreringen med liganden.

Det bør også holdes for øje, når du bruger celleekstrakter at proteinet under studiet kan eksistere i sin native form, hvilket ofte er et kompleks med andre proteiner, nukleinsyrer og cofaktorer. Således kan bindingsaffinitet være forskellig fra den for et isoleret protein ikke involveret i komplekse formationer. Overekspression ofte tillader titrering ud samspillet partnere forlader de fleste af molekylerne af proteinet under undersøgelse i ikke-bundne tilstand. Dette er en anden grund til at forsøge at achieve meget høje ekspressionsniveauer af GFP-fusioneret protein på celler transfektion. Den anden svære at kontrol parameter er posttranslationelle modifikationer, der også kan give en betydelig heterogenitet til systemet. Yderligere begrænsning undersøger binding til proteiner og små molekyler, der er til stede i cellelysater i store mængder eller molekyler med bred specificitet og lav affinitet, der kan interagere med flere proteiner til stede i lysatet. Wienken, CJ, et al. har fundet, at K D bestemmes ved MST i E. coli-ekstrakt var mere end en størrelsesorden højere end i en buffer for interaktionen af interferon gamma med antistoffer 9. Virkningen kan have været delvis skyldes proteolyse, da ekstrakten havde ingen proteasehæmmere. Lille molekyle binding til serumalbumin blev også fundet at ændre K D i samspil undersøgelser af MST 9..

Effekten af ​​udvindingen kan også variere alt efter Forskelnt proteiner afhængig intracellulær lokalisering og fysisk-kemiske egenskaber. Således er det nyttigt at prøve flere cellelyse og proteinekstraktion betingelser. For cytoplasmiske proteiner, uden brug af rengøringsmidler bare ultralyd cellesprængning ofte producerer meget gode udbytter og data. I mellemtiden, membranproteiner kræver mere omfattende screening af ekstraktionsbetingelser med varierende koncentrationer og arten af ​​vaskemidler, lipidmiceller eller bicelles. Vaskemiddel indhold skal holdes på minimum for at undgå at påvirke bindingsaffinitet.

På trods af de anførte begrænsninger, har vi fundet MST studier af ikke-oprensede GFP-fusionerede proteiner at være meget bekvemt for kvantificering af bindingsaffiniteter for mange proteiner og ligand typer. Der er ingen tvivl om, at øget anvendelse af metoden i mange laboratorier vil tillade yderligere udvide anvendelser af MST-baserede Proteinbindingsforsøg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser. Indholdet af denne publikation afspejler ikke nødvendigvis de synspunkter eller politikker af Department of Health og Human Services, heller ikke omtale af firmanavne, kommercielle produkter eller organisationer endossering af den amerikanske regering.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af Intramural Research Program for NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research, Collaborative Research Aftale mellem NCI og Calidris Therapeutics, American Cancer Society tilskud IRG 97-152-17 til OT og føderale midler fra National Cancer Institute, NIH, under kontrakt HHSN26120080001E.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RIPA buffer Millipore 20-188 Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail Sigma-Aldrich P2714
Monolith NT.115 NanoTemper Technologies GmbH G008
Monolith NT.115 Capillary Tray NanoTemper Technologies GmbH T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries NanoTemper Technologies GmbH K002
NT Control software NanoTemper Technologies GmbH 2.0.2.29
NT Analysis software NanoTemper Technologies GmbH 1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge Eppendorf 5417R Other microtube refrigerated centrifuges providing
Protein LoBind Tube 0.5 ml Eppendorf 22431064

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
  2. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  3. Hulme, E. C., Trevethick, M. A. Ligand binding assays at equilibrium: validation and interpretation. Br. J. Pharmacol. 161, 1219-1237 (2010).
  4. Ghai, R., Falconer, R. J., Collins, B. M. Applications of isothermal titration calorimetry in pure and applied research--survey of the literature from 2010. J. Mol. Recognit. 25, 32-52 (2012).
  5. Vuignier, K., Schappler, J., Veuthey, J. L., Carrupt, P. A., Martel, S. Drug-protein binding: a critical review of analytical tools. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398-3953 (2010).
  6. Lebowitz, J., Lewis, M. S., Schuck, P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079 (2002).
  7. Duhr, S., Braun, D. Why molecules move along a temperature gradient. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 19678-19682 (2006).
  8. Zillner, K., Jerabek-Willemsen, M., et al. Microscale thermophoresis as a sensitive method to quantify protein: nucleic acid interactions in solution. Methods Mol. Biol. 815, 241-252 (2012).
  9. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100 (2010).
  10. Stark, G. R., Darnell, J. E. The JAK-STAT pathway at twenty. Immunity. 36, 503-514 (2012).
  11. Ehret, G. B., Reichenbach, P., et al. DNA binding specificity of different STAT proteins. Comparison of in vitro specificity with natural target sites. J. Biol. Chem. 276, 6675-6688 (2001).
  12. Yang, J., Stark, G. R. Roles of unphosphorylated STATs in signaling. Cell Res. 18, 443-451 (2008).
  13. Timofeeva, O. A., Chasovskikh, S., et al. Mechanisms of unphosphorylated STAT3 transcription factor binding to DNA. J. Biol. Chem. 287, 14192-14200 (2012).
  14. Timofeeva, O. A., Tarasova, N. I., et al. STAT3 suppresses transcription of proapoptotic genes in cancer cells with the involvement of its N-terminal domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (2013).
  15. Patterson, G., Day, R. N., Piston, D. Fluorescent protein spectra. J. Cell Sci. 114, 837-838 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics