Nichtinvasive Intratracheale Intubation, die Pathologie und Physiologie der Maus Lung Study

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Summary

Die Verwendung eines Modells, das den Zustand von Lungenerkrankungen in Menschen nachahmt, ist für die Untersuchung der Pathophysiologie und / oder Ätiologie von bestimmten Krankheiten und für die Entwicklung von therapeutischen Eingriff. Hier eine nicht-invasive Methode, die intratracheale Intubation direkt liefern kann exogene Materialien Maus Lunge wird vorgestellt.

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Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung. J. Vis. Exp. (81), e50601, doi:10.3791/50601 (2013).

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Abstract

Die Verwendung eines Modells, das den Zustand von Lungenerkrankungen in Menschen nachahmt, ist für die Untersuchung der Pathophysiologie und / oder Ätiologie von bestimmten Krankheiten und für die Entwicklung von therapeutischen Eingriff. Mit der zunehmenden Verfügbarkeit von Knockout und transgenen Derivate, zusammen mit einer großen Menge an genetischer Information, Mäuse bieten eine der besten Modelle, um die molekularen Mechanismen, die Pathologie und Physiologie der Lungenerkrankungen zugrunde liegenden studieren. Inhalation, intranasale Instillation, intratrachealer Instillation und intratracheale Intubation sind die am häufigsten verwendeten Techniken, die von einer Reihe von Forschern auf Materialien von Interesse Mauslungen verabreichen. Es gibt Vor-und Nachteile für jede Technik je nach den Zielen einer Studie. Hier eine nicht-invasive Methode, die intratracheale Intubation direkt liefern kann exogene Materialien Maus Lunge wird vorgestellt. Diese Technik wurde angewandt, um Bleomycin Maus Lunge als Modell zur Lungenfibrose untersuchen zu verwalten. </ P>

Introduction

Lung ist ein Organ, in dem viele verheerendsten Krankheiten werden häufig diagnostiziert. Unter ihnen ist Lungenkrebs die zweithäufigste Krebserkrankung bei Männern und Frauen und die häufigste Todesursache durch Krebs. Chronisch obstruktive Lungenerkrankung, die auch als Emphysem und chronische Bronchitis bekannt, ist eine sehr ernste Erkrankung und die dritthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Im Jahr 2011 wurde geschätzt, dass 25,9 Millionen Amerikaner hatten Asthma, darunter 7,1 Millionen Kinder unter 18 Jahren. Asthma ist die dritthäufigste Ursache für Krankenhausaufenthalte von Kindern unter 15 Jahren (American Lung Association, http://www.lung.org ). Um die Pathophysiologie und / oder Ätiologie dieser verheerenden Krankheiten und ihre zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, ist die Verwendung von kritischen genaue Modelle in Verbindung mit praktischen und nicht-invasive Verabreichung von verschiedenen Materialien von Interesse Lunge. Mäuse bieten eine der besten Modelle aufuntersuchen die molekularen Mechanismen, die Pathologie und Physiologie der Lungenkrankheiten wegen der zunehmenden Verfügbarkeit von Knockout und transgenen Mäusen und eine große Menge an verfügbaren genetischen Informationen zugrunde liegen.

Verschiedene Verfahren sind durch eine Anzahl von Forschern in verschiedenen Einstellungen verwendet worden, um Materialien von Interesse Mäuselungen, einschließlich Inhalation, intranasale Instillation, intratrachealer Instillation und intratracheale Intubation 1-4 liefern. Das letztere Verfahren wurde nicht routinemäßig verwendet, weil es als eher schwierig durchzuführen. Hier beschriebenen Intratracheale Intubation ist eine nichtinvasive, einfache und schnelle Methode, um Materialien von Interesse Maus Lungen, um die Wirkung der gelieferten Materialien auf Genexpressionsmuster, Pathologie und / oder Physiologie der Lunge 5 studieren zu liefern. Diese Technik gewährleistet die Bereitstellung von exogenen Materialien, die gesamte Lunge und ist nicht mit einer Überlebens Operation und wird daher likely durch irgendwelche institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschüssen genehmigt werden.

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Protocol

Das folgende Protokoll beschreibt eine nicht-invasive, einfache und schnelle Methode, um Materialien von Interesse Mauslungen zu liefern. Dieses Verfahren wurde von der National Cancer Institute Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.

1. Anästhesie

  1. Zuerst betäuben die Maus mit einem Gemisch aus Ketamin und Xylazin (100 mg / kg Körpergewicht und 10 mg / kg Körpergewicht, jeweils). Dies ist die empfohlene ACUC Anästhesie und Dosis. Mit diesem Betrag sind Mäuse zumindest für ~ 20 min bewusstlos.
  2. Bewerben Tierarzt Salbe auf die Augen der Maus, um ein Austrocknen der Augen während der Narkose zu vermeiden.
  3. Nach einigen Minuten kneifen einen Fuß von der Maus, um für das Bewusstsein zu überprüfen. Nach der Bestätigung bewusstlos, legen Sie die Maus auf eine Intubation Stand auf ~ 60 ° abgewinkelt und halten Sie sie durch Einhaken seine oberen Schneidezähne in einem kleinen Gummiband an der Spitze der Stand entfernt.

2. Intratracheale Intubation

  • Der Maus die Zunge vorsichtig zurückziehen, um eine Seite mit einem Q-Tip.
  • Bei Verwendung der BioLite Intubation Lichtanlage, sorgfältig legen Sie die Intubation System, bis der Kehlkopf wird mit Hilfe der faseroptischen Lichtleiter visualisiert.
  • Sobald der Kehldeckel und die Stellknorpel visualisiert werden, legen Sie die Faser über dem Kehldeckel und zwischen den Stellknorpel und vorab, bis die richtige Länge der Katheter eingeführt worden ist.
  • Hinweis: Um die richtige Länge der Katheter eingeführt werden erhalten, zunächst die Länge zwischen der Mündung und der Bronchien Bifurkationspunkt messen mit Hilfe eines Maus-Praxis von ähnlicher Größe im Voraus (Abbildung 1). Die Länge hängt weitgehend von der Größe der Maus. Einführen des Katheters sollte über dem Verzweigungspunkt zu stoppen (~ 1,5 cm für Maus mit ~ 25 g Körpergewicht). Dies stellt sicher, dass die intubiert Material wird allen Lappen gehen. Mindestens 50 Praxis micE kann für eine Person, die die Intubation Kenntnisse in der Technik benötigt werden (Kompetente bedeutet, dass die Erfolgsrate der Intubation ist mehr als 95%).

    1. Sobald der Katheter eingeführt wird, schnell zu entfernen, die Glasfaser-Lichtleiter aus dem Katheter, damit das Tier, normal zu atmen. Wenn die Intubation Illumination System nicht verwendet wird, direkt einen Katheter, wie beschrieben.
    2. In einer Lösung, die Materialien von Interesse mit einem Katheter. Stellen Sie sicher, daß die Lösung unmittelbar nach der Zugabe in die Lunge eingesaugt. Fünfzig Mikroliter für ~ 25 g Körpergewicht der Maus wird routinemäßig eingesetzt.

    3. Tierrettung

    1. Sobald die Lösung in die Lunge gesaugt wird, nehmen Sie die Maus aus dem Stand, und steckte es wieder in die ursprüngliche Käfig.
    2. Beachten Sie die Maus, bis es beginnt sich zu bewegen.
    3. Nach der Bestätigung, dass die Maus in gutem Zustand ist, bringen Sie den Käfig auf einem Rack.

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    Representative Results

    Zunächst wurde grün gefärbt Lösung verwendet, um Mäuse für die Praxis zu intubieren. Die Lunge wurde unmittelbar nach Intubation reseziert zu prüfen, wie gleichmäßig die Farbe wurde in der Lunge (Fig. 2) verteilt. Diese Technik wurde angewandt, um Bleomycin-induzierten Lungenfibrose Studie mit C57BL / 6 Mäusen. Wenn die Mäuse wurden intratracheal mit 1,2 U / kg von Bleomycin oder Kochsalzlösung als Kontrolle und seziert nach 3 Wochen intubiert, entwickelt die Mäuse Bleomycin-induzierten Lungenfibrose in ihrem gesamten, durch Histologie und der erhöhte Gehalt an Hydroxyprolin (Fig. 3) unterstützt. Die beschädigte Fläche wurde mit 20X Ziel erstellt Lungen Bilder und ein 121-Punkte-Gitter Gitter ausgewertet. Die Zahl der Schnittpunkte (Punkte) in den Bereichen Faser fallen wurden gezählt und als Prozentsatz der insgesamt (121) Punkten ausgedrückt. Der Prozentsatz der so gezählten die beschädigten Bereiche war proportional zu der Menge an Bleomycin verabreicht (Abbildung 4).

    "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "always"> Figur 1
    Abbildung 1. Illustration von Maus-Luftröhre. Die roten Balken und Pfeile geben die Länge, wo die Messung sollte vor Intubation mit einem Praxis-Maus genommen werden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

    Figur 2
    2. Aussehen der Lungen rechts, nachdem er mit grünen Farbstoff intubiert. Wenn der Farbstoff Farbe kann in den meisten Teilen der Lunge erkennen ist, ist die Intubation als erfolgreich.ad/50601/50601fig2highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

    Fig. 3
    3. Repräsentative Bilder von fibrotischen Lungen durch intratracheale Intubation Bleomycin induziert. C57BL / 6 Mäuse wurden mit 1.2U/kg von Bleomycin (B, D) oder Kochsalzlösung als Kontrolle (A, C) und ihre Lungen histologisch am Tag 21 nach der Bleomycin Verwaltung geprüft intubiert. Vergrößerung: A, B: 40-fach, C, D: 100X. (E) Hydroxyprolingehalt pro Lunge gemessen am Tag 21 für die Steuerung und Bleomycin behandelten Lunge. N = 6, ***:. P <0,001 Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .


    Abbildung 4. Beziehung zwischen Dosis und Bleomycin beschädigten Bereich der Lunge. Erhöhte Dosis von Bleomycin (0,5, 1 und 2 U / kg) proportional erhöht den Anteil der beschädigten Bereiche. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

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    Discussion

    Hier beschriebenen Intratracheale Intubation ist eine einfache, aber hervorragende nicht-invasive Methode, um gleichmäßig zu liefern Materialien von Interesse Mauslunge. Dieses Verfahren erlaubt die Untersuchung der Wirkung und / oder die Rolle des Materials auf die Physiologie und / oder der Pathologie der Lunge verabreicht. Die verabreichten Materialien können endogene Moleküle wie Zytokine oder exogene Materialien wie xenobiotischen Chemikalien / Arzneimittel, Karzinogene, Schadstoffen, Allergenen oder Viren, die in verschiedenen Lungenerkrankungen, die ein Modell für die Untersuchung verschiedener menschlicher Krankheiten 6-10 darstellen kann Folge sein. Diese Technik kann auch in Verbindung mit rekombinantem Adenovirus oder Lentivirus zur Einführung Expression oder Deletion von Genen von Interesse in Epithelzellen der Atemwege, um die Rolle dieser Gene bei der Homöostase, Physiologie, Pathologie und / oder Krebslungen untersuchen. Die Unterbrechung eines Gens kann durch Cre-Rekombinase transient in Epithelzellen, eine floxed Gen in stören erreicht werdenInteresse in den Epithelzellen 11.

    Ein Katheter kann leicht versehentlich in die Speiseröhre, die Luftröhre eingeführt werden, gegenübergestellt wird. In dem hier beschriebenen Verfahren liefert die Intubation Beleuchtungssystem Führung in die richtige Position, wo der Katheter eingesetzt werden soll 5. Das System besteht aus einem faseroptischen Faser, die stabil mit einer Lichtquelle verbunden ist, und einem speziell entwickelten Miniaturlinsenoptik, die das Licht auf die Lichtwellenleiter-Faser zu konzentrieren. Das Abgabeende der faseroptischen Faser passt in die Wegwerf intravenöse Katheter, die als intratracheale Röhren verwendet werden. Dieses System bietet eine direkte Beleuchtung des Mund-Rachenraum, so dass klare Visualisierung des Kehlkopfes während der Intubation. Sobald man wird kompetent bei der Durchführung dieser Technik mit dem Beleuchtungssystem ist die Verwendung des Systems nicht mehr notwendig. Das Verfahren kann effizient mit nur einem Katheter durchgeführt werden, und die ganze pERFAHREN erfordert nur wenige Minuten. Das gleiche Verfahren kann für Ratten, die mit einer größeren Abmessungen Illumination System oder Katheter verwendet werden.

    Drei Punkte sind entscheidend für die gleichmäßige Verteilung des Materials in der gesamten Lunge. Zuerst immer die Länge zwischen der Mündung und der Bronchien Verzweigungspunkt vor der Intubation zu messen, um eine Vorstellung davon, wie tief der Katheter sollte mit einem Praxis-Maus (Abbildung 1) eingesetzt werden müssen. Da dies hängt weitgehend von der Größe der Maus kann die gleiche Einbaulänge verwendet, sobald es für Mäuse mit einer bestimmten Größe bestimmt werden. Zweitens stellen Sie sicher, dass die Lösung für die Intubationstubus direkt nach seiner Zugabe gesaugt aufgenommen. Wenn der Intubationstubus versehentlich in die Speiseröhre eingeführt wird, wird die Lösung nicht unmittelbar angesaugt werden und damit in der Röhre zu bleiben. Wenn dies geschieht, wiederholen Sie den gesamten Prozess der Intubation. Dieser Bestätigungsprozeß stellt sicher, daß die Lösung in die Luftröhre, aber nicht in derÖsophagus. Der Bediener kann 3x mit maximaler versuchen, die gesamte Intubation zu wiederholen, wenn die Lösung nicht in die Lunge eingesaugt. Allerdings, wenn dies häufig der Fall ist, empfiehlt es sich, zurück in die Praxis gehen, um höhere Erfolgsquote zu erwerben. Schließlich sollte Mäusen während der Intubation bewusstlos zu sein, die sicherstellt, dass die Maus nicht ausspucken, was intubiert wurde. In diesem Sinne ist die Verwendung von Isofluran mit einem Nasenkonus, die auch physikalisch mit Intubation stört nicht empfohlen.

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    Disclosures

    Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

    Acknowledgements

    Diese Arbeit wurde durch die Interne Research Program des National Cancer Institute, Center for Cancer Research unterstützt.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    KetaVed Vedco Ketamine
    AnaSed Injection 20 mg LLOYD Xylazine
    BioLite Stand Braintree Scientific RIS100 For mice
    BioLite Intubation Illumination System Braintree Scientific BIO MI-KIT For mice
    22 G, 1 inch i.v. catheter Terumo SR-OX2225CA For mice below 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used.
    20 G, 1 inch i.v. catheter Terumo SR-OX2025CA For mice over 30 g. Catheter is used only for the case where the Intubation Illumination System is not used.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    3. Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry. J. Vis. Exp. (51), e2702 (2011).
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    11. Winslow, M. M., et al. Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1. Nature. 473, 101-104 (2011).

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