マウス肺の病理生理学を研究するための非侵襲的気管内挿管

Medicine

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Summary

ヒトにおける肺疾患の状態を模倣するモデルの使用は、特定の疾患の病態および/または病因を研究するため、および治療的介入を開発するために重要である。ここで直接マウス肺への外因性材料を提供することができ、非侵襲的気管内挿管法が提示されている。

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Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung. J. Vis. Exp. (81), e50601, doi:10.3791/50601 (2013).

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Abstract

ヒトにおける肺疾患の状態を模倣するモデルの使用は、特定の疾患の病態および/または病因を研究するため、および治療的介入を開発するために重要である。一緒に遺伝情報の膨大な量のノックアウトおよびトランスジェニック誘導体の増加可用性と、マウスは肺疾患の病態生理学の基礎をなす分子メカニズムを研究するための最良のモデルのいずれかを提供する。吸入、鼻腔内注入、気管内注入、および気管内挿管は、マウスの肺に興味のある資料を管理するための多くの研究者によって、最も広く使用されている技術である。研究の目的に応じて、各技術に対する長所と短所があります。ここで直接マウス肺への外因性材料を提供することができ、非侵襲的気管内挿管法が提示されている。この技術は、肺線維症を研究するためのモデルとして、マウスの肺にブレオマイシンを投与するために適用した。</ pの>

Introduction

肺は、多くの破壊的な病気は、一般的に診断されている器官である。これらの中でも、肺癌は、男性および女性の両方において二番目に診断される癌、および癌死亡の最も一般的な原因である。また、肺気腫や慢性気管支炎として知られている慢性閉塞性肺疾患は、非常に深刻な病気、米国の死因の第3位である。 2011年に、それは2590万アメリカ人が18歳未満の710万子どもを含む、喘息を持っていたと推定された。喘息は、15(米国肺協会、歳未満の子供たちの間で入院の3番目の主要な原因であるhttp://www.lung.org )。これらの壊滅的な疾患やその基礎となるメカニズムの病態生理および/または病因を研究するために、正確なモデルを使用すると、肺への関心のある様々な材料の簡便かつ非侵襲的投与とともに重要です。マウスはに最高のモデルのいずれかを提供なぜならノックアウトおよびトランスジェニックマウスの増加可用性と利用可能な遺伝情報の膨大な量の肺疾患の病態生理学の基礎をなす分子メカニズムを研究。

様々な方法は、吸入、鼻腔内注入、気管内注入、および気管内挿管1-4を含むマウス肺への関心の資料を提供するために様々な設定で多くの研究者によって使用されている。それは実行するためにはかなり難しいと考えられているので、後者の方法は、日常的に使用されていない。ここに記載さ気管内挿管は、遺伝子発現パターン、病理学および/ ​​または肺5の生理学上の納入材料の効果を研究するために、マウスの肺に興味のある材料を提供する、非侵襲的、シンプルかつ迅速な方法である。この技術は、肺全体に外因性物質の送達を保証する、任意の生存手術を伴わないのでlikelうYは任意の制度上の動物のケアと使用委員会の承認を得なければ。

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Protocol

次のプロトコルは、マウスの肺に興味のある材料を提供する、非侵襲的、シンプルかつ迅速な方法について説明します。この手順は、国立がん研究所動物実験委員会によって承認された。

1。麻酔

  1. まず、ケタミンおよびキシラジン(それぞれ100 mg / kg体重〜10 mg / kg体重)の混合物を使用して、マウスを麻酔。これはACUCお勧め麻酔および用量である。この量で、マウスは、少なくとも約20分間意識不明である。
  2. 麻酔中、目の乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医軟膏を適用します。
  3. 数分後、意識を確認するために、マウスの足を挟ま。一度意識不明が確認され、約60°の角度をなす挿管スタンドにマウスを置き、スタンドの上部にある小さなゴムバンドの上の上顎をフックして所定の位置に保持する。

2。気管内挿管

  • 静かに、Q-ティップを使用して一方の側にマウスの舌を引っ込める。
  • BioLITE挿管照明システムを使用する際に喉頭を光ファイバーライトガイドを用いて可視化されるまで、慎重に挿管システムを挿入します。
  • 喉頭蓋や披裂軟骨が可視化されるとカテーテルの適切な長さが挿入されるまで、喉頭蓋の上および披裂軟骨間のファイバを挿入し、前進。
  • 注:挿入するカテーテルの適切な長さを得るためには、最初に事前に同様のサイズの実践マウス( 図1)を用いて口や気管支の分岐点との間の長さを測定する。長さは、主にマウスのサイズによって異なります。カテーテルの挿入は、分岐点(体重〜25グラムとマウス用の約1.5 CM)の上に停止する必要があります。これは挿管された物質は、すべての葉に行くことが保証されます。少なくとも50の練習MICeは(熟練が挿管の成功率は95%以上であることを意味する)技術で習熟する挿管を行う人に必要とされ得る。

    1. カテーテルが挿入されると、すぐに動物が普通に呼吸できるようにするために、カテーテルから光ファイバーライトガイドを取り外します。挿管照明システムを使用しない場合、直接に記載されるようにカテーテルを挿入する。
    2. カテーテルへの関心のある物質を含有する溶液を加える。溶液を添加直後の肺に吸入されていることを確認してください。 〜25gのマウス体重のための50マイクロリットルを、日常的に使用される。

    3。動物の回復

    1. とすぐに溶液が肺に吸い込まれるように、スタンドからマウスをダウンさせると、元のケージに戻します。
    2. それが動き始めるまで、マウスを観察します。
    3. 一度マウスが良好な状態であることが確認でき、ラックにケージを戻す。

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    Representative Results

    最初に、緑色の染色溶液を練習するためのマウスに挿管するために使用した。肺は、色が肺( 図2)で配布されたかを均等に検討すること挿管直後に切除した。この技術は、C57BL / 6マウスを用いたブレオマイシン誘発肺線維症を研究するために適用した。マウスを気管内に制御のようブレオマイシンまたは生理食塩水の1.2 U / kgの挿管し、3週間後に剖検したときに、マウスは組織学および増加ヒドロキシプロリン含有量( 図3)でサポートされている、それらの肺全体にブレオマイシン誘発線維症を発症した。損傷領域は、20X対物レンズを用いて評価した肺の画像及び121点の格子グリッドを作成した。繊維質領域の上に落下する交点の数(点)の合計(121)点の割合としてカウントされ、発現させた。このようにして計数損傷領域の割合は、ブレオマイシン投与した( 図4)の量に比例した。

    キープtogether.withinページ= "常に">:FO」jove_content」 図1
    図1。マウスの気管のイラスト 。赤いバーや矢印は測定が練習マウスを使用して挿管する前に注意してください長さを示している。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください

    図2
    図2。右の緑の色素を挿管した後の肺の外観 。染料の色は、肺の大部分に見られる場合には、挿管が成功したとみなされる。ad/50601/50601fig2highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

    図3
    図3。ブレオマイシンの気管内挿管により誘発される線維性の肺の代表的な画像 。 C57BL / 6マウスは、対照(A、C)などのブレオマイシンの1.2U/kg(B、D)または生理食塩水を挿管し、それらの肺を組織学的にブレオマイシン投与後21日目に調べた。倍率:A、B:40X、C、D:100X。コントロールおよびブレオマイシン治療肺のために21日目に測定された肺のあたり(E)のヒドロキシプロリン含量。 = 6、N、***:p <0.001は、 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください


    図4。ブレオマイシン投与量および肺の損傷部位との関係 。ブレオマイシンの増加量(0.5、1、2、U / kg)を比例的に被災地の割合を増加させた。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください

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    Discussion

    ここで説明する気管内挿管は、均等に、マウスの肺に興味のある材料を提供する、シンプルでありながら優れた非侵襲的な方法です。この方法は、効果および/または生理学および/または肺の病理に投与物質の役割の研究を可能にする。投与物質は、このような生体異物化学/医薬品、発がん性物質、汚染物質、アレルゲン、または6月10日 、様々なヒト疾患を研究するためのモデルを表すことができ、様々な肺の状態を招くウイルスなどのサイトカイン、または外因性材料などの内因性の分子であり得る。この技術は、恒常性、生理学的、病理学、および/または肺の発癌におけるこれらの遺伝子の役割を研究するために、気道上皮細胞における目的の遺伝子の過剰発現または欠失を導入するために、組換えアデノウイルスまたはレンチウイルスと組み合わせて使用​​することができる。遺伝子の破壊は、中のフロックス遺伝子を破壊するために一過性の上皮細胞にCreリコンビナーゼを発現させることによって達成することができる上皮細胞11にterest。

    カテーテルは簡単に​​誤って気管に並置され、食道に挿入することができます。ここで説明する方法では、挿管照明システムは、カテーテルを5に挿入されるべき正しい位置にガイダンスを提供します。システムが安定して光源と、光は、光ファイバのファイバに集中することができ、特別に操作された小型の光学レンズ系に接続される光ファイバのファイバからなる。光ファイバー繊維の送出端は、気管内チューブとして使用されている使い捨て静脈カテーテルに適合します。このシステムは、挿管時の喉頭の明確な可視化を可能にする、中咽頭の直接照明を提供しています。いずれかの照明システムを使用してこの手法を実施する際に熟達なると、システムの使用はもはや必要ではない。手順は、効率的にのみ、カテーテル、全体のpを用いて行うことができるrocedureはわずか数分かかります。全く同じ方法で、より大きなサイズの照明システムまたはカテーテルを有するラットを用いることができる。

    3点に均等に肺全体に材料を分配するために重要である。まず、常にカテーテル( 図1)練習のマウスを使用して挿入する方法を深くするという考えを持つために挿管前に口や気管支分岐点間の長さを測定します。これは主に、マウスの大きさに依存するので、それが特定のサイズのマウスについて決定されると、同一の挿入長さを使用することができる。第二に、挿管チューブに添加した溶液を、右側の添加後に吸引されていることを確認してください。挿管チューブを誤って食道に挿入されると、溶液は直ちに吸引され、従って、チューブ内に留まることはない。このような場合は、挿管のプロセス全体を繰り返します。この確認プロセスは、溶液中ではなく、気管内にあることを保証する食道。オペレータは、溶液が肺に吸入されていない場合は、全体挿管手順を繰り返して、最大で3倍を試すことができます。これが頻繁に発生する場合は、それは、より高い成功率を獲得するために戻って練習に行くことをお勧めします。最後に、マウスは、マウスが挿管されたもの吐き出すしないことを保証挿管、中に意識不明にする必要があります。この意味でも、物理的に挿管を妨げる可能性がノーズコーンとイソフルランの使用は推奨されません。

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    Disclosures

    著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

    Acknowledgements

    この作品は、国立癌研究所、癌研究センターの学内研究プログラムによってサポートされていました。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    KetaVed Vedco Ketamine
    AnaSed Injection 20 mg LLOYD Xylazine
    BioLite Stand Braintree Scientific RIS100 For mice
    BioLite Intubation Illumination System Braintree Scientific BIO MI-KIT For mice
    22 G, 1 inch i.v. catheter Terumo SR-OX2225CA For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used.
    20 G, 1 inch i.v. catheter Terumo SR-OX2025CA For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used.

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    References

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